Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Luận văn được thực hiện với hai mục tiêu: Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat trong huyết tương người và phân tích bằng HPLC để định lượng paraquat; xác định giá trị sử dụng của phương pháp và áp dụng định lượng paraquat trong huyết tương bệnh nhân ngộ độc paraquat tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội.

 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN =======   VŨ ANH PHƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học:   PGS.TS. TẠ THỊ THẢO TS. HÀ TRẦN HƯNG HÀ NỘI ­ 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm  ơn sâu sắc tới PGS.TS Tạ  Thị  Thảo và  TS. Hà Trần  Hưng đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực hiện đề  tài và viết luận văn Tơi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo và tồn thể nhân viên Trung tâm   Chống Độc – Bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi được học tập và nghiên  cứu Tơi xin bày tỏ  lòng biết ơn tới các thầy cơ giáo giảng dạy tại khoa Hố, đặc biệt là các   thầy cơ trong bộ mơn Hố Phân tích, đã cho tơi những kiến thức q giá trong q trình học tập   và thực hiện đề tài này.  Tơi cũng xin gửi lời cảm  ơn các anh chị, bạn bè của tập thể  lớp cao học hố K24, đặc   biệt là những người bạn trong nhóm hố phân tích K24 đã giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn trong   suốt q trình tơi học tập và thực hiện đề tài này.  Cuối cùng tơi xin gửi lời cảm  ơn tới gia đình và bạn bè đã ln động viên, chia sẻ  mọi   khó khăn cùng tơi Hà Nội, ngày 01 tháng 10  năm 2015 Học viên Vũ Anh Phương MỤC LỤC DANH SACH BANG BIÊU ́ ̉ ̉ DANH SACH HINH ́ ̀ Chương 1 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt % RSD % RSDR ACN AS ATP BN DAD DQ EPQ GC ­ MS HP HPLC LC ­ MS LOD LOQ MeOH ppm PQ R ROC RP­HPLC SD SIPP TCA tR UV­VIS Tên tiếng anh % Relative standard deviation % Reproducibility standard deviation Acetonitrile Asymmetry factor Adenosin Triphophate Patient diode­array detector Diquat Ethylparaquat Gas chromatography ­ Mass  spectroscopy Hemoperfusion High performance liquid  Chromatography Liquid Chromatography ­ Mass  Spectroscopy Limit of Detection Limit of Quantification Methanol Parts per million Paraquat Relative  coefficient Receiver operating characteristics Reverse phase­HPLC Standard deviation Severity Index of Paraquat Poisoning Trichloroacetic acid Retention time Ultraviolet­Visible Tên Tiếng việt % Độ lệch chuẩn tương đối %   Độ   lệch   chuẩn   tái   lặp  tương đối Acetonitril Hệ số đối xứng pic Adenosin Triphophat Bệnh nhân detector mảng diode Diquat Ethylparaquat Sắc ký khí khối phổ Lọc máu hấp phụ Sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng khối phổ Giới hạn phát hiện Giới hạn định lượng Methanol Phần triệu Paraquat Hệ số tương quan Đường cong ROC Sắc ký lỏng pha đảo Độ lệch chuẩn Chỉ số độ nặng của ngộ độc  Paraquat Acid Tricloacetic  Thời gian lưu Tử ngoại và khả kiến ĐẶT VẤN ĐỀ Paraquat (viêt tăt cua  ́ ́ ̉ paraquaternary bipyridyl) la môt thuôc diêt co ̀ ̣ ́ ̣ ̉  gia thành re, ́ ̉  hiệu quả  diêt co dai nhanh chong ̣ ̉ ̣ ́ , ít ảnh hưởng tới mơi trường do đó hiện đang được sử dụng rộng rãi ở  Việt Nam với nhiều tên thương mại khác nhau. Tuy nhiên, paraquat (PQ) lại la mơt chât hoa hoc ̀ ̣ ́ ́ ̣   vô cung đôc v ̀ ̣ ới ngươi. Li ̀ ều tử vong của PQ  ước tính là khoảng 10 ml dung dịch 20%. Tai nhi ̣ ều  nước phát triển, PQ đa bi câm s ̃ ̣ ́ ử dung nh ̣ ưng ở Viêt Nam viêc thi ̣ ̣ ếu các chính sách và biện pháp quan̉   ly s ́ ử dung hoa chât nay nên trong nh ̣ ́ ́ ̀ ững năm vừa qua co rât nhiêu tr ́ ́ ̀ ương h ̀ ợp ngô đôc  ̣ ̣ PQ đên c ́ ấp  cứu [1]. Trên thế giới, nhiêu ca t ̀ ử vong do ngộ đôc PQ đa đ ̣ ̃ ược bao cao [10][19][27]. T ́ ́ ại Trung tâm   Chống độc bệnh viện Bạch Mai, trong những năm gần đây, số lượng bệnh nhân ngộ độc PQ không  ngừng gia tăng và trở thành một vấn nạn vô cùng nghiêm trọng, vượt ngưỡng 300 ca trong năm 2013   và năm 2014 lên tới 391 ca. Ti lê t ̉ ̣ ử vong do ngô đôc PQ rât cao, th ̣ ̣ ́ ường khoảng 70­80% theo nhiêù   nghiên cứu cua cac tac gia n ̉ ́ ́ ̉ ươc ngoai [29][32]. Tai Trung tâm ch ́ ̀ ̣ ống độc (TTCĐ) bênh viên Bach ̣ ̣ ̣   Mai, ti lê t ̉ ̣ ử vong năm 2007 la 72,5% [ ̀ 4], năm 2011 là 72,9% [2], nghiên cứu tai bênh viên Ch ̣ ̣ ̣ ợ Râỹ   thành phố Hồ Chí Minh la 85%.  ̀ Trong chẩn đốn và điều trị  ngộ  độc cấp PQ, xét nghiệm định lượng   PQ  trong huyết  tương đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ  nặng của ngộ  độc, tiên lượng  bệnh nhân cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị, đặc biệt là lọc máu hấp phụ.  Tỷ lệ tử vong do ngộ độc cấp PQ rất cao  vì thiếu các biện pháp điều trị hiệu quả. Gần đây, các   nghiên cứu của nhiều tác giả  nước ngồi và một số tác giả  Việt Nam cho thấy các kĩ thuật lọc   máu mới, nhất là lọc máu hấp phụ bằng cột than hoạt hoặc cột resin nhằm tăng cường đào thải  PQ cho kết quả khả quan, cứu sống một số khơng nhỏ bệnh nhân ngộ độc cấp PQ. Xét nghiệm   định lượng nồng độ PQ huyết tương cung cấp cơng cụ quan trọng để đánh giá hiệu quả của các   biện pháp điều trị tăng thải trừ này.  Tuy nhiên, cho đến nay tại Việt Nam việc xét nghiệm PQ chỉ  dừng  ở mức độ  định tính  trong nước tiểu bằng phương pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc PQ mà chưa có cơ sở  xét nghiệm nào có thể  thực hiện việc định lượng nồng độ  PQ máu với kết quả  đáng tin cậy.  Điều này dẫn đến một khoảng trống lớn trong chẩn đốn, tiên lượng cũng như  đánh giá hiệu   của các biện pháp lọc máu làm cho việc điều trị  ngộ  độc  PQ tại Trung tâm Chống độc và  các khoa hồi sức cấp cứu trên cả nước gặp rất nhiều khó khăn.  Để  định lượng PQ trong huyết tương trên thế  giới đã áp dụng các phương pháp sắc ký  khí khối phổ (GC­MS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LC­MS)  Tại Trung tâm  chống độc bệnh viện Bạch Mai  hiện  đang sử  dụng máy  sắc ký lỏng hiệu năng cao  để  xét  nghiệm độc chất nhưng cũng chưa có quy trình chuẩn định lượng  PQ  huyết tương. Vì vậy,  chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề  tài  “Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết  tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với hai mục tiêu:  Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat trong huyết tương người và phân   tích bằng HPLC để định lượng paraquat Xác định giá trị sử dụng của phương pháp và áp dụng định lượng paraquat trong huyết   tương bệnh nhân ngộ độc paraquat tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai, Hà   Nội CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tông quan vê paraquat  ̉ ̀ 1.1.1. Công thức paraquat  Paraquat là từ  viết tắt của paraquaternary bipyridyl, tên khoa học là 1,1'­dimethyl­4,4'  bipyridilium là thuốc diệt cỏ  phổ  biến nh ất hi ện nay do đặc tính diệt cỏ  nhanh và triệt để.  PQ thuộc nhóm hợp chất amonium bậc 4 bipyridylium,  đượ c tổng hợp  đầu tiên vào năm   1882, ứng dụng trong nơng nghiệp làm thuốc trừ cỏ từ những năm 1950 [42].  PQ có khối lượng phân tử tương đối 186,2 có cơng thức hóa học như hình 1.1:  Hình 1.: Cơng thức hóa học của paraquat 1.1.2. Tính chất lý, hóa học của paraquat  PQ thường có màu trắng hơi vàng, khơng mùi, tỷ  trọng   20oC là 1,240 ­ 1,260, điểm  chảy 175 ­ 180oC, điểm sơi khoảng 300oC và pH của dung dịch PQ trong nước 6,5 ­ 7,5 PQ   thường   ở   dạng  dimethylsulphate     dichloride  Dạng  dichloride   tinh  thể   trắng,   dạng dimethylsulphate chảy rữa. PQ  ổn định trong dung dịch mơi trường acid hoặc trung tính và   khơng ổn định trong mơi trường kiềm.  PQ tan tốt trong nước (độ tan 700 g/l ở 20oC), ít tan trong cồn và hầu như khơng tan trong  các dung mơi hữu cơ khác.  PQ bị phân hủy dưới ánh sáng UV, bị bất hoạt bởi các tác nhân hoạt động bề mặt anionic  và bởi đất sét, bị mất hoạt tính nhanh khi tiếp xúc với  đất. PQ khơng bay hơi. Dung dịch PQ đặc   ăn mòn thép, tấm thiếc, sắt mạ kẽm và nhơm [43] PQ  được sản xuất bởi nhiều cơng ty khác nhau vơi cac tên th ́ ́ ương mai và hàm l ̣ ượng  khác nhau, nói chung thường đều   dạng dung dịch màu xanh. Một số  tên gọi thường gặp của   PQ như: Gramoxone, Gfaxone, Hegaxone, Tungmaxone, Owen  [42] Do độc tính gây tử vong rất cao nên hầu hết các nước phát triển đều đã cấm sử dụng PQ   là một loại hóa chất bảo vệ  thực vật (Mỹ và các nước Châu Âu). Một số  nước như  Nhật   Bản chỉ  cho phép lưu hành  PQ  dạng dung dịch với hàm lượng thấp 4,5% sẽ  giúp giảm thiểu   nguy cơ nếu bị ngộ độc. Thực tế hiện nay trên thế giới vẫn có gần 130 nước cho phép sử dụng   PQ trong đó có Việt Nam [42]. Hiện ở Việt Nam thuốc từ cỏ PQ được lưu hành dạng dung dịch   20% do đó nguy cơ ngộ độc cấp tính rất lớn Một điều đáng nói là cơng ty sản xuất  PQ lớn nhất trên thế giới hiện nay là Syngenta hay  còn gọi là Zeneca đặt nhà máy tại Trung Quốc và Anh. Trên đất nước họ đã cấm hồn tồn  PQ,  hoạt động kinh doanh chủ yếu xuất khẩu sang các nước thứ ba [39] 1.1.3. Cơ chế gây độc của paraquat   Cơ chế gấy độc của PQ được mơ tả theo sơ đồ sau [37]: Hình 1  Cơ chế gây độc của paraquat [15] Trong giai đoạn đầu của chu trình này, ion PQ2+ cùng với NADPH trải qua một phản  ứng   tạo ra ion paraquat bị khử (PQ+) và NADP+. PQ+ phản ứng hầu như ngay lập tức với oxy tái tạo  lại PQ2+ và gốc superoxid. Có sẵn NADPH và oxy, chu trình oxy hố ­ khử  của PQ xảy ra liên  tục,  với  việc NADPH  liên tục  bị  mất   và khơng ngừng tạo ra gốc superoxid. Gốc tự  do   superoxid sau đó phản ứng với bản thân nó để tạo ra peroxid hydro (H 2O2), và với H2O2 cùng Fe  để tạo thành gốc tự  do hydroxyl [18] [31]. Cạn kiệt NADPH dẫn tới chết tế bào. Chu trình oxy   hố ­ khử tạo thành gốc tự do hydroxyl dẫn tới nhiều cơ chế làm tổn thương tế  bào: phản ứng  với lipid trên màng tế bào (peroxide hố lipid), DNA và các protein tối cần thiết cho tế bào sống  sót cũng bị các gốc tự do hydroxyl phá hủy [12] [39] [40] Hậu quả lên tế bào do việc hình thành các gốc tự do (superoxid và các gốc tự do khác) là   đối tượng của rất nhiều nghiên cứu. Các thử nghiệm điều trị nhằm vào việc thay đổi các gốc tự  do bằng các chất như desferioxamin, superoxid dismutase, α­tocopherol và vitamin C cùng với bài  niệu cưỡng bức. Tuy nhiên, cho đến hiện nay khơng có chất nào trong số này được khuyến cáo   dùng Mặc dù chi tiết đầy đủ về độc chất học của các gốc tự do do PQ sinh ra vẫn chưa được  biết nhưng những gì người ta đã biết về cơ sở để ngộ độc là sự tương tác giữa PQ, NADPH và   oxy. Sau đó,   mức độ  tế  bào, oxy là yếu tố  tối cần thiết cho việc hình thành bệnh lý do PQ   Đây là cơ sở cho việc hạn chế cung cấp oxy trong việc điều trị ban đầu bệnh nhân ngộ độc PQ PQ có tính ăn mòn và gây tổn thương giống như  kiềm khi tiếp xúc với da, mắt và các  niêm mạc. Các cơ  quan đích chủ  yếu trong ngộ  độc tồn thân PQ là đường tiêu hố, thận và   phổi. Dạ dày, ruột bị tổn thương nặng nề do tác dụng ăn mòn trực tiếp khi bệnh nhân uống PQ   có chủ ý với nồng độ cao. Thận là cơ quan đào thải PQ và DQ và có nồng độ bipyridyl cao hơn   so với các cơ quan khác. Riêng ở phổi, PQ vào các phế bào týp I và II khơng phụ thuộc bậc thang  nồng độ mà theo cơ chế vận chuyển tích cực phụ thuộc ATP Do vậy PQ gây tổn thương hầu hết tất cả các cơ  quan trong cơ thể  vì đều có liên quan   đến chuyển hóa và hơ hấp tế bào, tuy nhiên tại các vị trí hấp phụ nhiều PQ hoặc liên quan đến   thải trừ PQ thì tổn thương đến sớm hơn, nặng hơn và cũng là ngun nhân hàng đầu gây tử vong   như tổn thương phổi gây suy hơ hấp, suy thận, viêm gan, lt niêm mạc đường tiêu hóa và biến   chứng nhiễm trùng [6][13][37]. Viêc tiêp xuc v ̣ ́ ́ ơi l ́ ượng PQ it h ́ ơn se lam châm nguy c ̃ ̀ ̣ ơ tử  vong   do xơ phôi tiên triên va suy thân [33]. Môt sô nghiên c ̉ ́ ̉ ̀ ̣ ̣ ́ ứu gân đây còn cho thây ph ̀ ́ ơi nhiêm PQ co ̃ ́  liên quan với hơi ch ̣ ưng Parkinson [21][23] ́ Trong ngô đôc câp PQ, co thê tiên l ̣ ̣ ́ ́ ̉ ượng bênh d ̣ ựa trên nông đô PQ trong huyêt t ̀ ̣ ́ ương. Môṭ   sô bao cao cho thây nông đô PQ huyêt t ́ ́ ́ ́ ̀ ̣ ́ ương vượt qua 2 µg/ml thi hâu hêt t ̀ ̀ ́ ử vong, tuy nhiên mơṭ   vai tr ̀ ương h ̀ ợp bênh nhân vân hôi phuc khi nông đô trong mau cao h ̣ ̃ ̀ ̣ ̀ ̣ ́ ơn 2 µg/ml [7][10][22] 1.1.4. Dược động học paraquat 1.1.4.1. Hấp thu Ở đường tiêu hố PQ được hấp thu rất nhanh nhưng ít (5­10%). Hấp thu chủ yếu ở ruột  non. Khi dạ  dày ruột bị  tổn thương lan rộng, số lượng chất độc được hấp thu sẽ  tăng lên. PQ   khơng gắn với protein huyết tương. Nồng độ  đỉnh của PQ trong huyết tương đạt được trong   vòng 2 giờ sau uống [6] [37]. Tiếp xúc qua da, hấp thu vào cơ thể nói chung chỉ xảy ra khi tiếp   xúc kéo dài hoặc da bị tổn thương. Tiếp xúc với PQ qua đường hơ hấp khơng làm cho lượng PQ   được hấp thu đến mức đủ  để  gây nhiễm độc. Bởi vì kích thước các hạt chứa PQ lớn (hầu hết  trên 100  m) làm cho PQ khơng đi sâu được xuống đường hơ hấp để hấp thu [11]. Mắt tiếp xúc   với PQ sẽ bị tổn thương, nhưng khơng đủ để gây nhiễm độc tồn thân 10 2,00 2,01 2,00 Từ  các kết quả trên, sử dụng phần mềm minitab 16, chúng tơi thu được bảng dữ  kiện thống kê như bảng 3.20 Bảng 3.: Các dữ kiện thống kê đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích tiến hành bởi ba  KTV khác nhau Đại lượng đánh giá KTV­1 KTV­2 KTV­3 Xtb 1,99 1,98 1,99 Độ lệch chuẩn lặp lại (SD) 0,01 0,02 0,01 Độ lệch chuẩn lặp lại tương đối (% RSD) 0,45 0,75 0,65 ­0,35 ­0,55 ­0,20 0,000081 0,000225 0,000169 Sai số tương đối (ER) (%)  (so với giá trị trong mẫu chuẩn) Phương sai Như  vậy, căn cứ  vào các giá trị  % RSD của mỗi KTV có thể  kết luận, đối với   phép định lượng PQ, độ  chụm (hay độ  lặp lại) của KTV­1 là tốt nhất và của KTV­2 là   kém nhất. Tuy nhiên, các giá trị  RSD là nhỏ (