Luận văn được thực hiện với hai mục tiêu: Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat trong huyết tương người và phân tích bằng HPLC để định lượng paraquat; xác định giá trị sử dụng của phương pháp và áp dụng định lượng paraquat trong huyết tương bệnh nhân ngộ độc paraquat tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ======= VŨ ANH PHƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. TẠ THỊ THẢO TS. HÀ TRẦN HƯNG HÀ NỘI 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Tạ Thị Thảo và TS. Hà Trần Hưng đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực hiện đề tài và viết luận văn Tơi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo và tồn thể nhân viên Trung tâm Chống Độc – Bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi được học tập và nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cơ giáo giảng dạy tại khoa Hố, đặc biệt là các thầy cơ trong bộ mơn Hố Phân tích, đã cho tơi những kiến thức q giá trong q trình học tập và thực hiện đề tài này. Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học hố K24, đặc biệt là những người bạn trong nhóm hố phân tích K24 đã giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn trong suốt q trình tơi học tập và thực hiện đề tài này. Cuối cùng tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã ln động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tơi Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2015 Học viên Vũ Anh Phương MỤC LỤC DANH SACH BANG BIÊU ́ ̉ ̉ DANH SACH HINH ́ ̀ Chương 1 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt % RSD % RSDR ACN AS ATP BN DAD DQ EPQ GC MS HP HPLC LC MS LOD LOQ MeOH ppm PQ R ROC RPHPLC SD SIPP TCA tR UVVIS Tên tiếng anh % Relative standard deviation % Reproducibility standard deviation Acetonitrile Asymmetry factor Adenosin Triphophate Patient diodearray detector Diquat Ethylparaquat Gas chromatography Mass spectroscopy Hemoperfusion High performance liquid Chromatography Liquid Chromatography Mass Spectroscopy Limit of Detection Limit of Quantification Methanol Parts per million Paraquat Relative coefficient Receiver operating characteristics Reverse phaseHPLC Standard deviation Severity Index of Paraquat Poisoning Trichloroacetic acid Retention time UltravioletVisible Tên Tiếng việt % Độ lệch chuẩn tương đối % Độ lệch chuẩn tái lặp tương đối Acetonitril Hệ số đối xứng pic Adenosin Triphophat Bệnh nhân detector mảng diode Diquat Ethylparaquat Sắc ký khí khối phổ Lọc máu hấp phụ Sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng khối phổ Giới hạn phát hiện Giới hạn định lượng Methanol Phần triệu Paraquat Hệ số tương quan Đường cong ROC Sắc ký lỏng pha đảo Độ lệch chuẩn Chỉ số độ nặng của ngộ độc Paraquat Acid Tricloacetic Thời gian lưu Tử ngoại và khả kiến ĐẶT VẤN ĐỀ Paraquat (viêt tăt cua ́ ́ ̉ paraquaternary bipyridyl) la môt thuôc diêt co ̀ ̣ ́ ̣ ̉ gia thành re, ́ ̉ hiệu quả diêt co dai nhanh chong ̣ ̉ ̣ ́ , ít ảnh hưởng tới mơi trường do đó hiện đang được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam với nhiều tên thương mại khác nhau. Tuy nhiên, paraquat (PQ) lại la mơt chât hoa hoc ̀ ̣ ́ ́ ̣ vô cung đôc v ̀ ̣ ới ngươi. Li ̀ ều tử vong của PQ ước tính là khoảng 10 ml dung dịch 20%. Tai nhi ̣ ều nước phát triển, PQ đa bi câm s ̃ ̣ ́ ử dung nh ̣ ưng ở Viêt Nam viêc thi ̣ ̣ ếu các chính sách và biện pháp quan̉ ly s ́ ử dung hoa chât nay nên trong nh ̣ ́ ́ ̀ ững năm vừa qua co rât nhiêu tr ́ ́ ̀ ương h ̀ ợp ngô đôc ̣ ̣ PQ đên c ́ ấp cứu [1]. Trên thế giới, nhiêu ca t ̀ ử vong do ngộ đôc PQ đa đ ̣ ̃ ược bao cao [10][19][27]. T ́ ́ ại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai, trong những năm gần đây, số lượng bệnh nhân ngộ độc PQ không ngừng gia tăng và trở thành một vấn nạn vô cùng nghiêm trọng, vượt ngưỡng 300 ca trong năm 2013 và năm 2014 lên tới 391 ca. Ti lê t ̉ ̣ ử vong do ngô đôc PQ rât cao, th ̣ ̣ ́ ường khoảng 7080% theo nhiêù nghiên cứu cua cac tac gia n ̉ ́ ́ ̉ ươc ngoai [29][32]. Tai Trung tâm ch ́ ̀ ̣ ống độc (TTCĐ) bênh viên Bach ̣ ̣ ̣ Mai, ti lê t ̉ ̣ ử vong năm 2007 la 72,5% [ ̀ 4], năm 2011 là 72,9% [2], nghiên cứu tai bênh viên Ch ̣ ̣ ̣ ợ Râỹ thành phố Hồ Chí Minh la 85%. ̀ Trong chẩn đốn và điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định lượng PQ trong huyết tương đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng của ngộ độc, tiên lượng bệnh nhân cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị, đặc biệt là lọc máu hấp phụ. Tỷ lệ tử vong do ngộ độc cấp PQ rất cao vì thiếu các biện pháp điều trị hiệu quả. Gần đây, các nghiên cứu của nhiều tác giả nước ngồi và một số tác giả Việt Nam cho thấy các kĩ thuật lọc máu mới, nhất là lọc máu hấp phụ bằng cột than hoạt hoặc cột resin nhằm tăng cường đào thải PQ cho kết quả khả quan, cứu sống một số khơng nhỏ bệnh nhân ngộ độc cấp PQ. Xét nghiệm định lượng nồng độ PQ huyết tương cung cấp cơng cụ quan trọng để đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị tăng thải trừ này. Tuy nhiên, cho đến nay tại Việt Nam việc xét nghiệm PQ chỉ dừng ở mức độ định tính trong nước tiểu bằng phương pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc PQ mà chưa có cơ sở xét nghiệm nào có thể thực hiện việc định lượng nồng độ PQ máu với kết quả đáng tin cậy. Điều này dẫn đến một khoảng trống lớn trong chẩn đốn, tiên lượng cũng như đánh giá hiệu của các biện pháp lọc máu làm cho việc điều trị ngộ độc PQ tại Trung tâm Chống độc và các khoa hồi sức cấp cứu trên cả nước gặp rất nhiều khó khăn. Để định lượng PQ trong huyết tương trên thế giới đã áp dụng các phương pháp sắc ký khí khối phổ (GCMS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LCMS) Tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai hiện đang sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao để xét nghiệm độc chất nhưng cũng chưa có quy trình chuẩn định lượng PQ huyết tương. Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với hai mục tiêu: Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat trong huyết tương người và phân tích bằng HPLC để định lượng paraquat Xác định giá trị sử dụng của phương pháp và áp dụng định lượng paraquat trong huyết tương bệnh nhân ngộ độc paraquat tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tông quan vê paraquat ̉ ̀ 1.1.1. Công thức paraquat Paraquat là từ viết tắt của paraquaternary bipyridyl, tên khoa học là 1,1'dimethyl4,4' bipyridilium là thuốc diệt cỏ phổ biến nh ất hi ện nay do đặc tính diệt cỏ nhanh và triệt để. PQ thuộc nhóm hợp chất amonium bậc 4 bipyridylium, đượ c tổng hợp đầu tiên vào năm 1882, ứng dụng trong nơng nghiệp làm thuốc trừ cỏ từ những năm 1950 [42]. PQ có khối lượng phân tử tương đối 186,2 có cơng thức hóa học như hình 1.1: Hình 1.: Cơng thức hóa học của paraquat 1.1.2. Tính chất lý, hóa học của paraquat PQ thường có màu trắng hơi vàng, khơng mùi, tỷ trọng 20oC là 1,240 1,260, điểm chảy 175 180oC, điểm sơi khoảng 300oC và pH của dung dịch PQ trong nước 6,5 7,5 PQ thường ở dạng dimethylsulphate dichloride Dạng dichloride tinh thể trắng, dạng dimethylsulphate chảy rữa. PQ ổn định trong dung dịch mơi trường acid hoặc trung tính và khơng ổn định trong mơi trường kiềm. PQ tan tốt trong nước (độ tan 700 g/l ở 20oC), ít tan trong cồn và hầu như khơng tan trong các dung mơi hữu cơ khác. PQ bị phân hủy dưới ánh sáng UV, bị bất hoạt bởi các tác nhân hoạt động bề mặt anionic và bởi đất sét, bị mất hoạt tính nhanh khi tiếp xúc với đất. PQ khơng bay hơi. Dung dịch PQ đặc ăn mòn thép, tấm thiếc, sắt mạ kẽm và nhơm [43] PQ được sản xuất bởi nhiều cơng ty khác nhau vơi cac tên th ́ ́ ương mai và hàm l ̣ ượng khác nhau, nói chung thường đều dạng dung dịch màu xanh. Một số tên gọi thường gặp của PQ như: Gramoxone, Gfaxone, Hegaxone, Tungmaxone, Owen [42] Do độc tính gây tử vong rất cao nên hầu hết các nước phát triển đều đã cấm sử dụng PQ là một loại hóa chất bảo vệ thực vật (Mỹ và các nước Châu Âu). Một số nước như Nhật Bản chỉ cho phép lưu hành PQ dạng dung dịch với hàm lượng thấp 4,5% sẽ giúp giảm thiểu nguy cơ nếu bị ngộ độc. Thực tế hiện nay trên thế giới vẫn có gần 130 nước cho phép sử dụng PQ trong đó có Việt Nam [42]. Hiện ở Việt Nam thuốc từ cỏ PQ được lưu hành dạng dung dịch 20% do đó nguy cơ ngộ độc cấp tính rất lớn Một điều đáng nói là cơng ty sản xuất PQ lớn nhất trên thế giới hiện nay là Syngenta hay còn gọi là Zeneca đặt nhà máy tại Trung Quốc và Anh. Trên đất nước họ đã cấm hồn tồn PQ, hoạt động kinh doanh chủ yếu xuất khẩu sang các nước thứ ba [39] 1.1.3. Cơ chế gây độc của paraquat Cơ chế gấy độc của PQ được mơ tả theo sơ đồ sau [37]: Hình 1 Cơ chế gây độc của paraquat [15] Trong giai đoạn đầu của chu trình này, ion PQ2+ cùng với NADPH trải qua một phản ứng tạo ra ion paraquat bị khử (PQ+) và NADP+. PQ+ phản ứng hầu như ngay lập tức với oxy tái tạo lại PQ2+ và gốc superoxid. Có sẵn NADPH và oxy, chu trình oxy hố khử của PQ xảy ra liên tục, với việc NADPH liên tục bị mất và khơng ngừng tạo ra gốc superoxid. Gốc tự do superoxid sau đó phản ứng với bản thân nó để tạo ra peroxid hydro (H 2O2), và với H2O2 cùng Fe để tạo thành gốc tự do hydroxyl [18] [31]. Cạn kiệt NADPH dẫn tới chết tế bào. Chu trình oxy hố khử tạo thành gốc tự do hydroxyl dẫn tới nhiều cơ chế làm tổn thương tế bào: phản ứng với lipid trên màng tế bào (peroxide hố lipid), DNA và các protein tối cần thiết cho tế bào sống sót cũng bị các gốc tự do hydroxyl phá hủy [12] [39] [40] Hậu quả lên tế bào do việc hình thành các gốc tự do (superoxid và các gốc tự do khác) là đối tượng của rất nhiều nghiên cứu. Các thử nghiệm điều trị nhằm vào việc thay đổi các gốc tự do bằng các chất như desferioxamin, superoxid dismutase, αtocopherol và vitamin C cùng với bài niệu cưỡng bức. Tuy nhiên, cho đến hiện nay khơng có chất nào trong số này được khuyến cáo dùng Mặc dù chi tiết đầy đủ về độc chất học của các gốc tự do do PQ sinh ra vẫn chưa được biết nhưng những gì người ta đã biết về cơ sở để ngộ độc là sự tương tác giữa PQ, NADPH và oxy. Sau đó, mức độ tế bào, oxy là yếu tố tối cần thiết cho việc hình thành bệnh lý do PQ Đây là cơ sở cho việc hạn chế cung cấp oxy trong việc điều trị ban đầu bệnh nhân ngộ độc PQ PQ có tính ăn mòn và gây tổn thương giống như kiềm khi tiếp xúc với da, mắt và các niêm mạc. Các cơ quan đích chủ yếu trong ngộ độc tồn thân PQ là đường tiêu hố, thận và phổi. Dạ dày, ruột bị tổn thương nặng nề do tác dụng ăn mòn trực tiếp khi bệnh nhân uống PQ có chủ ý với nồng độ cao. Thận là cơ quan đào thải PQ và DQ và có nồng độ bipyridyl cao hơn so với các cơ quan khác. Riêng ở phổi, PQ vào các phế bào týp I và II khơng phụ thuộc bậc thang nồng độ mà theo cơ chế vận chuyển tích cực phụ thuộc ATP Do vậy PQ gây tổn thương hầu hết tất cả các cơ quan trong cơ thể vì đều có liên quan đến chuyển hóa và hơ hấp tế bào, tuy nhiên tại các vị trí hấp phụ nhiều PQ hoặc liên quan đến thải trừ PQ thì tổn thương đến sớm hơn, nặng hơn và cũng là ngun nhân hàng đầu gây tử vong như tổn thương phổi gây suy hơ hấp, suy thận, viêm gan, lt niêm mạc đường tiêu hóa và biến chứng nhiễm trùng [6][13][37]. Viêc tiêp xuc v ̣ ́ ́ ơi l ́ ượng PQ it h ́ ơn se lam châm nguy c ̃ ̀ ̣ ơ tử vong do xơ phôi tiên triên va suy thân [33]. Môt sô nghiên c ̉ ́ ̉ ̀ ̣ ̣ ́ ứu gân đây còn cho thây ph ̀ ́ ơi nhiêm PQ co ̃ ́ liên quan với hơi ch ̣ ưng Parkinson [21][23] ́ Trong ngô đôc câp PQ, co thê tiên l ̣ ̣ ́ ́ ̉ ượng bênh d ̣ ựa trên nông đô PQ trong huyêt t ̀ ̣ ́ ương. Môṭ sô bao cao cho thây nông đô PQ huyêt t ́ ́ ́ ́ ̀ ̣ ́ ương vượt qua 2 µg/ml thi hâu hêt t ̀ ̀ ́ ử vong, tuy nhiên mơṭ vai tr ̀ ương h ̀ ợp bênh nhân vân hôi phuc khi nông đô trong mau cao h ̣ ̃ ̀ ̣ ̀ ̣ ́ ơn 2 µg/ml [7][10][22] 1.1.4. Dược động học paraquat 1.1.4.1. Hấp thu Ở đường tiêu hố PQ được hấp thu rất nhanh nhưng ít (510%). Hấp thu chủ yếu ở ruột non. Khi dạ dày ruột bị tổn thương lan rộng, số lượng chất độc được hấp thu sẽ tăng lên. PQ khơng gắn với protein huyết tương. Nồng độ đỉnh của PQ trong huyết tương đạt được trong vòng 2 giờ sau uống [6] [37]. Tiếp xúc qua da, hấp thu vào cơ thể nói chung chỉ xảy ra khi tiếp xúc kéo dài hoặc da bị tổn thương. Tiếp xúc với PQ qua đường hơ hấp khơng làm cho lượng PQ được hấp thu đến mức đủ để gây nhiễm độc. Bởi vì kích thước các hạt chứa PQ lớn (hầu hết trên 100 m) làm cho PQ khơng đi sâu được xuống đường hơ hấp để hấp thu [11]. Mắt tiếp xúc với PQ sẽ bị tổn thương, nhưng khơng đủ để gây nhiễm độc tồn thân 10 2,00 2,01 2,00 Từ các kết quả trên, sử dụng phần mềm minitab 16, chúng tơi thu được bảng dữ kiện thống kê như bảng 3.20 Bảng 3.: Các dữ kiện thống kê đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích tiến hành bởi ba KTV khác nhau Đại lượng đánh giá KTV1 KTV2 KTV3 Xtb 1,99 1,98 1,99 Độ lệch chuẩn lặp lại (SD) 0,01 0,02 0,01 Độ lệch chuẩn lặp lại tương đối (% RSD) 0,45 0,75 0,65 0,35 0,55 0,20 0,000081 0,000225 0,000169 Sai số tương đối (ER) (%) (so với giá trị trong mẫu chuẩn) Phương sai Như vậy, căn cứ vào các giá trị % RSD của mỗi KTV có thể kết luận, đối với phép định lượng PQ, độ chụm (hay độ lặp lại) của KTV1 là tốt nhất và của KTV2 là kém nhất. Tuy nhiên, các giá trị RSD là nhỏ (