Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử (luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Văn Bắc NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2010 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng – TỔNG QUAN 1.1 BỆNH LAO 1.2 TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC 1.3 VI KHUẨN LAO 1.3.1 Cấu tạo 1.3.2 Cơ chế gây bệnh 1.3.3 Đặc điểm hệ gen 1.4 CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC Ở VI KHUẨN LAO 1.4.1 Kháng sinh điều trị lao 1.4.2 Nguyên nhân gây kháng thuốc 10 1.4.3 Rifampicin chế kháng 12 1.4.4 Isoniazid chế kháng 15 1.5 CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC 16 1.5.1 Đặc điểm lâm sàng xét nghiệm cận lâm sàng 16 1.5.2 Xác định kiểu hình 18 1.5.3 Xác định kiểu gen 18 1.5.4 Kỹ thuật real-time PCR multiplex real-time PCR 19 Chƣơng – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 23 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 23 2.1.2 Vật liệu thiết bị dụng cụ nghiên cứu 23 2.1.3 Các cặp mồi dùng nghiên cứu 24 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 25 2.2.2 PCR nhân đoạn gen đích 26 2.2.3 Tạo dòng gen 27 2.2.4 Multiplex real-time PCR 28 Chƣơng – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 KẾT QUẢ TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ 30 3.1.1 Kết nhân gen katG rpoB t DNA tách t vi khuẩn lao 30 3.1.2 Kết tách dòng gen 31 3.1.3 Kết phân tích trình tự gen katG 34 3.1.4 Kết phân tích trình tự gen rpoB 36 3.2 TỐI ƢU HÓA PHẢN ỨNG MULTIPLEX REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN NHANH VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC 41 3.2.1 Thiết kế primer probe cho phản ứng multiplex real-time PCR 41 3.2.2 Kết tối ƣu thành phần chu trình phản ứng multiplex real-time PCR phát đột biến liên quan kháng thuốc 44 KẾT LUẬN 60 KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined MỞ ĐẦU Bệnh lao vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) đƣợc biết rõ từ kỷ Hiện tỷ lệ nhiễm lao đƣợc ƣớc tính 1/3 dân số giới, khoảng triệu ngƣời mắc lao triệu ngƣời chết lao năm Bệnh lao trở nên nghiêm trọng với xuất chủng lao kháng đa thuốc (Multi-Drugs Resistant - MDR), tức thể lao với vi khuẩn kháng hai loại thuốc chống lao mạnh isoniazid (INH) rifampicin (RMP) Theo số liệu thống kê chƣơng trình chống lao Quốc gia năm 2007, giới có khoảng 511.000 trƣờng hợp nhiễm lao kháng đa thuốc, có 130.000 trƣờng hợp tử vong Do khó khăn việc điều trị bệnh nhân mang chủng lao kháng thuốc phổ rộng đa kháng mà việc phát sớm chủng lao kháng đa thuốc trở nên quan trọng điều trị bệnh lao Hiện nhiều nơi chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc dựa vào phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn làm kháng sinh đồ chủ yếu, nhiên, việc ứng dụng sinh học phân tử tạo đột phá phát vi khuẩn lao kháng thuốc Cơ chế kháng thuốc vi khuẩn lao trình tiến hóa, có nhiều đột biến xuất số gen chức năng, trƣớc hết gen rpoB katG Thời gian chẩn đoán rút ngắn vài ngày, với độ nhạy độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện cho kiểm soát bệnh lao dễ dàng Các nghiên cứu sinh học phân tử chẩn đoán lao kháng thuốc loại kháng thuốc xuất đột biến gen tƣơng ứng chịu trách nhiệm Chính việc xác định trƣờng hợp nhiễm lao kháng thuốc thƣờng kèm với chẩn đoán phát đột biến gen chủng lao phát đƣợc Các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid có liên quan tới đột biến codon 315 gen katG, chủng kháng rifampicin xuất đột biến vùng nóng gồm 27 codon nằm gần trung tâm gen rpoB Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát vi khuẩn lao kháng đa thuốc kỹ thuật sinh học phân tử” Với mục tiêu nghiên cứu: phát nhanh chủng vi khuẩn lao kháng thuốc thông qua xác định vị trí đột biến liên quan kháng thuốc gen katG rpoB phương pháp giải trình tự kỹ thuật multiplex real-time PCR Để đạt đƣợc mục tiêu đề tài, tiến hành số nội dung nghiên cứu nhƣ sau: Xác định trình tự gen rpoB katG Phân tích đặc điểm phân tử chủng vi khuẩn lao kháng thuốc phân lập Việt Nam sở trình tự nucleotide hai gen rpoB katG Tối ƣu hóa thành phần chu trình kit multiplex real-time PCR phát nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc Chƣơng – TỔNG QUAN 1.1 BỆNH LAO Lao (Tuberculosis) bệnh truyền nhiễm mạn tính, tình trạng nhiễm vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis, thƣờng gặp phổi nhƣng ảnh hƣởng đến hệ thần kinh trung ƣơng (lao màng não), hệ bạch huyết, hệ tuần hoàn (lao kê), xƣơng khớp Bệnh lao gắn liền với phát triển xã hội loài ngƣời từ hàng ngàn năm nay, giới chƣa không quốc gia nào, khu vực nào, dân tộc ngƣời mắc chết bệnh lao Trực khuẩn lao lần đƣợc bác sĩ Robert Koch phát vào ngày 24/3/1882 Trong thời gian Mỹ châu Âu, ngƣời có ngƣời chết lao, vậy, phát Robert Koch bƣớc ngoặt quan trọng việc khống chế loại trừ bệnh Trƣớc đây, lao đƣợc xem bệnh truyền nhiễm nguy hiểm giới, lƣu hành với tỷ lệ mắc bệnh cao, đặc biệt nƣớc thuộc châu Phi khu vực châu Á, có Việt Nam Việt Nam đứng thứ 12 22 nƣớc có số bệnh nhân lao cao toàn cầu Trong khu vực Tây Thái Bình Dƣơng, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc Philippines số bệnh nhân lao, nhƣ số bệnh nhân lao xuất năm Hiện nguy nhiễm lao nƣớc ta năm đƣợc ƣớc tính 1,5% dân số (ở tỉnh phía Nam 2%, tỉnh phía Bắc 1%) Trên thực tế số nguy nhiễm lao hàng năm cao 1,5%, nhƣ vậy, số nêu lớn Điều tăng thêm khó khăn công tác phòng chống lao năm tới mà thời gian dài, đến hàng chục năm, thiên niên kỷ [3, 35] 1.2 TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC Bệnh lao ngày trở nên phức tạp có ảnh hƣởng nặng nề xuất thêm vi khuẩn lao kháng thuốc tạo nên dạng bệnh khó phòng chống Các chủng lao kháng thuốc đƣợc chia làm hai thể, lao kháng đa thuốc (Multi-drugs resistant - MDR) lao kháng thuốc phổ rộng (Extensively drug resistant - XDR), chủng vi khuẩn lao kháng thuốc nguồn lây nhiễm mối đe dọa cho sức khỏe cộng đồng Theo ƣớc tính Tổ chức Y tế giới (WHO), giới có khoảng 42 vạn ngƣời mắc lao kháng đa thuốc, chiếm số lƣợng lớn khu vực Tây Thái Bình Dƣơng có 15 vạn trƣờng hợp, khu vực Đông Nam Á sau khu vực Châu Phi Đông Âu Một số chủng lao vừa kháng đa thuốc vừa kháng thuốc phổ rộng, coi loại siêu kháng thuốc [17] Tình hình lao siêu kháng thuốc ngày trở nên trầm trọng, từ tháng 11/2004 đến 11/2005, WHO Trung tâm Kiểm soát Bệnh Hoa Kỳ phân tích 17.890 mẫu đờm gửi từ 40 quốc gia toàn giới, thấy có 20% trƣờng hợp kháng đa thuốc 2% trƣờng hợp kháng thuốc phổ rộng Ở Việt Nam, theo nghiên cứu Chƣơng trình Chống lao Quốc gia có 32,5% trƣờng hợp bệnh lao mang vi khuẩn lao kháng thuốc [1, 3] Vi khuẩn lao kháng thuốc thách thức lớn, đe dọa công phòng chống lao toàn cầu, thuốc chống lao có hiệu bị vi khuẩn lao kháng lại kháng đa thuốc [10] Thuốc chống lao có nhiều loại, tác dụng thuốc trực khuẩn lao không giống Hiện ngƣời ta chia thuốc chống lao thành hai loại: (1) thuốc chống lao chủ yếu (còn gọi thuốc chống lao loại một, thuốc chống lao hàng đầu), (2) thuốc chống lao thứ yếu (còn gọi thuốc chống lao loại hai, thuốc chống lao hàng thứ hai) Trong thuốc chống lao loại thuốc có hiệu độc tính nhất, thuốc chống lao hàng thứ hai thuốc có tác dụng lại có độc tính cao giá thành đắt Ở New York, chi phí điều trị bệnh nhân nhạy với thuốc 2.000 USD điều trị bệnh nhân kháng thuốc hết 250.000 USD Hiện số tử vong hàng năm lao giới lớn số tử vong HIV, sốt rét bệnh nhiệt đới cộng lại Tổ chức Y tế Thế giới nhận định bệnh lao quay trở lại trở nên tồi tệ kháng thuốc vi khuẩn lao [17] Thuốc kháng sinh dùng để điều trị lao streptomycin, nhƣng vài năm sau kháng sinh đƣợc sử dụng ngƣời ta nhận thấy tƣợng đề kháng lại streptomycin vi khuẩn lao Sau kháng sinh chống lao khác tiếp tục đời: para – aminosalysilic, isoniazid, rifampicin nhƣng không mang lại hiệu sau thời gian điều trị định [7] Nghiên cứu tìm kiếm hoá dƣợc có hiệu điều trị lao, đặc biệt lao kháng thuốc luôn đƣợc thực ngày có nhiều hợp chất chống lao đƣợc đƣa vào sử dụng, ví dụ, gần linezolid [43] Tuy nhiên, theo chế áp lực, vi khuẩn không ngừng biến đổi tạo nên nhiều chủng có khả kháng thuốc nhanh chóng [52] Khả điều trị thành công đạt 95-100% bệnh nhân mắc lao thông thƣờng, tỷ lệ thành công với bệnh nhân mắc lao kháng thuốc 20 – 30%, chí không điều trị đƣợc mắc lao kháng đa thuốc kháng thuốc phổ rộng dùng kết hợp đến năm loại kháng sinh điều trị lao Vì vậy, việc phát ngăn chặn lan truyền chủng lao kháng đa thuốc vấn đề quan trọng điều trị lao [7, 10, 35] 1.3 VI KHUẨN LAO 1.3.1 Cấu tạo Trực khuẩn lao có dạng hình que, thân mảnh dẻ, nha bào, kích thƣớc - µm, dày 0,3 µm, kháng cồn, kháng acid (hình 1.1) Khi đƣợc nhuộm phƣơng pháp Ziehl - Neelsen, trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, không bị cồn acid làm màu carbonfuchsin Ở môi trƣờng nuôi cấy có độ acid đậm đặc định, trực khuẩn lao phát triển đƣợc, vậy, chúng đƣợc gọi trực khuẩn kháng cồn, kháng toan (acid fast bacilli - AFB), đặc điểm bật vi khuẩn thuộc chi mycobacteria Đặc điểm quan trọng để phát trực khuẩn lao phƣơng pháp hình thái học (nhuộm màu) mẫu bệnh phẩm Một số giả thiết cho mức kháng acid độ dài chuỗi mycolic acid M tuberculosis có khả thể tất chế cần thiết để tổng hợp vitamin, amino acid enzyme cofactor thiết yếu tế bào Mycobacteria có cấu trúc gần giống với vi khuẩn Gram dƣơng nhƣng chúng không đƣợc xếp vào loại vi khuẩn Gram dƣơng phân tử gắn với thành tế bào lipid protein hay polysaccharide Do đó, chúng không giữ lại tinh thể màu tím xuất nhuộm Gram [2, 5, 37, 38] Trực khuẩn lao hiếu khí, phát triển tốt 37oC dƣới áp suất O2 100 mmHg Đỉnh phổi vùng phổi dƣới xƣơng đòn thƣờng hay mắc lao có áp suất O2 từ 120 – 130 mmHg (khi đứng) đến thân xƣơng đầu xƣơng áp suất O 100 mmHg Lách, gan, dày, thực quản mắc lao áp suất O2 thấp Trực khuẩn lao sinh sản chậm, 20 có lần phân chia tế bào, điều kiện phòng thí nghiệm 12 đến 24 M tuberculosis phân chia lần môi trƣờng nuôi cấy giàu dinh dƣỡng Loewenstein [46] Tốc độ phát triển chậm tính thẩm thấu thành tế bào hạn chế việc hấp thụ chất dinh dƣỡng liên quan đến tốc độ tổng hợp ribosome (Hình 1.2) Hình 1.1 Hình dạng tế bào M tuberculosis (http://www.diseasedetectives.org/mi crobe_gallery/tuberculosis) Hình 1.2 Tế bào vi khuẩn lao phát triển môi trƣờng nuôi cấy (http://abcnews.go.com/Health/Germs /story?id=3079114&page=1) Trực khuẩn lao có cấu tạo phức tạp, hoàn hảo mà vi sinh vật có đƣợc Dƣới kính hiển vi điện tử trực khuẩn lao có cấu tạo nhƣ sau (hình 1.3): - Lớp có cấu trúc màng, có thành phần chủ yếu phospholipid gồm nhóm: nhóm ƣa nƣớc hƣớng vào bên trong, nhóm kỵ nƣớc quay Cấu trúc tạo nên màng sinh học có tác dụng giúp trực khuẩn điều hòa thẩm thấu vỏ trực khuẩn, màng chứa protein chức khác nhƣ protein truyền tín hiệu đến máy trao đổi chất di truyền nguyên sinh chất, enzyme liên quan đến trình trao đổi chất sinh lƣợng, chất mang làm trung gian cho trình vận chuyển chất dinh dƣỡng ion Các enzyme xuyên màng tổng hợp màng, tạo thành vách ngăn phân chia tế bào, tập hợp tiết số enzyme ngoại bào, chép DNA [2, 4, 37, 38] - Lớp peptidoglucan liên kết với đƣờng arabinose phân tử mycolic acid tạo nên khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vi khuẩn có độ cứng định Thành tế bào mycobacteria cấu trúc phức tạp đƣợc biết prokaryote, có số thành phần hóa học liên kết chéo bất thƣờng, mức độ liên kết peptidoglucan thành tế bào M tuberculosis 70 - 80% vi khuẩn E coli 20 - 30% [38] - Lớp đƣợc tạo nên liên kết mycolic acid chất phức tạp, lớp tạo nên độc tính vi khuẩn lao có cấu trúc phức tạp làm tăng khả chống thấm nƣớc thành tế bào vi khuẩn giúp trực khuẩn tồn lâu với môi trƣờng bên ngoài, chống khả bị hủy diệt đại thực bào tế bào miễn dịch [38] - Lớp vỏ có vai trò quan trọng, có cấu trúc peptidoglyolipid Nó đảm bảo cho tồn trực khuẩn, làm cho trực khuẩn bền vững với tƣợng thực bào, giúp bảo vệ khỏi áp suất thẩm thấu nên vào thể trực khuẩn khó bi tiêu diệt quang probe không bị ảnh hƣởng lẫn Ngƣợc lại, trƣờng hợp tín hiệu huỳnh quang cho thấy dập tắt lẫn nhau, cụ thể probe rpoB526 probe rpoB531 cho tín hiệu yếu gần nhƣ bị dập tắt hoàn toàn Do đó, lựa chọn trƣờng hợp cho lần tối ƣu 3.2.2.2 Tối ưu nồng độ primer probe Thông thƣờng phản ứng multiplex real-time PCR, ngƣời ta dùng nhiều cặp mồi (primer) nhiều probe để khuyếch đại nhiều gen đích khác Để tăng hiệu multiplex real-time PCR đòi hỏi phải thay đổi tỷ lệ mồi probe khác phản ứng Hiệu khuếch đại đặc hiệu phụ thuộc vào tỷ lệ mồi gắn với gen đích Nhân tố làm giảm tỷ lệ gắn mồi tối ƣu mồi thiết kế không tốt, nhiệt độ gắn mồi thành phần đệm dƣới mức tối ƣu Do việc thay đổi nồng độ mồi không ảnh hƣởng nhiều đến khả hoạt động phản ứng PCR, nghiên cứu lựa chọn nồng độ mồi nhƣ (1 μM) để đảm bảo hiệu khuếch đại gen đích giống Việc giảm lƣợng probe tới mức tối ƣu làm ổn định cƣờng độ tín hiệu huỳnh quang giảm chi phí cho kit chẩn đoán Chúng tiến hành chạy gradient nồng độ probe, probe Control chạy với dải nồng độ lần lƣợt 0,01 μM – 0,03 μM – 0,05 μM – 0,1 μM Trong nồng độ probe katG315, rpoB526 rpoB531 đƣợc giữ cố định 0,1 μM Kết đƣợc thể hình 3.7A 3.7B 48 A B Hình 3.7 Kết multiplex real-time PCR với gradient nồng độ probe Control A: Tín hiệu huỳnh quang đo bƣớc sóng 53 nm B: Tín hiệu huỳnh quang đo bƣớc sóng 56 nm : Nồng độ 0,01 μM : Nồng độ 0,03 μM : Nồng độ 0,05 μM : Nồng độ 0,1 μM Qua kết gradient nồng độ probe Control, nồng độ probe lại giữ cố định 0,1 μM thấy nồng độ 0,01 μM 0,03 μM không cho tín hiệu huỳnh quang tín hiệu yếu, nồng độ 0,05 μM 0,1 μM cho tín hiệu huỳnh quang tốt chọn nồng độ 0,05 μM cặp probe Control cho lần chạy sau Đối với probe lại (không biểu thị kết hình ảnh), tiến hành thử nghiệm tƣơng tự thu đƣợc kết nồng độ tối ƣu probe phản ứng multiplex real-time PCR (Bảng 3.9) Bảng 3.9 Nồng độ thể tích probe đ tối ƣu phản ứng multiplex real-time PCR Ống Ống Nồng độ V (µM) (µl) Probe_Control (5 pm) 0.05 0.2 Probe_katG (5 pm) 0.05 0.2 Thành phần Nồng độ V (µM) (µl) Probe_rpoB531 (5 pm) 0.12 0.48 Probe_rpoB526 (5 pm) 0.1 0.4 Thành phần 49 3.2.2.3 Độ nhạ độ đặc hiệu Phƣơng pháp khuếch đại gen real-time PCR phƣơng pháp có độ nhạy độ đặc hiệu cao chẩn đoán nói chung Tuy nhiên, phản ứng multiplex real-time PCR, độ nhạy phản ứng thƣờng giảm có ức chế cặp mồi probe khác nhau, hạn chế việc cung cấp thành phần phản ứng nhƣ dNTPs, MgCl2 đặc biệt emzyme xúc tác *) Độ nhạ Để đánh giá độ nhạy phản ứng multiplex real-time PCR pha loãng DNA tổng số tách từ M tuberculosis thành nồng độ khác cho phản ứng chứa 0,1 fg/µl – fg/µl – 10 fg/µl – 100 fg/µl – pg/µl – 10 pg/µl DNA khuôn Hình 3.8 Multiplex real-time PCR với nồng độ DNA khác : Nồng độ 0,1 fg/µl : Nồng độ fg/µl : Nồng độ 10 fg/µl : Nồng độ 100 fg/µl : Nồng độ pg/µl : Nồng độ 10 pg/µl Kết cho thấy nồng độ 100 fg/µl; pg/µl 10 pg/µl cho tín hiệu huỳnh quang tốt, nồng độ nhỏ phản ứng khuếch đại không xảy nên tín 50 hiệu huỳnh quang không (Hình 3.8) Do vậy, kết luận 100 fg/µl DNA nồng độ tối thiểu cần có phản ứng multiplex real-time PCR hay độ nhạy phản ứng 100 fg/µl Kết phù hợp với số nghiên cứu tác giả giới Trong nghiên cứu phát nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc real-time PCR Wada (2004), tác giả đánh giá độ nhạy phƣơng pháp cách pha loãng DNA tổng số tách chiết từ chủng M tuberculosis H37Rv, đạt đƣợc độ nhạy nồng độ 100 fg/µl đạt đƣợc ngƣỡng 10 fg/µl (tƣơng ứng với 2-3 tế bào/phản ứng) sử dụng kết hợp với phƣơng pháp PCR lồng (nested PCR) để tăng độ nhạy kit [50] Marín cộng (2004) sử dụng phƣơng pháp pha loãng số lƣợng vi khuẩn lao nồng độ khác (số lƣợng vi khuẩn đƣợc tính phƣơng pháp soi kính hiển vi), sau tách chiết DNA nồng độ tiến hành đo độ nhạy real-time PCR, kết đạt ngƣỡng phát 103 tế bào ml, tƣơng ứng với 10 tế bào/phản ứng [31] Cũng sử dụng phƣơng pháp tƣơng tự, Espasa (2005) nghiên cứu kit phát nhanh vi khuẩn lao kháng INH RIF real-time PCR.cũng đạt độ nhạy 1,5.103 tế bào ml [27] *) Độ đặc hiệu Kiểm tra độ đặc hiệu multiplex real-time PCR cách tiến hành chạy với mẫu DNA vi khuẩn lao (E coli) nhằm phát trƣờng hợp dƣơng tính giả Kết thí nghiệm 24 mẫu DNA lao cho thấy hệ thống multiplex real-time PCR âm tính với toàn mẫu Nhƣ vậy, độ đặc hiệu đạt 100% Độ đặc hiệu mẫu bệnh phẩm lâm sàng đƣợc so với mẫu âm tính thực (một số tác giả sử dụng kết nuôi cấy vi khuẩn lao làm chuẩn), nhiên nghiên cứu chƣa có điều kiện thực Tác giả Wada (2004) đo độ đặc hiệu phƣơng pháp cách sử dụng mẫu DNA tách từ chủng vi khuẩn lao nhƣ: K pneumoniae, P aeruginosa, S aureus Kết phản ứng âm tính hoàn toàn với mẫu này, 51 tác giả đến khẳng định độ đặc hiệu cao phƣơng pháp [50] Marín (2004) sử dụng 14 mẫu DNA lao số giống vi khuẩn khác để kiểm tra độ nhạy phản ứng real-time PCR phát vi khuẩn lao mình, tác giả nhận thấy độ đặc hiệu đạt 100% [31] 3.2.2.4 Qui trình multiplex real-time R phát lao kháng thuốc Từ kết nghiên cứu nhƣ trên, đề xuất ứng dụng qui trình phản ứng multiplex real-time PCR cho phát đột biến liên quan kháng thuốc vi khuẩn lao nhƣ bảng 3.10 Bảng 3.10 Nồng độ thể tích thành phần tham gia phản ứng multiplex real-time PCR đ tối ƣu Ống Thành phần Ống Nồng độ V (µl) Thành phần Nồng độ V (µl) Master Mix (5X Conc) 1X Master Mix (5X Conc) 1X Primer katG_F (20 pm) µM Primer rpoB_F (20 pm) µM Pimer katG_R (20 pm) µM Primer rpoB_R (20 pm) µM Primer rpoB_F (20 pm) µM Probe_rpoB531 (5 pm) 0.12 µM 0.48 Primer rpoB_R (20 pm) µM Probe_rpoB526 (5 pm) 0.1 µM 0.4 Probe_katG315 (5 pm) 0.05 µM 0.2 DNA mẫu (50 ng/µl) 100 ng Probe_Control (5 pm) 0.05 µM 0.2 dH2O DNA mẫu (50 ng/µl) 100 ng dH2O 11.12 9.6 Tổng Tổng 20 52 20 3.2.2.5 hân tích kết đưa kết luận chẩn đoán cuối Trƣớc tiên, để hiểu cách chi tiết phƣơng pháp xác định đột biến kỹ thuật real-time PCR nói chung chìa khóa để phân tích kết thu đƣợc, ngƣời làm thí nghiệm cần hiểu rõ số khái niệm chu kỳ ngƣỡng (threshold cycle – Ct) khái niệm đƣờng tín hiệu huỳnh quang real-time PCR Là khái niệm trung tâm kỹ thuật real-time PCR, chu kỳ ngƣỡng (giá trị Ct) mẫu đƣợc định nghĩa số chu kỳ mà tín hiệu huỳnh quang mẫu vƣợt tín hiệu huỳnh quang (hay đƣờng ngƣỡng) phản ứng PCR đƣợc thiết bị cảm biến ghi nhận Chu kỳ ngƣỡng rơi vào pha lũy thừa (exponential phase) phản ứng PCR Vì vậy, việc xác định đột biến phản ứng xác không chịu ảnh hƣởng từ pha bão hòa (plateau phase) phản ứng PCR Đối với mẫu xảy đột biến, probe không gắn đƣợc vào sợi DNA đích Taq polymerase cắt bỏ probe này, huỳnh quang phát từ reporter bị quencher probe hấp phụ (dập tắt tín hiệu) ống thử nghiệm không phát 53 đƣợc tín hiệu huỳnh quang vƣợt qua tín hiệu huỳnh quang Ngƣợc lai, mẫu không bị đột biến (wild type) phát tín hiệu huỳnh quang vƣợt qua tín hiệu huỳnh quang nền, Các mẫu wild type có nồng độ nucleic acid ban đầu lớn có Ct nhỏ ngƣợc lại mẫu wild type có nồng độ nucleic acid ban đầu nhỏ có Ct lớn (hình 3.9) Tín hiệu huỳnh quang (threshold - đƣờng ngƣỡng) đƣợc tạo phản ứng real-time PCR chất phát huỳnh quang có nồng độ xác định có sẵn thành phần phản ứng real-time PCR Trong phản ứng real-time PCR sử dụng Taqman probe quencher Taqman probe đóng vai trò tạo tín hiệu cho phản ứng Để xác định đƣợc cƣờng độ huỳnh quang nền, thiết bị real-time thƣờng ghi nhận cƣờng độ tín hiệu huỳnh quang probe phát ống phản ứng số chu kỳ đầu Do phản ứng multiplex real-time PCR chứa nhiều probe khác phản ứng nên cƣờng độ huỳnh quang phải đƣợc hiệu chỉnh cƣờng độ huỳnh quang probe Do vậy, để thiết lập đƣợc đƣờng tín hiệu huỳnh quang trƣờng hợp cần phải tiến hành chạy kiểm tra số lƣợng mẫu đủ lớn sau lấy số liệu thống kê đƣa giá trị cƣờng độ huỳnh quang cuối Trong nghiên cứu này, sử dụng 45 mẫu DNA tách từ vi khuẩn lao biết xác vị trí đột biến thông qua phƣơng pháp giải trình tự nhƣ Bằng cách chạy multiplex real-time PCR với 45 mẫu này, lấy số liệu thống kê đƣa số liệu cuối giá trị tín hiệu huỳnh quang (Rn) = 0,2 (hình 3.9) 54 Tín hiệu huỳnh quang Chu kỳ ngƣỡng (Ct) Hình 3.9 Kết thiết lập đƣờng tín hiệu huỳnh quang Từ kết ta nhận thấy, để đƣa đƣợc kết luận chẩn đoán cuối cùng, ngƣời làm thí nghiệm cần quan sát đƣờng tín hiệu huỳnh quang mẫu cần chẩn đoán so sánh với đƣờng tín hiệu huỳnh quang Nếu đƣờng tín hiệu mẫu chẩn đoán không vƣợt qua đƣợc tín hiệu huỳnh quang từ kết luận mẫu mang đột biến Ngƣợc lại, đƣờng tín hiệu huỳnh quang mẫu chẩn đoán vƣợt lên cắt đƣờng tín hiệu huỳnh quang tức mẫu không mang đột biến (wild type) 3.2.2.6 Kết thử nghiệm mẫu DNA từ vi khuẩn lao Sau thiết lập thành công đƣờng tín hiệu huỳnh quang để đƣa kết luận chẩn đoán, tiến hành thử nghiệm phản ứng multiplex real-time PCR tối ƣu mẫu DNA từ vi khuẩn lao đƣợc giải trình tự trƣớc (do Học viện Quân y cung cấp đƣợc trình bày phần phụ lục 2) Hình 3.10 3.11 ví dụ điển hình chẩn đoán lao kháng thuốc bệnh nhân đƣợc ký hiệu lần lƣợt N2, DA1, DA2, DA3 DA4 Để tiến hành, 55 mẫu phải thực ống phản ứng trƣờng hợp tổng cộng có 10 ống phản ứng (ký hiệu ống nhƣ hình) Hình 3.10 Kết thử nghiệm phản ứng multilex real-time PCR mẫu N2, DA1, DA2, DA3 DA4 Đo bƣớc sóng 53 nm  phát tín hiệu probe gắn FAM (probe Control probe rpo531) Kết phân tích bƣớc sóng 530 nm cho thấy, ống phản ứng đầu (từ số – 5) có probe Control (gắn FAM) nên tín hiệu huỳnh quang nằm tín hiệu huỳnh quang ống phản ứng sau (từ số – 10) có probe rpoB531 (gắn FAM) nên mẫu xuất đột biến codon 531 gen rpoB tín hiệu huỳnh quang mẫu nằm dƣới đƣờng tín hiệu huỳnh quang nền, trƣờng hợp mẫu số (DA3 tƣơng ứng với mã chủng TB06-26) ví dụ, mẫu DA3 mang đột biến codon 531 từ đƣa kết luận bệnh nhân nhiễm vi khuẩn lao kháng rifampicin Các mẫu lại (mẫu số 6; 7; 10) không mang đột biến codon 531 56 Hình 3.11 Đo bƣớc sóng 56 nm  phát tín hiệu probe gắn VIC (probe katG315 pro526) Tƣơng tự, phân tích bƣớc sóng 560 nm Ở ống (từ số -5) ống có chứa probe katG315 (gắn VIC) nên mẫu xuất đột biến codon 315 gen katG có đƣờng tín hiệu huỳnh quan nằm dƣới đƣờng huỳnh quang nền, trƣờng hợp kết thể hình cho thấy mẫu số 2; 3; mang đột biến codon 315, mẫu số hoang dại (wild type) Ở ống sau (từ số – 10) ống chứa probe rpoB526 (gắn VIC) có mẫu số 10 (DA4) mang đột biến codon 526, mẫu lại (mẫu số 6; 7; 9) không mang đột biến codon 526 gen rpoB Tổng hợp lại hai trƣờng hợp phân tích trên, ngƣời làm xét nghiệm đƣa kết luận cho bệnh nhân nhƣ sau: - Bệnh nhân N2 nhiễm vi khuẩn lao nhạy cảm với thuốc kháng sinh - Bệnh nhân DA1 nhiễm vi khuẩn lao kháng isoniazid - Bệnh nhân DA2 nhiễm vi khuẩn lao kháng isoniazid 57 - Bệnh nhân DA3 nhiễm vi khuẩn lao kháng loại thuốc isoniazid rifampicin - Bệnh nhân DA4 nhiễm vi khuẩn lao kháng loại thuốc isoniazid rifampicin Bảng 3.11 Tổng kết theo bảng kết thử nghiệm kit STT Ngày tháng 13/5/2010 23/7/2010 27/7/2010 10 11 12 13 14 18/8/2010 Kết phát đột Mã số biến mẫu DNA lao Control KatG Rpo526 Rpo531 Chẩn đoán TB06-140 X X X Kháng H, R TB06-86 X X X Kháng H, R TB06-26 X X X Kháng H, R TB06-144 X TB06-205 X X X Kháng H, R TB06-250 X X X Kháng H, R TB06-24 X X X Kháng H, R TB06-25 X X X Kháng H, R TB02-101 X X X Kháng H, R TB02-107 X X X Kháng H, R TB06-87 X X X Kháng H, R TB06-204 X X X Kháng H, R TB06-143 X Nhạy TB06-144 X Nhạy Nhạy 58 X Ngày tháng STT 15 16 15/9/2010 17 18 19 20 21 17/9/2010 22 23 24 Kết phát đột Mã số biến mẫu DNA lao Control KatG Rpo526 Rpo531 Chẩn đoán TB06-146 X Nhạy TB06-143 X Nhạy TB06-22 X X Kháng H TB06-23 X X Kháng H TB06-26 X X Kháng H TB06-27 X X TB06-205 X X TB06-219 X TB06-221 X X Kháng R TB06-223 X X Kháng R X Kháng H, R Kháng H X Kháng R H: isoniazid R: rifampicin Từ bảng tổng hợp kết thử nghiệm phản ứng multiplex real-time PCR phát đột biến trên, tiến hành so sánh với kết xác định trình tự nhận thấy kết phát đột biến phản ứng multiplex real-time PCR có độ tƣơng đồng 100% so với phƣơng pháp giải trình tự Từ kết luận sử dụng probe đƣợc thiết kế tối ƣu thành công thành phần, chu trình phản ứng multilex real-time PCR phát đột biến liên quan kháng thuốc vi khuẩn lao 59 KẾT LUẬN Kết giải trình tự gen katG 82 chủng vi khuẩn lao kháng thuốc, 64 chủng kháng isoniazid, 46 chủng kháng rifampicin cho thấy, 65/82 (79,3%) mẫu xảy đột biến gen katG, đột biến xảy điểm nhiều điểm đoạn gen quan tâm, 47/64 (73,4%) chủng kháng INH xảy đột biến codon 315 Đối với gen rpoB, 51/82 (62,2%) chủng kháng thuốc cho thấy đột biến số vị trí riêng biệt vùng nóng 81 bp Trong tổng số 51 chủng kháng thuốc xảy đột biến vùng nóng 81 bp cho thấy đột biến xảy số vị trí codon khác nhau, thƣờng gặp vị trí codon 531 (37,5%) sau codon 526 (22,2%) Các mẫu nhạy cảm với thuốc kháng sinh chủng chuẩn quốc tế H37Rv không phát đột biến gen nghiên cứu Tối ƣu hóa thành công multiplex real-time PCR phát nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc Kết thử nghiệm phản ứng multiplex real-time PCR phát đột biến liên quan kháng thuốc có độ tƣơng đồng 100% so với phƣơng pháp xác định đột biến cách giải trình tự gen 60 KIẾN NGHỊ Cần nghiên cứu với số lƣợng chủng vi khuẩn lao lớn để đánh giá xác tỷ lệ, vị trí, tƣơng quan kháng thuốc đột biến xảy gen rpoB katG Thử nghiệm qui trình multiplex real-time PCR phát đồng thời đột biến (katG315, rpoB526 rpoB531) để phát vi khuẩn lao kháng thuốc (isoniazid rifampicin) cho sở khác để nâng cao hiệu chẩn đoán lao nƣớc 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Đức Anh (2001), Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch số thể bệnh lao, Luận án Tiến sĩ sinh học Nguyễn Đình Bảng (1992), Vi sinh vật y học, Nhà xuất Học viện Quân y Bộ Y tế, Trung tâm phòng chống lao quốc gia (2006), Báo cáo tổng kết chương trình chống lao quốc gia năm 2005, Nhà xuất Y học, Hà Nội Nguyễn Thị Chính, Trƣơng Thị Hòa (2005), Vi sinh vật y học, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Văn Hƣng (2001), Nghiên cứu số đặc điểm sinh học Mycobacterium tubeculosis phân lập Viện lao Bệnh phổi, Luận án Tiến sỹ Y học Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng điều trị, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội Phạm Hùng Vân (2009), PCR real-time PCR, vấn đề áp dụng thường gặp, Nhà xuất Y học, Thành phố Hồ Chí Minh Tiếng Anh Ahmad, S., Fares, E., Araj, G.F., Chugh, T.D., Mustafa, A.S (2002), ”Prevalence of S315T mutation within the katG gene in isoniazid-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Dubai and Beirut”, International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 6(10), pp 920-926 62 [...]... gây bệnh Hiện tƣợng kháng thuốc của vi khuẩn lao có thể xảy ra trƣớc khi xâm nhập (tiên phát) hoặc sau khi nhập vào cơ thể ngƣời bệnh (thứ phát) Vi khuẩn lao kháng thuốc tiên phát là hiện tƣợng lây nhiễm bởi một chủng đã kháng thuốc mà vi khuẩn này đã có sự đề kháng tự nhiên Vì vậy, bệnh nhân mắc lao do sự lây nhiễm này, ngay từ đầu vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể đã có sự đề kháng với thuốc đang sử... dụng Còn hiện tƣợng kháng thuốc thứ phát xảy ra đối với các chủng vi khuẩn lao ở bệnh nhân nào đó dùng 10 thuốc chống lao không đúng quy định, không đúng liều lƣợng, thời gian sử dụng thuốc do đó đã chọn lọc vi khuẩn lao khang thuốc [1, 38] Các chủng vi lao kháng thuốc đƣợc chia làm hai loại: (1) Các chủng lao kháng đa thuốc (MDR – TB): Là trƣờng hợp khi các chủng vi khuẩn lao kháng đồng thời hai thuốc. .. số vi khuẩn thuộc chi Mycobacterium, trƣớc hết là của vi khuẩn lao (M tuberculosis) và vi khuẩn phong (M leprae) có tầm quan trọng đặc biệt trong nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử hỗ trợ dịch tễ học, di truyền học và nghiên cứu kháng thuốc, số liệu đã đƣợc lƣu giữ tại một số trung tâm và có thể sử dụng một số chƣơng trình để truy cập khám phá và sử dụng [11, 53] 1.4 CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC Ở VI KHUẨN LAO. .. đoán phân tử bao gồm phân tích đột biến gen, tính đa hình DNA và phân tích định lƣợng, phản ứng multiplex real-time PCR rất hữu ích cho vi c phát hiện trực tiếp các đột biến của M tuberculosis từ các mẫu lâm sàng 22 Chƣơng 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn lao nhạy cảm với thuốc kháng sinh, kháng đơn thuốc (kháng một loại thuốc. .. Trong luận văn này, chúng tôi tập trung nghiên cứu cơ chế kháng đa thuốc, tức là trƣờng hợp vi khuẩn lao kháng đồng thời hai thuốc chống lao mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin, điều đó đồng nghĩa với vi c nghiên cứu các đột biến trên gen rpoB với katG 11 Hình 1.4 Cơ chế kháng đa thuốc của vi khuẩn lao (http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis) 1.4.3 Rifampicin và cơ chế kháng Rifampicin... đặc số khuẩn lạc mọc ở bệnh nhân kháng thuốc mắc phải là cao hơn và thời gian mọc 17 nhanh hơn so với kháng thuốc tiên phát và ở những bệnh nhân này số khuẩn lạc lại cao hơn ở bệnh nhân thông thƣờng [7] + Về đặc điểm kháng sinh đồ: kháng thuốc tiên phát thƣờng kháng hay kháng với nồng độ thấp, kháng thuốc mắc phải thƣờng kháng với nồng độ cao hơn Kháng thuốc tiên phát hay gặp với một thuốc, kháng thuốc. .. thời hai thuốc chống lao mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin (2) Các chủng lao kháng thuốc phổ rộng (XDR – TB): Là trƣờng hợp khi vi khuẩn lao đã ở tình trạng kháng đa thuốc và có thêm tính kháng một trong ba loại thuốc chống lao là capreomycin, kanamycin, amikacin [49] Ngày nay khi nghiên cứu về sinh học phân tử, ngƣời ta đã xác định đƣợc cơ chế kháng lại nhiều loại kháng sinh có liên quan... không khác nhiều với bệnh lao mà vi khuẩn nhạy cảm với thuốc 16 Trƣờng hợp nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc tiên phát có thể có triệu chứng cấp tính hơn, sốt cao hơn Đối với kháng thuốc mắc phải phần lớn gặp ở những bệnh nhân lao mạn tính, đƣợc điều trị ít nhất 2 lần Những bệnh nhân này cũng chiếm tỷ lệ chủ yếu trong số bệnh nhân lao kháng đa thuốc Hầu hết bệnh lao kháng đa thuốc bệnh tiến triển, hay... của các loại kháng sinh dùng điều trị chúng Thƣờng nói tới vi khuẩn lao kháng thuốc là nói tới những trƣờng hợp vi khuẩn lao kháng với một trong những thuốc chống lao dòng thứ nhất: isoniazid, rifampicin, pyrazinamide, ethambutol hoặc streptomycin [7, 35] Tính kháng thuốc bao gồm chủ yếu 3 nguyên nhân chính: - Thuốc hoặc các gen đích bị làm biến đổi trong các chủng kháng thuốc do đó các thuốc không... loại thuốc INH hoặc RIF), kháng đa thuốc (kháng ít nhất hai loại thuốc dòng thứ nhất là INH và RIF) và siêu kháng thuốc (kháng tất cả các thuốc chống lao hiện tại) đƣợc thu thập từ các vùng miền khác nhau nhƣ Bệnh vi n Phạm Ngọc Thạch (TP Hồ Chí Minh), Bệnh vi n Trung ƣơng Huế và bệnh vi n Lao và Bệnh phổi Trung ƣơng Các chủng lao đƣợc phân lập từ các loại bệnh phẩm của bệnh nhân lao nhƣ: đờm, dịch màng ... gen rpoB Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài: Nghiên cứu phát vi khuẩn lao kháng đa thuốc kỹ thuật sinh học phân tử Với mục tiêu nghiên cứu: phát nhanh chủng vi khuẩn lao kháng thuốc thông... bệnh lao Hiện nhiều nơi chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc dựa vào phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn làm kháng sinh đồ chủ yếu, nhiên, vi c ứng dụng sinh học phân tử tạo đột phá phát vi khuẩn lao kháng. .. hợp kháng đa thuốc 2% trƣờng hợp kháng thuốc phổ rộng Ở Vi t Nam, theo nghiên cứu Chƣơng trình Chống lao Quốc gia có 32,5% trƣờng hợp bệnh lao mang vi khuẩn lao kháng thuốc [1, 3] Vi khuẩn lao kháng