Mục tiêu nghiên cứu: Phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc thông qua xác định các vị trí đột biến liên quan kháng thuốc trên gen katG và rpoB bằng phương pháp giải trình tự và kỹ thuật multiplex real-time PCR.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Văn Bắc NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Nguyễn Văn Bắc NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh Hà Nội – 2010 Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc Lời cảm ơn! Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh, Trưởng phòng Cơng nghệ sinh học Mơi trường, Viện Cơng nghệ Sinh học – người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tơi trong thời gian thực tập và hồn thành khóa luận này Tơi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn Học viện Qn y cùng tập thể cán bộ phòng Cơng nghệ sinh học Mơi trường, Viện Cơng nghệ Sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm q báu cho tơi trong suốt thời gian thực tập và hồn thành khóa luận Qua đây, tơi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cơ giáo trong khoa Sinh học và các thầy cơ giáo trong bộ mơn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh, trường Đại học KHTN đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tơi trong suốt q trình học tập và nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin dành cho những người thân trong gia đình và bạn bè lòng biết ơn sâu sắc, những người thân u đã ln bên tơi, động viên và góp ý cho tơi trong suốt q trình học tập và hồn thành khóa luận Hà Nội, tháng 12 năm 2010 H ọc viên Nguyễn Văn Bắc Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Bp : Base pairs CNSH : Công nghê sinh hoc ̣ ̣ CTCLQG : Chương trinh chông lao quôc gia ̀ ́ ́ DNA : Acit deoxyribonucleic dNTPs : Deoxyribonucleotide Triphosphate EDR : Extensively drug resitant (Khang thuôc m ́ ́ ở rông) ̣ EMB : Ethambutol HRS : Ba loai thuôc isoniazid, rifampicin, streptomycin ̣ ́ HRSE : Bốn loai thuôc isoniazid, rifampicin, streptomycin và ethambutol ̣ ́ INH : Isoniazid IPTG : IsopropylthioβDgalactoside Kb : Kilo base LB : Luria Bertani MDR : Multidrugs resistant (Khang đa thuôc) ́ ́ PAS : Paraminosalicylic acid PAZ : Pyrazinamid PCR : Polymerase Chain Reaction RMP : Rifampicin RNA : Acid Ribonucleic RRDR : Rifampin resistance determining region (Vùng quyết định kháng rifampicin) Taq polymerase : Thermus aquaticus DNA polymerase TCYTTG : Tô ch ̉ ưc Y tê Thê gi ́ ́ ́ ới Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc V : Volume (thể tích) Xgal : 5bromo4chloro3indolylβDgalactopyranoside MỤC LỤC Kết quả phát hiện đột biến 61 Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc MỞ ĐẦU Bệnh lao và vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) đã được biết rõ từ một thế kỷ nay. Hiện nay tỷ lệ nhiễm lao được ước tính là 1/3 dân số thế giới, khoảng 9 triệu người mắc lao mới và hơn 3 triệu người chết do lao mỗi năm. Bệnh lao đang trở nên nghiêm trọng hơn với sự xuất hiện các chủng lao kháng đa thuốc (MultiDrugs Resistant MDR), tức là thể lao với vi khuẩn kháng ít nhất hai loại thuốc chống lao mạnh nhất là isoniazid (INH) và rifampicin (RMP). Theo số liệu thống kê chương trình chống lao Quốc gia năm 2007, giới có khoảng 511.000 trường hợp nhiễm lao kháng đa thuốc, trong đó có hơn 130.000 trường hợp tử vong. Do những khó khăn trong việc điều trị những bệnh nhân mang các chủng lao kháng thuốc phổ rộng và đa kháng mà việc phát hiện sớm các chủng lao kháng đa thuốc sẽ trở nên rất quan trọng trong điều trị bệnh lao Hiện nay nhiều nơi chẩn đốn vi khuẩn lao kháng thuốc vẫn dựa vào phương pháp ni cấy vi khuẩn và làm kháng sinh đồ là chủ yếu, tuy nhiên, việc ứng dụng sinh học phân tử cũng đang tạo ra những đột phá trong phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc. Cơ chế kháng thuốc vi khuẩn lao là do trong q trình tiến hóa, có nhiều đột biến xuất hiện trong một số gen chức năng, trước hết là gen rpoB và katG. Thời gian chẩn đốn có thể rút ngắn chỉ còn vài ngày, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện cho kiểm sốt bệnh lao dễ dàng hơn. Các nghiên cứu về sinh học phân tử trong chẩn đốn lao kháng thuốc đã chỉ ra rằng mỗi loại kháng thuốc là do xuất hiện các đột biến trên gen tương ứng chịu trách nhiệm. Chính vì vậy việc xác định các trường hợp nhiễm lao kháng thuốc thường đi kèm với những chẩn đốn phát hiện đột biến gen đối với các chủng lao phát hiện được. Các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid là do có liên quan tới đột biến tại codon 315 trên gen katG, đối Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc với các chủng kháng rifampicin do xuất hiện các đột biến ở một vùng nóng gồm 27 codon nằm gần trung tâm của gen rpoB. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử” Với mục tiêu nghiên cứu: phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc thơng qua xác định các vị trí đột biến liên quan kháng thuốc trên gen katG và rpoB bằng phương pháp giải trình tự và kỹ thuật multiplex realtime PCR Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tơi tiến hành một số nội dung nghiên cứu như sau: Xác định trình tự gen rpoB và katG Phân tích đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc phân lập tại Việt Nam trên cơ sở trình tự nucleotide của hai gen rpoB và katG Tối ưu hóa thành phần và chu trình bộ kit multiplex realtime PCR phát hiện nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1. BỆNH LAO Lao (Tuberculosis) là một bệnh truyền nhiễm mạn tính, là tình trạng nhiễm vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis, thường gặp nhất ở phổi nhưng cũng có thể ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương (lao màng não), hệ bạch huyết, hệ tuần hoàn (lao kê), xương và khớp. Bệnh lao gắn liền với sự phát triển của xã hội loài người từ hàng ngàn năm nay, trên thế giới chưa bao giờ và khơng một quốc gia nào, một khu vực nào, một dân tộc nào khơng có người mắc và chết vì bệnh lao. Trực khuẩn lao lần đầu tiên được bác sĩ Robert Koch đã phát hiện vào ngày 24/3/1882 Trong thời gian này ở Mỹ và châu Âu, cứ 7 người thì có 1 người chết vì lao, do vậy, phát hiện của Robert Koch là một bước ngoặt quan trọng trong việc khống chế và loại trừ căn bệnh này. Trước đây, lao được xem là một trong những căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên thế giới, lưu hành với tỷ lệ mắc bệnh khá cao, đặc biệt ở các nước thuộc châu Phi và khu vực châu Á, trong đó có Việt Nam Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên tồn cầu. Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và Philippines về số bệnh nhân lao, cũng như số bệnh nhân lao xuất hiện hằng năm. Hiện nay nguy cơ nhiễm lao ở nước ta hằng năm được ước tính là 1,5% dân số (ở các tỉnh phía Nam là 2%, các tỉnh phía Bắc là 1%). Trên thực tế chỉ số nguy cơ nhiễm lao hàng năm có thể cao hơn 1,5%, như vậy, các con số nêu trên còn có thể Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc lớn hơn. Điều đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với cơng tác phòng chống lao khơng những trong các năm tới mà có thể trong thời gian khá dài, có thể đến hàng chục năm, ngay cả khi ở thiên niên kỷ mới [3, 35] 1.2. TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC Bệnh lao ngày càng trở nên phức tạp và có ảnh hưởng nặng nề khi xuất hiện thêm vi khuẩn lao kháng thuốc tạo nên một dạng bệnh khó phòng chống. Các chủng lao kháng thuốc chia làm hai thể, lao kháng đa thuốc (Multidrugs resistant MDR) và lao kháng thuốc phổ rộng (Extensively drug resistant XDR), những chủng vi khuẩn lao kháng thuốc này là nguồn lây nhiễm và là mối đe dọa cho sức khỏe của cộng đồng. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), trên thế giới có khoảng 42 vạn người mắc lao kháng đa thuốc, chiếm số lượng lớn nhất là ở khu vực Tây Thái Bình Dương có 15 vạn trường hợp, kế đến là khu vực Đơng Nam Á và sau đó là khu vực Châu Phi và Đơng Âu. Một số chủng lao vừa kháng đa thuốc vừa kháng thuốc phổ rộng, có thể coi là loại siêu kháng thuốc [17]. Tình hình lao siêu kháng thuốc cũng ngày càng trở nên trầm trọng, do vậy từ tháng 11/2004 đến 11/2005, WHO và Trung tâm Kiểm sốt Bệnh Hoa Kỳ đã phân tích 17.890 mẫu đờm gửi từ 40 quốc gia trên tồn thế giới, và thấy rằng có 20% trường hợp là kháng đa thuốc và 2% trường hợp là kháng thuốc phổ rộng. Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Chương trình Chống lao Quốc gia thì có 32,5% các trường hợp bệnh lao mới mang vi khuẩn lao kháng thuốc [1, 3] Vi khuẩn lao kháng thuốc là một thách thức lớn, đe dọa cơng cuộc phòng chống lao trên tồn cầu, vì các thuốc chống lao có hiệu quả hiện nay đang bị vi khuẩn lao kháng lại nhất là kháng đa thuốc [10]. Thuốc chống lao có nhiều loại, tác dụng của mỗi thuốc trên trực khuẩn lao khơng giống nhau. Hiện nay người ta chia thuốc chống lao thành hai loại: (1) các thuốc chống lao chủ yếu (còn gọi là các Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc Cần nghiên cứu với số lượng chủng vi khuẩn lao lớn hơn để có thể đánh giá chính xác hơn tỷ lệ, vị trí, và tương quan kháng thuốc của các đột biến có thể xảy ra trên gen rpoB và katG Thử nghiệm qui trình multiplex realtime PCR phát hiện đồng thời 3 đột biến (katG315, rpoB526 rpoB531) để phát vi khuẩn lao kháng thuốc (isoniazid và rifampicin) cho các cơ sở khác để nâng cao hiệu quả chẩn đoán lao trong nước 64 Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Đức Anh (2001), Nghiên cứu sự đáp ứng miễn dịch trong một số thể bệnh lao, Luận án Tiến sĩ sinh học Nguyễn Đình Bảng (1992), Vi sinh vật y học, Nhà xuất bản Học viện Qn y Bộ Y tế, Trung tâm phòng chống lao quốc gia (2006), Báo cáo tổng kết chương trình chống lao quốc gia năm 2005, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội Nguyễn Thị Chính, Trương Thị Hòa (2005), Vi sinh vật y học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Văn Hưng (2001), Nghiên cứu số đặc điểm sinh học Mycobacterium tubeculosis phân lập tại Viện lao và Bệnh phổi, Luận án Tiến sỹ Y học Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng và điều trị, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội Phạm Hùng Vân (2009), PCR và realtime PCR, các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, Nhà xuất bản Y học, Thành phố Hồ Chí Minh Tiếng Anh Ahmad, S., Fares, E., Araj, G.F., Chugh, T.D., Mustafa, A.S. (2002), ”Prevalence of S315T mutation within the katG gene in isoniazidresistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Dubai and Beirut”, International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 6(10), pp. 920926 65 Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc 10 Ahmad, S., Mokaddas, E. (2009), “Recent advances in the diagnosis and treatment of multidrugresistant tuberculosis”, Respir Med, 103(12), pp. 17771790. 11 Ambur, O.H., Davidsen, T., Frye, S.A., Balasingham, S.V., Lagesen, K., Rognes, T., Tønjum, T (2009), “Genome dynamics in major bacterial pathogens”, FEMS Microbiol Rev, 33(3), pp. 453470 12 Ani, A.E (2008), “Advances in the laboratory diagnosis of Mycobacterium tuberculosis”, Ann Afr Med, 7(2), pp. 5761 13 Argekar, A.P., Kunjir, S.S., Purandare, K.S. (1996), “Simultaneous determination of rifampicin, isoniazid and pyrazinamid by high performance thin layer chromatography”, J. Pharm. Biomed. Anal., 14, pp. 16451650. 14 Asgharzadeh, M., Kafil, H.S. (2007), ”Current trends in molecular epidemiology studies of Mycobacterium tuberculosis”, Biotechnol. Mol. Biol. Rev., 2(5), pp. 108115. 15 Aslan, G., Tezcan, S., Serin, M.S., Emekdas, G. (2008), ”Genotypic analysis of isoniazid and rifampicin resistance in drugresistant clinical Mycobacterium tuberculosis complex isolates in southern Tukey”, Jpn. J. Infect. Dis., 61(4), pp. 25560 16 Bahrmand, A.R., Titov, L.P., Tasbiti, A.H., Yari, S., Graviss, E.A. (2009), “High level rifampin resistance correlates with multiple mutations in the rpoB gene of pulmonary tuberculosis isolates from the Afghanistan border of Iran”, J. Clin Microbiol., 47(9), pp. 27442750 17 Balganesh, T.S., Alzari, P.M., Cole, S.T. (2008), “Rising standards for tuberculosis drug development”. Trends. Pharmacol. Sci., 29(11), pp. 576581 66 Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc 18 Barry, C.E., Boshoff, H.I., Dartois, V., Dick, T., Ehrt, S., Flynn, J., Schnappinger, D., Wilkinson, R.J, Young, D. (2009), “The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies”, Nat. Rev. Microbiol., 7(12), pp. 845855 19 Borrell, S., Gagneux, S. (2009), “Infectiousness, reproductive fitness and evolution of drugresistant Mycobacterium tuberculosis”, Int J Tuberc Lung Dis., 13(12), pp. 14561466 20 Campbell, E.A., Korzheva, N., Mustaev, A., Murakami, K., Nair, S., Goldfarb, A., Darst, S.A. (2001), ”Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacteria RNA polymerase”, J. Cell. 104, pp. 901912. 21 Caws M., Duy, P.M., Tho, D.Q., Lan, N.T.N., Hoa, D.V., Farrar, J (2006), ”Mutations prevalent among rifampicin and isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from a hospital in Vietnam”, J. Clin. Microbiol., 44, pp. 23332337. 22 Cavusoglu, C., Hilmioglu, S., Guneri, S., Bilgic, A (2002), ”Characterization of rpoB mutations in rifampin – resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from Turkey by DNA sequencing and line probe assay” J. Clin. Microbiol. 40, pp. 44354438. 23 Chan, E.D., Bai, X., Kartalija, M., Orme, I.M., Ordway, D.J. (2010), “Host immune response to rapidlygrowing mycobacteria, an emerging cause of chronic lung disease”, Am. J Respir. Cell. Mol. Biol., [Epub ahead of print] 24 Cooksey, R., Morlock, G., Glickman, S., Crawford. J. (1997), “Evaluation of a line probe assay kit for characterization of rpoB mutations in refampin resistant 67 Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc Mycobacterium tuberculosis isolates from New York city”, J. Clin. Microbiol., 35(5), pp. 12811283 25 Dale, J.W., Nor, R.M., Ramayah, S., Tang, T.H., Zainuddin, Z.F (1999), “Molecular epidemiology of tuberculosis in Malaysia”, J. Clin Microbiol., 37(5), pp. 12651268 26 de Viedma, D.G., Infantes, S.M.D., Lasala, F., Chaves, F., Alcala, L., Bouza, E. (2002), “New realtime PCR able to detect in a single tube multiple rifampin resistance mutations and highlevel isoniazid resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis”, J. Clin. Microbiol., 40, pp. 988995 27 Espasa, M., GonzálezMartín. J., Alcaide, F., Aragón, L.M., Lonca, J., Manterola, J.M., Salvadó, M., Tudó, G., Orús, P., Coll, P (2005), “Direct detection in clinical samples of multiple gene mutations causing resistance of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampicin using fluorogenic probes”. J. Antimicrob. Chemother., 55(6), pp. 860865 28 Espitia, C., Laclette, J.P., MondragónPalomino, M., Amador, A., Campuzano, J., Martens, A., Singh, M., Cicero, R., Zhang, Y., Moreno, C (1999), “The PE PGRS glycinerich proteins of Mycobacterium tuberculosis: a new family of fibronectinbinding protein”, Microbiology, 145, pp. 34873495. 29 Hahn, Y., Shin, S (2001), “Electrochemical behavior and diffenrential pulse polarographic determination of rifampicin in pharmaceutical preparations”, Arch. Pharma. Res., 24(2), pp. 100104 30 Hillemann, D., Weizenegger, M., Kubica, T., Richter, E., Niemann, S. (2005), “Use of the genotype MTBDR assay for rapid detection of rifampin and isoniazid 68 Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc resistance in Mycobacterium tuberculosis complex isolates”, J. Clin. Microbiol., 43(8), pp. 36993703 31 Marín, M., García de Viedma D., RuízSerrano, M.J., Bouza, E. (2004), “Rapid Direct Detection of Multiple Rifampin and Isoniazid Resistance Mutations in Mycobacterium tuberculosis in Respiratory Samples by RealTime PCR”. Antimicrob. Agents. Chemother., 48(11), pp. 42934300 32 MatsiotaBernard, P., Vrioni, G., and Marinis, E. (1998), “Characterization of rpoB Mutations in RifampinResistant Clinical Mycobacterium tuberculosis Isolates from Greece”, J. Clin. Microbiol., 36, pp. 20–23 33 Miotto, P., Piana, F., Penati, V., Canducci, F., Migliori, G.B., Daniela Maria Cirillo, D.M. (2006), “Use genotype MTBDR assay for molecular detection of refampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical strains isolates in Italy”, J. Clin. Microbiol., 44, pp. 24852491 34 Mokrousov, I., Otten, T., Vyshnevsky, B., Narvskaya, O. (2003), “Allelespecific rpoB PCR assays for detection of rifampicinresistant Mycobacterium tuberculosis in sputum smears”, Antimicrob Agents Chemother, 47, pp. 2231 2235 35 Musser, J.M. (1995), “Antimicrobial agent resistance in Mycobacteria: Molecular Genetic Insights”, Clinical Microbiology Review, 8(4), pp. 496514 36 Naga, S., Urvashi, B.S., Jyoti, A., Jitendra, N.P., Pradeep, S., Jyotish, C.S. (2006), “Rapid detection of rifampicinresistant Mycobacterium tuberculosis by in house, reverse line blot assay”, Diagn. Microbio. Infect. Dis., 56(2), pp 133 140 69 Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc 37 Noordhoek, G.T., Kaan, J.A., Mulder, S., Wilke, H., Kolk, A.H. (1995), “Routine application of the polymerase chain reaction for detect of Mycobacterium tuberculosis in clinal samples”, J. Clin. Pathol., 48, pp. 810814 38 Palomino, J.C., Leao, S.C., Ritacco, V. (2007), Tuberculosis 2007 from basic science to patient care www.tubercuosistextbook.com. 39 Qian, L., Abe, C., Lin, T.P., Lin, T.P., Yu, M.C., Cho, S.N., Wang, S., Douglas, J.T (2002), “rpoB genotypes of Mycobacterium tuberculosis Beijing family isolates from East Asian countries” J. Clin. Microbiol., 40, pp. 10911094 40 Ramaswamy, S., and Musser, J.M (1998), “Molecular genetic basis of anti microbial agent resistance in Mycobacterium Tuberculosis” Tuber. Lung. Dis., 79(1), pp. 329 41 Rattan, A., Kalia, A., Ahmad (1998), ”Multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis” Emerg. Infect. Dis., 4(2), pp. 195209 42 Sajduda, A., Brzostek, A., Poplawska, M., AugustynowiczKopee, E., Zwolska, Z., Niemann, S., Dziadek, J., Hillemann, D. (2004), ”Molecular Characrerization of Rifampin and IsoniazidResistant Mycobacterium tuberculosis Strains Isolated in Poland”, J. Clin. Micobiol, pp. 24252431 43 Schecter, G.F., Scott, C., True, L., Raftery, A., Flood, J., Mase, S (2010), “Linezolid in the treatment of multidrugresistant tuberculosis”, J. Clin. Infect Dis. 50(1), pp. 4955 44 Scholossberg, D. (2006), Tuberculosis and nontuberculus Mycobacteria infections, Fifth edition McGrawHill, Medical Publishing Division 45 Shin, S.S., Naroditskaya, V., Sloutsky, A., Werner, B., Timperi, R., Bayona, J., Farmer, P.E., Becerra, M.C. (2005), ”rpoB gene mutations in clinical isolates of 70 Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis in Northern Lima, Peru”, Microb Drug Resist, 11(1), pp. 2630 46 Shitrit, D., Vertenshtein, T., Shitrit, A.B., Shlomi, D., Kramer, M.R., (2005), “The role of routine culture for tuberculosis during bronchoscopy in a nonendemic area: analysis of 300 cases and review of the literature”, Infect. Control. 33(10), pp. 602605 47 Telenti, A., Imboden, P., Marchesi, F., Lowrie, D., Cole, S., Colston, M.J., Matter, L., Schopfer, K., Bodmer, T. (1993), ”Detection of rifampicinresistance mutations in Mycobacterium tuberculosis”, Lancet 341, pp. 647650. 48 W.H.O (2004), “Antituberculosis drug resistant in the world”, WHO Report No. 2, http://www.who.int/tb/piblication/who_htm_tb_2004_343/en/ 49 W.H.O., (2007), “Global tuberculosis control surveillance, planning, financing”, WHO Report 2007 50 Wada, T., Maeda, S., Tamaru, A., Imai, S., Hase, A., Kobayashi, K. (2004), “Dual Probe Assay for Rapid Detection of DrugResistant Mycobacterium tuberculosis by RealTime PCR”. J. Clin. Microbiol, 42(11), pp. 52775285 51 Woodford, N., Ellington, M.J. (2007), “The emergence of antibiotic resistance by mutation”, J. Clin. Microbiol. Infect., 13(1), pp. 518 52 Zhang, Y., Yew, W.W. (2009), “Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis”, Tuberc. Lung. Dis., 13(11), pp. 13201330 53 Zhu, X., Chang, S., Fang, K., Cui, S., Liu, J., Wu, Z., Yu, X., Gao, G.F., Yang, H., Zhu, B., Wang, J. (2009), “MyBASE: a database for genome polymorphism and gene function studies of Mycobacterium”, BMC Microbiol, pp. 9: 40 71 Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc PHỤ LỤC Phụ lục 1. Các cơng trình khoa học có liên quan tới luận văn đã cơng bố Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Văn Bắc, Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Trung Nam, Chu Hồng Hà, Nguyễn Thái Sơn (2009) Chẩn đốn các chủng vi khuẩn lao kháng rifampicin bằng phương pháp xác định đột biến trên gen rpoB. Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 7(2): 251256 Nguyễn Văn Bắc , Nguyễn Hữu Cường, Chu Hồng Hà, Lã Duy Anh, Nguyễn Thái Sơn, Nghiêm Ngọc Minh (2009) Xác định các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid bằng phương pháp xác định đột biến trên gen katG. Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc 749752 Nguyễn Văn Bắc , Cung Thị Ngọc Mai, Nghiêm Ngọc Minh (2010) Đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid phân lập tại miền Nam – Việt Nam. Tạp chí Cơng nghệ Sinh học. 8(3A): 741745 72 Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Văn Bắc (2010) Vi khuẩn lao kháng thuốc và các phương pháp phát hiện. Tạp chí Cơng nghệ Sinh học. 8(2): 133144 Phụ lục 2. Danh sách các mẫu DNA tách từ chủng vi khuẩn lao do Học viện Qn Y cung cấp DANH SÁCH MẪU DNA TÁCH TỪ CHỦNG VI KHUẨN LAO BỆNH VIỆN LAOBỆNH PHỔI TRUNG ƯƠNG Các chủng kháng đơn thuốc STT Mã DNA KQ KSĐ ĐO102 ĐO202 ĐO302 ĐO402 ĐO502 ĐO602 ĐO702 ĐO802 ĐO902 H H H H H H H S S Mã chủng TB0253 TB0254 TB0256 TB0251 TB0252 TB0255 TB0257 TB0268 TB0271 73 Nồng độ DNA (ng/ul) 9,8 13,0 34,8 6,0 20,7 30,8 10,4 11,7 18,5 OD260/280 1,83 2,06 1,70 2,79 1,67 1,64 1,65 1,84 1,79 Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc 10 11 12 13 14 15 ĐO1002 ĐO1102 ĐO1202 ĐO1302 ĐO1402 ĐO1502 S S S S S S Các chủng kháng đa thuốc STT Mã DNA KQ KSĐ 10 11 12 13 14 15 ĐA102 ĐA202 ĐA302 ĐA402 ĐA502 ĐA602 ĐA702 ĐA802 ĐA902 ĐA1002 ĐA1102 ĐA1202 ĐA1302 ĐA1402 ĐA1502 HRS HRS HRS HRS HRS HRS HRS HRS HRS HRS HRS HRS HRS HRSE HRSE TB0275 TB0276 TB0277 TB0279 TB0280 TB0281 20,0 19,7 20,7 9,3 22,8 32,3 1,72 1,80 1,79 1,91 1,76 1,74 Mã chủng Nồng độ DNA (ng/ul) 44,0 7,2 6,8 18,5 8,2 8,0 36,3 5,7 5,2 6,9 14,0 7,2 10,1 9,8 6,8 OD260/280 TB02101 TB02105 TB02107 TB02110 TB02111 TB02112 TB02113 TB02115 TB02116 TB02117 TB02118 TB02122 TB02124 TB02130 TB02133 1,89 2,1 2,06 1,94 1,8 2,1 1,76 1,89 1,98 1,91 1,85 1,80 1,92 2,06 1,77 DANH SÁCH MẪU DNA TÁCH TỪ CHỦNG VI KHUẨN LAO BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG HUẾ Các chủng kháng đơn thuốc STT Mã DNA ĐO105 ĐO205 KQ KSĐ S H Mã chủng Nồng độ OD260/280 TB0549 TB0579 DNA (ng/ul) 15.19 16,9 1.64 1,84 74 Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc 10 11 12 13 14 15 ĐO305 ĐO405 ĐO505 ĐO605 ĐO705 ĐO805 ĐO905 ĐO1005 ĐO1105 ĐO1205 ĐO1305 ĐO1405 ĐO1505 S S S S H H S H S S H S S Các chủng kháng đa thuốc STT Mã DNA KQ KSĐ 10 11 12 13 14 15 ĐA105 ĐA205 ĐA305 ĐA405 ĐA505 ĐA605 ĐA705 ĐA805 ĐA905 ĐA1005 ĐA1105 ĐA1205 ĐA1305 ĐA1405 ĐA1505 HS HS HRSE HRS HRS HS HRSE HRSE HRSE HS HS HRS HS HRSE HR TB0584 TB05109 TB05110 TB05116 TB05130 TB05214 TB05223 TB05231 TB05237 TB05243 TB05266 TB05278 TB05283 Mã chủng TB051 TB0577 TB0597 TB05108 TB05117 TB05138 TB05146 TB05147 TB05172 TB05199 TB05213 TB05220 TB05221 TB05225 TB05254 75 6,5 39,5 33,3 41,5 12.0 20.1 38.4 84.2 129.7 53.2 30.0 22.0 74.8 Nồng độ DNA (ng/ul) 46,3 5.21 3,6 49,2 24,3 28.93 110,4 77,6 10.86 7.75 18.7 28.9 73.3 26.4 28.2 1,39 1,71 1,75 1,74 1.79 1.91 1.79 1.69 1.52 1.75 1.58 2.14 1.83 OD260/280 1,55 2.02 1,37 1,69 1,60 1.41 1,59 1,59 1.52 2.11 1.59 2.01 2.00 2.06 1.68 Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc DANH SÁCH MẪU DNA TÁCH TỪ CHỦNG VI KHUẨN LAO BỆNH VIỆN PHẠM NGỌC THẠCH Các chủng nhạy cảm với thuốc kháng sinh Stt Mã DNA 10 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 KQ Kháng sinh đồ Mã chủng TB06140 TB06143 TB06144 TB06145 TB06146 TB06147 TB06148 TB06149 TB06150 TB06151 Các chủng kháng đơn thuốc Stt Mã KQ Kháng Mã chủng DNA sinh đồ 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 ĐO1 ĐO2 ĐO3 ĐO4 ĐO5 ĐO6 ĐO7 ĐO8 ĐO9 ĐO10 ĐO11 ĐO12 ĐO13 ĐO14 S H S S H S R S H S H H S S TB06105 TB06107 TB06113 TB06115 TB06121 TB06128 TB06133 TB06134 TB06141 TB06142 TB06157 TB06161 TB06162 TB06164 76 Nồng độ DNA (ng/ul) 66.9 82.3 67.8 60.9 38.5 32.7 4.7 19.1 57.8 62.0 OD260/280 Nồng độ DNA (ng/ul) 52.8 50.6 10.8 3.6 13.0 304 4.5 6.1 8.2 120.6 6.7 57.4 31.4 3.5 OD260/280 1.72 1.89 1.96 2.0 1.85 1.94 1.79 1.96 1.86 1.98 1.74 1.59 1.76 2.25 1.68 1.85 2.89 2.36 2.2 1.91 2.01 1.85 1.90 1.46 Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc 25 ĐO15 TB06165 66.5 1.91 Các chủng kháng đa thuốc Stt Mã KQ Kháng DNA sinh đồ Mã chủng OD260/280 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 TB0622 TB0623 TB0626 TB0627 TB0628 TB0631 TB0633 TB0635 TB0636 TB0637 TB0638 TB0639 TB0641 TB0651 TB0682 Nồng độ DNA (ng/ul) 13.4 8.9 4.9 5.0 12.0 3.8 3.4 4.5 10.3 72.9 7.7 8.0 36.8 43.9 5.5 ĐA1 ĐA2 ĐA3 ĐA4 ĐA5 ĐA6 ĐA7 ĐA8 ĐA9 ĐA10 ĐA11 ĐA12 ĐA13 ĐA14 ĐA15 S HSRE HSRE HSRE HSR HSRE HSRE HSRE HSR HSRE HSRE HSR HSRE HSRE HSRE HSRE Các chủng siêu kháng thuốc Stt Mã KQ Kháng sinh đồ Mã chủng DNA Kháng dòng Kháng dòng 41 42 43 44 45 46 S1 S2 S3 S4 S5 S6 HSRE HSRE HSRE HSRE HSRE HSRE 47 48 S7 S8 HSRE HSRE 49 S9 HSRE Nồng độ DNA (ng/ul) OD260/280 TB0624 TB0625 TB0629 TB0630 TB0632 TB0634 88.1 14.1 3.8 103.2 12.9 14.0 1.83 1.95 1.75 1.85 1.52 1.83 TB0640 TB06204 26.7 18.9 1.57 1.83 TB06205 19.7 1.92 PAS Ofx Cs Ofx,Eto Ofx, Th Ofx,Eto,Km, PAS Ofx Ofx,Cs,Eto, Km,PAS Ofx,Eto,Cs, 77 1.89 1.82 1.86 1.8 1.8 2.08 1.56 1.75 1.99 1.77 1.98 1.9 1.73 1.74 1.91 Luận văn thạc sĩ Nguy ễn Văn Bắc 50 S10 HSRE 51 S11 HSRE 52 S12 HSRE 53 S13 HSRE 54 S14 HSRE 55 S15 HSRE PAS Ofx,Cs,Km, PAS Ofx,Eto,Cs, Km,PAS Ofx,Eto,Cs, Km,PAS Ofx,Th,Cs,K m,PAS Ofx,Th,Eto, Cs, Km,PAS Ofx,Th,Eto, Cs, Km,PAS 78 TB06217 4.7 2.12 TB06218 4.8 2.88 TB06219 19.3 2.07 TB06221 17.3 1.84 TB06222 28.2 1.85 TB06223 14.4 2.07 ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Nguyễn Văn Bắc NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm... codon nằm gần trung tâm của gen rpoB. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tơi tiến hành đề tài: Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử Với mục tiêu nghiên cứu: phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn lao kháng. .. pháp ni cấy vi khuẩn và làm kháng sinh đồ là chủ yếu, tuy nhiên, vi c ứng dụng sinh học phân tử cũng đang tạo ra những đột phá trong phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc. Cơ chế kháng thuốc vi khuẩn lao là do trong q trình tiến hóa, có nhiều