Luận văn nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Văn Bắc NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Lời cảm ơn! Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học – người thầy tận tình hướng dẫn, bảo, dìu dắt, giúp đỡ thời gian thực tập hoàn thành khóa luận Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thái Sơn Học viện Quân y tập thể cán phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho suốt thời gian thực tập hoàn thành khóa luận Qua đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo khoa Sinh học thầy cô giáo môn Sinh lý Thực vật Hóa sinh, trường Đại học KHTN hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho suốt trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin dành cho người thân gia đình bạn bè lòng biết ơn sâu sắc, người thân yêu bên tôi, động viên góp ý cho suốt trình học tập hoàn thành khóa luận Học viên Nguyễn Văn Bắc Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Bp : Base pairs CNSH : Công nghệ sinh học CTCLQG : Chương trình chống lao quốc gia DNA : Acit deoxyribonucleic dNTPs : Deoxyribonucleotide Triphosphate EDR : Extensively drug resitant (Kháng thuốc mở rộng) EMB : Ethambutol HRS : Ba loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin HRSE : Bốn loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin ethambutol INH : Isoniazid IPTG : Isopropyl-thio-β-D-galactoside Kb : Kilo base LB : Luria - Bertani MDR : Multidrugs resistant (Kháng đa thuốc) PAS : Paraminosalicylic acid PAZ : Pyrazinamid PCR : Polymerase Chain Reaction RMP : Rifampicin RNA : Acid Ribonucleic RRDR : Rifampin resistance determining region (Vùng định kháng rifampicin) Taq polymerase : Thermus aquaticus DNA polymerase TCYTTG : Tổ chức Y tế Thế giới V : Volume (thể tích) X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc MỤC LỤC Kết phát hiện đột biến 68 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc MỞ ĐẦU Bệnh lao vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) biết rõ từ kỷ Hiện tỷ lệ nhiễm lao ước tính 1/3 dân số giới, khoảng triệu người mắc lao mới triệu người chết lao năm Bệnh lao trở nên nghiêm trọng với xuất hiện các chủng lao kháng đa thuốc (Multi-Drugs Resistant - MDR), tức thể lao với vi khuẩn kháng hai loại thuốc chống lao mạnh isoniazid (INH) rifampicin (RMP) Theo số liệu thống kê chương trình chống lao Quốc gia năm 2007, giới có khoảng 511.000 trường hợp nhiễm lao kháng đa thuốc, có 130.000 trường hợp tử vong Do khó khăn việc điều trị bệnh nhân mang các chủng lao kháng thuốc phổ rộng đa kháng mà việc phát hiện sớm các chủng lao kháng đa thuốc trở nên quan trọng điều trị bệnh lao Hiện nhiều nơi chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc dựa vào phương pháp nuôi cấy vi khuẩn làm kháng sinh đồ chủ yếu, nhiên, việc ứng dụng sinh học phân tử tạo đột phá phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc Cơ chế kháng thuốc ở vi khuẩn lao quá trình tiến hóa, có nhiều đột biến xuất hiện số gen chức năng, trước hết ở gen rpoB katG Thời gian chẩn đoán rút ngắn vài ngày, với độ nhạy độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện cho kiểm soát bệnh lao dễ dàng Các nghiên cứu sinh học phân tử chẩn đoán lao kháng thuốc loại kháng thuốc xuất hiện các đột biến gen tương ứng chịu trách nhiệm Chính vì việc xác định các trường hợp nhiễm lao kháng thuốc thường kèm với chẩn đoán phát hiện đột biến gen đối với các chủng lao phát hiện Các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid có liên quan tới đột biến tại codon 315 gen katG, đối với các chủng kháng rifampicin xuất hiện các đột biến ở vùng nóng gồm 27 codon nằm gần trung tâm gen rpoB Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc vi khuẩn lao kháng đa thuốc kỹ thuật sinh học phân tử” Với mục tiêu nghiên cứu: phát nhanh chủng vi khuẩn lao kháng thuốc thông qua xác định vị trí đột biến liên quan kháng thuốc gen katG rpoB phương pháp giải trình tự kỹ thuật multiplex real-time PCR Để đạt mục tiêu đề tài, tiến hành số nội dung nghiên cứu sau: Xác định trình tự gen rpoB katG Phân tích đặc điểm phân tử các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc phân lập tại Việt Nam sở trình tự nucleotide hai gen rpoB katG Tối ưu hóa thành phần chu trình kit multiplex real-time PCR phát hiện nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Chương – TỔNG QUAN 1.1 BỆNH LAO Lao (Tuberculosis) bệnh truyền nhiễm mạn tính, tình trạng nhiễm vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis, thường gặp ở phổi ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương (lao màng não), hệ bạch huyết, hệ tuần hoàn (lao kê), xương khớp Bệnh lao gắn liền với phát triển xã hội loài người từ hàng ngàn năm nay, giới chưa không quốc gia nào, khu vực nào, dân tộc người mắc chết vì bệnh lao Trực khuẩn lao lần bác sĩ Robert Koch phát hiện vào ngày 24/3/1882 Trong thời gian ở Mỹ châu Âu, cứ người thì có người chết vì lao, vậy, phát hiện Robert Koch bước ngoặt quan trọng việc khống chế loại trừ bệnh Trước đây, lao xem bệnh truyền nhiễm nguy hiểm giới, lưu hành với tỷ lệ mắc bệnh khá cao, đặc biệt ở các nước thuộc châu Phi khu vực châu Á, có Việt Nam Việt Nam đứng thứ 12 22 nước có số bệnh nhân lao cao toàn cầu Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc Philippines số bệnh nhân lao, số bệnh nhân lao xuất hiện năm Hiện nguy nhiễm lao ở nước ta năm ước tính 1,5% dân số (ở các tỉnh phía Nam 2%, ở các tỉnh phía Bắc 1%) Trên thực tế số nguy nhiễm lao hàng năm cao 1,5%, vậy, các số nêu lớn Điều tăng thêm khó khăn đối với công tác phòng chống lao các năm tới mà thời gian khá dài, đến hàng chục năm, ở thiên niên kỷ mới [3, 35] 1.2 TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC Bệnh lao ngày trở nên phức tạp có ảnh hưởng nặng nề xuất hiện thêm vi khuẩn lao kháng thuốc tạo nên dạng bệnh khó phòng chống Các chủng Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc lao kháng thuốc chia làm hai thể, lao kháng đa thuốc (Multi-drugs resistant - MDR) lao kháng thuốc phổ rộng (Extensively drug resistant - XDR), chủng vi khuẩn lao kháng thuốc nguồn lây nhiễm mối đe dọa cho sức khỏe cộng đồng Theo ước tính Tổ chức Y tế giới (WHO), giới có khoảng 42 vạn người mắc lao kháng đa thuốc, chiếm số lượng lớn ở khu vực Tây Thái Bình Dương có 15 vạn trường hợp, khu vực Đông Nam Á sau khu vực Châu Phi Đông Âu Một số chủng lao vừa kháng đa thuốc vừa kháng thuốc phổ rộng, coi loại siêu kháng thuốc [17] Tình hình lao siêu kháng thuốc ngày trở nên trầm trọng, từ tháng 11/2004 đến 11/2005, WHO Trung tâm Kiểm soát Bệnh Hoa Kỳ phân tích 17.890 mẫu đờm gửi từ 40 quốc gia toàn giới, thấy có 20% trường hợp kháng đa thuốc 2% trường hợp kháng thuốc phổ rộng Ở Việt Nam, theo nghiên cứu Chương trình Chống lao Quốc gia thì có 32,5% các trường hợp bệnh lao mới mang vi khuẩn lao kháng thuốc [1, 3] Vi khuẩn lao kháng thuốc thách thức lớn, đe dọa công phòng chống lao toàn cầu, vì các thuốc chống lao có hiệu hiện bị vi khuẩn lao kháng lại kháng đa thuốc [10] Thuốc chống lao có nhiều loại, tác dụng thuốc trực khuẩn lao không giống Hiện người ta chia thuốc chống lao thành hai loại: (1) các thuốc chống lao chủ yếu (còn gọi các thuốc chống lao loại một, thuốc chống lao hàng đầu), (2) các thuốc chống lao thứ yếu (còn gọi các thuốc chống lao loại hai, thuốc chống lao hàng thứ hai) Trong các thuốc chống lao loại thuốc có hiệu độc tính nhất, thì các thuốc chống lao hàng thứ hai thuốc có tác dụng lại có độc tính cao giá thành đắt Ở New York, chi phí điều trị bệnh nhân nhạy với thuốc 2.000 USD điều trị bệnh nhân kháng thuốc hết 250.000 USD Hiện số tử vong hàng năm lao giới lớn số tử vong HIV, sốt rét các bệnh nhiệt đới cộng lại Tổ chức Y tế Thế giới nhận định bệnh lao hiện quay trở lại trở Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc nên tồi tệ bởi kháng thuốc vi khuẩn lao [17] Thuốc kháng sinh dùng để điều trị lao streptomycin, vài năm sau kháng sinh sử dụng thì người ta nhận thấy hiện tượng đề kháng lại streptomycin vi khuẩn lao Sau các kháng sinh chống lao khác tiếp tục đời: para – aminosalysilic, isoniazid, rifampicin không mang lại hiệu sau thời gian điều trị định [7] Nghiên cứu tìm kiếm hoá dược mới có hiệu điều trị lao, đặc biệt lao kháng thuốc luôn thực hiện ngày có nhiều hợp chất chống lao mới đưa vào sử dụng, ví dụ, gần linezolid [43] Tuy nhiên, theo chế áp lực, vi khuẩn không ngừng biến đổi tạo nên nhiều chủng mới có khả kháng thuốc nhanh chóng [52] Khả điều trị thành công đạt 95-100% đối với bệnh nhân mắc lao thông thường, tỷ lệ thành công với bệnh nhân mắc lao kháng thuốc 20 – 30%, chí không điều trị mắc lao kháng đa thuốc kháng thuốc phổ rộng dùng kết hợp đến năm loại kháng sinh điều trị lao Vì vậy, việc phát hiện ngăn chặn lan truyền các chủng lao kháng đa thuốc vấn đề quan trọng điều trị lao hiện [7, 10, 35] 1.3 VI KHUẨN LAO 1.3.1 Cấu tạo Trực khuẩn lao có dạng hình que, thân mảnh dẻ, nha bào, kích thước - µm, dày 0,3 µm, kháng cồn, kháng acid (hình 1.1) Khi nhuộm phương pháp Ziehl - Neelsen, trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, không bị cồn acid làm màu carbonfuchsin Ở môi trường nuôi cấy có độ acid đậm đặc định, trực khuẩn lao phát triển được, vì vậy, chúng gọi trực khuẩn kháng cồn, kháng toan (acid fast bacilli - AFB), đặc điểm nổi bật vi khuẩn thuộc chi mycobacteria Đặc điểm quan trọng để phát hiện trực khuẩn lao phương pháp hình thái học (nhuộm màu) các mẫu bệnh phẩm Một số giả thiết cho Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc mức kháng acid độ dài các chuỗi mycolic acid M tuberculosis có khả thể hiện tất các chế cần thiết để tổng hợp các vitamin, amino acid các enzyme cofactor thiết yếu tế bào Mycobacteria có cấu trúc gần giống với vi khuẩn Gram dương chúng không xếp vào loại vi khuẩn Gram dương các phân tử gắn với thành tế bào lipid chứ protein hay polysaccharide Do đó, chúng không giữ lại tinh thể màu tím xuất hiện nhuộm Gram [2, 5, 37, 38] Trực khuẩn lao hiếu khí, phát triển tốt ở 37 oC dưới áp suất O 100 mmHg Đỉnh phổi vùng phổi dưới xương đòn thường hay mắc lao vì có áp suất O2 từ 120 – 130 mmHg (khi đứng) đến thân xương đầu xương vì áp suất O ở 100 mmHg Lách, gan, dạ dày, thực quản mắc lao vì áp suất O thấp Trực khuẩn lao sinh sản chậm, cứ 20 mới có lần phân chia tế bào, điều kiện phòng thí nghiệm thì cứ 12 đến 24 M tuberculosis phân chia lần môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng Loewenstein [46] Tốc độ phát triển chậm tính thẩm thấu thành tế bào hạn chế việc hấp thụ chất dinh dưỡng liên quan đến tốc độ tổng hợp ribosome (Hình 1.2) Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc thấy kết phát hiện đột biến phản ứng multiplex real-time PCR có độ tương đồng 100% so với phương pháp giải trình tự Từ kết luận sử dụng các probe thiết kế tối ưu thành công các thành phần, chu trình phản ứng multilex real-time PCR phát hiện đột biến liên quan kháng thuốc ở vi khuẩn lao KẾT LUẬN Kết giải trình tự gen katG 82 chủng vi khuẩn lao kháng thuốc, 64 chủng kháng isoniazid, 46 chủng kháng rifampicin cho thấy, 65/82 (79,3%) mẫu xảy đột biến gen katG, đột biến xảy ở điểm nhiều điểm đoạn gen quan tâm, 47/64 (73,4%) chủng kháng INH xảy đột biến tại codon 315 Đối với gen rpoB, 51/82 (62,2%) chủng kháng thuốc cho thấy đột biến tại số vị trí riêng biệt vùng nóng 81 bp Trong tổng số 51 chủng kháng thuốc xảy đột biến tại vùng nóng 81 bp cho thấy đột biến xảy số vị trí codon khác nhau, thường gặp tại vị trí codon 531 (37,5%) sau codon 526 (22,2%) Các mẫu nhạy cảm với thuốc kháng sinh chủng chuẩn quốc tế H37Rv không phát hiện đột biến gen nghiên cứu Tối ưu hóa thành công multiplex real-time PCR phát hiện nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc Kết thử nghiệm phản ứng multiplex real-time PCR phát hiện đột biến liên quan kháng thuốc có độ tương đồng 100% so với phương pháp xác định đột biến cách giải trình tự gen 70 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc KIẾN NGHỊ Cần nghiên cứu với số lượng chủng vi khuẩn lao lớn để đánh giá xác tỷ lệ, vị trí, tương quan kháng thuốc các đột biến xảy gen rpoB katG Thử nghiệm qui trình multiplex real-time PCR phát hiện đồng thời đột biến (katG315, rpoB526 rpoB531) để phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc (isoniazid rifampicin) cho các sở khác để nâng cao hiệu chẩn đoán lao nước 71 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Đức Anh (2001), Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch số thể bệnh lao, Luận án Tiến sĩ sinh học Nguyễn Đình Bảng (1992), Vi sinh vật y học, Nhà xuất Học viện Quân y Bộ Y tế, Trung tâm phòng chống lao quốc gia (2006), Báo cáo tổng kết chương trình chống lao quốc gia năm 2005, Nhà xuất Y học, Hà Nội Nguyễn Thị Chính, Trương Thị Hòa (2005), Vi sinh vật y học, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Văn Hưng (2001), Nghiên cứu số đặc điểm sinh học Mycobacterium tubeculosis phân lập Viện lao Bệnh phổi, Luận án Tiến sỹ Y học Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng điều trị, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội Phạm Hùng Vân (2009), PCR real-time PCR, vấn đề áp dụng thường gặp, Nhà xuất Y học, Thành phố Hồ Chí Minh 72 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Tiếng Anh Ahmad, S., Fares, E., Araj, G.F., Chugh, T.D., Mustafa, A.S (2002), ”Prevalence of S315T mutation within the katG gene in isoniazid-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Dubai and Beirut”, International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 6(10), pp 920-926 10 Ahmad, S., Mokaddas, E (2009), “Recent advances in the diagnosis and treatment of multidrug-resistant tuberculosis”, Respir Med, 103(12), pp 1777-1790 11 Ambur, O.H., Davidsen, T., Frye, S.A., Balasingham, S.V., Lagesen, K., Rognes, T., Tønjum, T (2009), “Genome dynamics in major bacterial pathogens”, FEMS Microbiol Rev, 33(3), pp 453-470 12 Ani, A.E (2008), “Advances in the laboratory diagnosis of Mycobacterium tuberculosis”, Ann Afr Med, 7(2), pp 57-61 13 Argekar, A.P., Kunjir, S.S., Purandare, K.S (1996), “Simultaneous determination of rifampicin, isoniazid and pyrazinamid by high performance thin layer chromatography”, J Pharm Biomed Anal., 14, pp 1645-1650 14 Asgharzadeh, M., Kafil, H.S (2007), ”Current trends in molecular epidemiology studies of Mycobacterium tuberculosis”, Biotechnol Mol Biol Rev., 2(5), pp 108-115 15 Aslan, G., Tezcan, S., Serin, M.S., Emekdas, G (2008), ”Genotypic analysis of isoniazid and rifampicin resistance in drug-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis complex isolates in southern Tukey”, Jpn J Infect Dis., 61(4), pp 255-60 16 Bahrmand, A.R., Titov, L.P., Tasbiti, A.H., Yari, S., Graviss, E.A (2009), “High-level rifampin resistance correlates with multiple mutations in the rpoB gene of pulmonary tuberculosis isolates from the Afghanistan border of Iran”, J Clin 73 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Microbiol., 47(9), pp 2744-2750 17 Balganesh, T.S., Alzari, P.M., Cole, S.T (2008), “Rising standards for tuberculosis drug development” Trends Pharmacol Sci., 29(11), pp 576-581 18 Barry, C.E., Boshoff, H.I., Dartois, V., Dick, T., Ehrt, S., Flynn, J., Schnappinger, D., Wilkinson, R.J, Young, D (2009), “The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies”, Nat Rev Microbiol., 7(12), pp 845-855 19 Borrell, S., Gagneux, S (2009), “Infectiousness, reproductive fitness and evolution of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis”, Int J Tuberc Lung Dis., 13(12), pp 1456-1466 20 Campbell, E.A., Korzheva, N., Mustaev, A., Murakami, K., Nair, S., Goldfarb, A., Darst, S.A (2001), ”Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacteria RNA polymerase”, J Cell 104, pp 901-912 21 Caws M., Duy, P.M., Tho, D.Q., Lan, N.T.N., Hoa, D.V., Farrar, J (2006), ”Mutations prevalent among rifampicin and isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from a hospital in Vietnam”, J Clin Microbiol., 44, pp 2333-2337 22 Cavusoglu, C., Hilmioglu, S., Guneri, S., Bilgic, A (2002), ”Characterization of rpoB mutations in rifampin – resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from Turkey by DNA sequencing and line probe assay” J Clin Microbiol 40, pp 4435-4438 23 Chan, E.D., Bai, X., Kartalija, M., Orme, I.M., Ordway, D.J (2010), “Host immune response to rapidly-growing mycobacteria, an emerging cause of chronic lung disease”, Am J Respir Cell Mol Biol., [Epub ahead of print] 24 Cooksey, R., Morlock, G., Glickman, S., Crawford J (1997), “Evaluation of a line 74 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc probe assay kit for characterization of rpoB mutations in refampin resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from New York city”, J Clin Microbiol., 35(5), pp 1281-1283 25 Dale, J.W., Nor, R.M., Ramayah, S., Tang, T.H., Zainuddin, Z.F (1999), “Molecular epidemiology of tuberculosis in Malaysia”, J Clin Microbiol., 37(5), pp 1265-1268 26 de Viedma, D.G., Infantes, S.M.D., Lasala, F., Chaves, F., Alcala, L., Bouza, E (2002), “New real-time PCR able to detect in a single tube multiple rifampin resistance mutations and high-level isoniazid resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis”, J Clin Microbiol., 40, pp 988-995 27 Espasa, M., González-Martín J., Alcaide, F., Aragón, L.M., Lonca, J., Manterola, J.M., Salvadó, M., Tudó, G., Orús, P., Coll, P (2005), “Direct detection in clinical samples of multiple gene mutations causing resistance of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampicin using fluorogenic probes” J Antimicrob Chemother., 55(6), pp 860-865 28 Espitia, C., Laclette, J.P., Mondragón-Palomino, M., Amador, A., Campuzano, J., Martens, A., Singh, M., Cicero, R., Zhang, Y., Moreno, C (1999), “The PE-PGRS glycine-rich proteins of Mycobacterium tuberculosis: a new family of fibronectin-binding protein”, Microbiology, 145, pp 3487-3495 29 Hahn, Y., Shin, S (2001), “Electrochemical behavior and diffenrential pulse polarographic determination of rifampicin in pharmaceutical preparations”, Arch Pharma Res., 24(2), pp 100-104 30 Hillemann, D., Weizenegger, M., Kubica, T., Richter, E., Niemann, S (2005), “Use of the genotype MTBDR assay for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis complex isolates”, J Clin Microbiol., 75 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc 43(8), pp 3699-3703 31 Marín, M., García de Viedma D., Ruíz-Serrano, M.J., Bouza, E (2004), “Rapid Direct Detection of Multiple Rifampin and Isoniazid Resistance Mutations in Mycobacterium tuberculosis in Respiratory Samples by Real-Time PCR” Antimicrob Agents Chemother., 48(11), pp 4293-4300 32 Matsiota-Bernard, P., Vrioni, G., and Marinis, E (1998), “Characterization of rpoB Mutations in Rifampin-Resistant Clinical Mycobacterium tuberculosis Isolates from Greece”, J Clin Microbiol., 36, pp 20–23 33 Miotto, P., Piana, F., Penati, V., Canducci, F., Migliori, G.B., Daniela Maria Cirillo, D.M (2006), “Use genotype MTBDR assay for molecular detection of refampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical strains isolates in Italy”, J Clin Microbiol., 44, pp 2485-2491 34 Mokrousov, I., Otten, T., Vyshnevsky, B., Narvskaya, O (2003), “Allele-specific rpoB PCR assays for detection of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis in sputum smears”, Antimicrob Agents Chemother, 47, pp 22312235 35 Musser, J.M (1995), “Antimicrobial agent resistance in Mycobacteria: Molecular Genetic Insights”, Clinical Microbiology Review, 8(4), pp 496-514 36 Naga, S., Urvashi, B.S., Jyoti, A., Jitendra, N.P., Pradeep, S., Jyotish, C.S (2006), “Rapid detection of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis by inhouse, reverse line blot assay”, Diagn Microbio Infect Dis., 56(2), pp 133140 37 Noordhoek, G.T., Kaan, J.A., Mulder, S., Wilke, H., Kolk, A.H (1995), “Routine application of the polymerase chain reaction for detect of Mycobacterium tuberculosis in clinal samples”, J Clin Pathol., 48, pp 810-814 76 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc 38 Palomino, J.C., Leao, S.C., Ritacco, V (2007), Tuberculosis 2007 - from basic science to patient care www.tubercuosistextbook.com 39 Qian, L., Abe, C., Lin, T.P., Lin, T.P., Yu, M.C., Cho, S.N., Wang, S., Douglas, J.T (2002), “rpoB genotypes of Mycobacterium tuberculosis Beijing family isolates from East Asian countries” J Clin Microbiol., 40, pp 1091-1094 40 Ramaswamy, S., and Musser, J.M (1998), “Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium Tuberculosis” Tuber Lung Dis., 79(1), pp 3-29 41 Rattan, A., Kalia, A., Ahmad (1998), ”Multidrug - resistant Mycobacterium tuberculosis” Emerg Infect Dis., 4(2), pp 195-209 42 Sajduda, A., Brzostek, A., Poplawska, M., Augustynowicz-Kopee, E., Zwolska, Z., Niemann, S., Dziadek, J., Hillemann, D (2004), ”Molecular Characrerization of Rifampin and Isoniazid-Resistant Mycobacterium tuberculosis Strains Isolated in Poland”, J Clin Micobiol, pp 2425-2431 43 Schecter, G.F., Scott, C., True, L., Raftery, A., Flood, J., Mase, S (2010), “Linezolid in the treatment of multidrug-resistant tuberculosis”, J Clin Infect Dis 50(1), pp 49-55 44 Scholossberg, D (2006), Tuberculosis and nontuberculus Mycobacteria infections, Fifth edition McGraw-Hill, Medical Publishing Division 45 Shin, S.S., Naroditskaya, V., Sloutsky, A., Werner, B., Timperi, R., Bayona, J., Farmer, P.E., Becerra, M.C (2005), ”rpoB gene mutations in clinical isolates of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis in Northern Lima, Peru”, Microb Drug Resist, 11(1), pp 26-30 46 Shitrit, D., Vertenshtein, T., Shitrit, A.B., Shlomi, D., Kramer, M.R., (2005), “The role of routine culture for tuberculosis during bronchoscopy in a nonendemic 77 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc area: analysis of 300 cases and review of the literature”, Infect Control 33(10), pp 602-605 47 Telenti, A., Imboden, P., Marchesi, F., Lowrie, D., Cole, S., Colston, M.J., Matter, L., Schopfer, K., Bodmer, T (1993), ”Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis”, Lancet 341, pp 647-650 48 W.H.O (2004), “Anti-tuberculosis drug resistant in the world”, WHO Report No 2, http://www.who.int/tb/piblication/who_htm_tb_2004_343/en/ 49 W.H.O., (2007), “Global tuberculosis control surveillance, planning, financing”, WHO Report 2007 50 Wada, T., Maeda, S., Tamaru, A., Imai, S., Hase, A., Kobayashi, K (2004), “DualProbe Assay for Rapid Detection of Drug-Resistant Mycobacterium tuberculosis by Real-Time PCR” J Clin Microbiol, 42(11), pp 5277-5285 51 Woodford, N., Ellington, M.J (2007), “The emergence of antibiotic resistance by mutation”, J Clin Microbiol Infect., 13(1), pp 5-18 52 Zhang, Y., Yew, W.W (2009), “Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis”, Tuberc Lung Dis., 13(11), pp 1320-1330 53 Zhu, X., Chang, S., Fang, K., Cui, S., Liu, J., Wu, Z., Yu, X., Gao, G.F., Yang, H., Zhu, B., Wang, J (2009), “MyBASE: a database for genome polymorphism and gene function studies of Mycobacterium”, BMC Microbiol, pp 9: 40 78 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc PHỤ LỤC Phụ lục Các công trình khoa học có liên quan tới luận văn đã công bố Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Văn Bắc, Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Trung Nam, Chu Hoàng Hà, Nguyễn Thái Sơn (2009) Chẩn đoán các chủng vi khuẩn lao kháng rifampicin phương pháp xác định đột biến gen rpoB Tạp chí Công nghệ Sinh học 7(2): 251-256 Nguyễn Văn Bắc, Nguyễn Hữu Cường, Chu Hoàng Hà, Lã Duy Anh, Nguyễn Thái Sơn, Nghiêm Ngọc Minh (2009) Xác định các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid phương pháp xác định đột biến gen katG Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 749-752 Nguyễn Văn Bắc, Cung Thị Ngọc Mai, Nghiêm Ngọc Minh (2010) Đặc điểm phân tử các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid phân lập tại miền Nam – Việt Nam Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3A): 741-745 Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Văn Bắc (2010) Vi khuẩn lao kháng thuốc các phương pháp phát hiện Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(2): 133-144 79 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Phụ lục Danh sách mẫu DNA tách từ chủng vi khuẩn lao Học viện Quân Y cung cấp DANH SÁCH MẪU DNA TÁCH TỪ CHỦNG VI KHUẨN LAO - BỆNH VIỆN LAO-BỆNH PHỔI TRUNG ƯƠNG Các chủng kháng đơn thuốc STT Mã DNA KQ KSĐ Mã chủng 10 11 12 13 14 15 ĐO1-02 ĐO2-02 ĐO3-02 ĐO4-02 ĐO5-02 ĐO6-02 ĐO7-02 ĐO8-02 ĐO9-02 ĐO10-02 ĐO11-02 ĐO12-02 ĐO13-02 ĐO14-02 ĐO15-02 H H H H H H H S S S S S S S S TB02-53 TB02-54 TB02-56 TB02-51 TB02-52 TB02-55 TB02-57 TB02-68 TB02-71 TB02-75 TB02-76 TB02-77 TB02-79 TB02-80 TB02-81 Các chủng kháng đa thuốc STT Mã DNA KQ KSĐ ĐA1-02 ĐA2-02 ĐA3-02 ĐA4-02 ĐA5-02 ĐA6-02 HRS HRS HRS HRS HRS HRS Mã chủng TB02-101 TB02-105 TB02-107 TB02-110 TB02-111 TB02-112 80 Nồng độ DNA (ng/ul) 9,8 13,0 34,8 6,0 20,7 30,8 10,4 11,7 18,5 20,0 19,7 20,7 9,3 22,8 32,3 OD260/280 Nồng độ DNA (ng/ul) 44,0 7,2 6,8 18,5 8,2 8,0 OD260/280 1,83 2,06 1,70 2,79 1,67 1,64 1,65 1,84 1,79 1,72 1,80 1,79 1,91 1,76 1,74 1,89 2,1 2,06 1,94 1,8 2,1 Luận văn thạc sĩ 10 11 12 13 14 15 ĐA7-02 ĐA8-02 ĐA9-02 ĐA10-02 ĐA11-02 ĐA12-02 ĐA13-02 ĐA14-02 ĐA15-02 Nguyễn Văn Bắc HRS HRS HRS HRS HRS HRS HRS HRSE HRSE TB02-113 TB02-115 TB02-116 TB02-117 TB02-118 TB02-122 TB02-124 TB02-130 TB02-133 36,3 5,7 5,2 6,9 14,0 7,2 10,1 9,8 6,8 1,76 1,89 1,98 1,91 1,85 1,80 1,92 2,06 1,77 DANH SÁCH MẪU DNA TÁCH TỪ CHỦNG VI KHUẨN LAO- BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG HUẾ Các chủng kháng đơn thuốc STT 10 11 12 13 14 15 Mã DNA ĐO1-05 ĐO2-05 ĐO3-05 ĐO4-05 ĐO5-05 ĐO6-05 ĐO7-05 ĐO8-05 ĐO9-05 ĐO10-05 ĐO11-05 ĐO12-05 ĐO13-05 ĐO14-05 ĐO15-05 KQ KSĐ S H S S S S H H S H S S H S S Mã chủng Nồng độ OD260/280 TB05-49 TB05-79 TB05-84 TB05-109 TB05-110 TB05-116 TB05-130 TB05-214 TB05-223 TB05-231 TB05-237 TB05-243 TB05-266 TB05-278 TB05-283 DNA (ng/ul) 15.19 16,9 6,5 39,5 33,3 41,5 12.0 20.1 38.4 84.2 129.7 53.2 30.0 22.0 74.8 1.64 1,84 1,39 1,71 1,75 1,74 1.79 1.91 1.79 1.69 1.52 1.75 1.58 2.14 1.83 Các chủng kháng đa thuốc 81 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc STT Mã DNA KQ KSĐ Mã chủng 10 11 12 13 14 15 ĐA1-05 ĐA2-05 ĐA3-05 ĐA4-05 ĐA5-05 ĐA6-05 ĐA7-05 ĐA8-05 ĐA9-05 ĐA10-05 ĐA11-05 ĐA12-05 ĐA13-05 ĐA14-05 ĐA15-05 HS HS HRSE HRS HRS HS HRSE HRSE HRSE HS HS HRS HS HRSE HR TB05-1 TB05-77 TB05-97 TB05-108 TB05-117 TB05-138 TB05-146 TB05-147 TB05-172 TB05-199 TB05-213 TB05-220 TB05-221 TB05-225 TB05-254 Nồng độ DNA (ng/ul) 46,3 5.21 3,6 49,2 24,3 28.93 110,4 77,6 10.86 7.75 18.7 28.9 73.3 26.4 28.2 OD260/280 1,55 2.02 1,37 1,69 1,60 1.41 1,59 1,59 1.52 2.11 1.59 2.01 2.00 2.06 1.68 DANH SÁCH MẪU DNA TÁCH TỪ CHỦNG VI KHUẨN LAO- BỆNH VIỆN PHẠM NGỌC THẠCH Các chủng nhạy cảm với thuốc kháng sinh Stt Mã DNA 10 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 KQ Kháng sinh đồ Mã chủng TB06-140 TB06-143 TB06-144 TB06-145 TB06-146 TB06-147 TB06-148 TB06-149 TB06-150 TB06-151 82 Nồng độ DNA (ng/ul) 66.9 82.3 67.8 60.9 38.5 32.7 4.7 19.1 57.8 62.0 OD260/280 1.72 1.89 1.96 2.0 1.85 1.94 1.79 1.96 1.86 1.98 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Các chủng kháng đơn thuốc Stt Mã KQ Kháng DNA sinh đồ Mã chủng 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 TB06-105 TB06-107 TB06-113 TB06-115 TB06-121 TB06-128 TB06-133 TB06-134 TB06-141 TB06-142 TB06-157 TB06-161 TB06-162 TB06-164 TB06-165 ĐO1 ĐO2 ĐO3 ĐO4 ĐO5 ĐO6 ĐO7 ĐO8 ĐO9 ĐO10 ĐO11 ĐO12 ĐO13 ĐO14 ĐO15 S H S S H S R S H S H H S S S Các chủng kháng đa thuốc Stt Mã KQ Kháng DNA sinh đồ Mã chủng 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 TB06-22 TB06-23 TB06-26 TB06-27 TB06-28 TB06-31 TB06-33 TB06-35 TB06-36 TB06-37 TB06-38 TB06-39 TB06-41 TB06-51 ĐA1 ĐA2 ĐA3 ĐA4 ĐA5 ĐA6 ĐA7 ĐA8 ĐA9 ĐA10 ĐA11 ĐA12 ĐA13 ĐA14 HSRE HSRE HSRE HSR HSRE HSRE HSRE HSR HSRE HSRE HSR HSRE HSRE HSRE 83 Nồng độ DNA (ng/ul) 52.8 50.6 10.8 3.6 13.0 304 4.5 6.1 8.2 120.6 6.7 57.4 31.4 3.5 66.5 OD260/280 Nồng độ DNA (ng/ul) 13.4 8.9 4.9 5.0 12.0 3.8 3.4 4.5 10.3 72.9 7.7 8.0 36.8 43.9 OD260/280 1.74 1.59 1.76 2.25 1.68 1.85 2.89 2.36 2.2 1.91 2.01 1.85 1.90 1.46 1.91 1.89 1.82 1.86 1.8 1.8 2.08 1.56 1.75 1.99 1.77 1.98 1.9 1.73 1.74 Luận văn thạc sĩ 40 ĐA15 Nguyễn Văn Bắc HSRE TB06-82 Các chủng siêu kháng thuốc Stt Mã KQ Kháng sinh đồ DNA Kháng dòng Kháng dòng 41 42 43 44 45 46 S1 S2 S3 S4 S5 S6 HSRE HSRE HSRE HSRE HSRE HSRE 47 48 S7 S8 HSRE HSRE 49 S9 HSRE 50 S10 HSRE 51 S11 HSRE 52 S12 HSRE 53 S13 HSRE 54 S14 HSRE 55 S15 HSRE 5.5 1.91 Mã chủng Nồng độ DNA (ng/ul) OD260/280 TB06-24 TB06-25 TB06-29 TB06-30 TB06-32 TB06-34 88.1 14.1 3.8 103.2 12.9 14.0 1.83 1.95 1.75 1.85 1.52 1.83 TB06-40 TB06-204 26.7 18.9 1.57 1.83 TB06-205 19.7 1.92 TB06-217 4.7 2.12 TB06-218 4.8 2.88 TB06-219 19.3 2.07 TB06-221 17.3 1.84 TB06-222 28.2 1.85 TB06-223 14.4 2.07 PAS Ofx Cs Ofx,Eto Ofx, Th Ofx,Eto,Km, PAS Ofx Ofx,Cs,Eto, Km,PAS Ofx,Eto,Cs, PAS Ofx,Cs,Km, PAS Ofx,Eto,Cs, Km,PAS Ofx,Eto,Cs, Km,PAS Ofx,Th,Cs,K m,PAS Ofx,Th,Eto, Cs, Km,PAS Ofx,Th,Eto, Cs, Km,PAS 84 [...]... polymerase [7, 25] Trong luận văn này, chúng tôi tập trung nghiên cứu cơ chế kháng đa thuốc, tức là trường hợp vi khuẩn lao kháng đồng thời hai thuốc chống lao mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin, điều đó đồng nghĩa với vi ̣c nghiên cứu các đột biến trên gen rpoB với katG 12 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Hình 1.4 Cơ chế kháng đa thuốc của vi khuẩn lao (http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis... lớn hơn - Xét nghiệm vi khuẩn: + Về hình thể: các vi khuẩn bình thường có cấu tạo thành tế bào 3 lớp nhưng ở vi khuẩn kháng thuốc thành tế bào có cấu tạp 4 lớp (vi khuẩn có thêm một lớp peptidoglycolipid ở ngoài cùng) Vi khuẩn kháng với rifampicin có thành tế bào cũng dày hơn hẳn so với vi khuẩn nhạy với thuốc Khuẩn lạc của vi 20 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc khuẩn kháng thuốc... xác cho vi ̣c phát hiện các chủng M tuberculosis kháng isoniazid 19 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc 1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC 1.5.1 Đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm cận lâm sàng *) Đặc điểm lâm sàng Nhìn chung các dấu hiệu lâm sàng của bệnh lao có vi khuẩn kháng thuốc không khác nhiều với bệnh lao mà vi khuẩn nhạy cảm với thuốc Trường hợp nhiễm vi khuẩn lao kháng.. .Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Hình 1.1 Hình dạng của tế bào M tuberculosis (http://www.diseasedetectives.org/micro be_gallery/tuberculosis) Hình 1.2 Tế bào vi khuẩn lao phát triển trong môi trường nuôi cấy (http://abcnews.go.com/Health/Germs/st ory?id=3079114&page=1) Trực khuẩn lao có cấu tạo rất phức tạp, hoàn hảo mà ít vi sinh vật nào có được Dưới kính hiển vi điện tử trực khuẩn lao có... năng giết chết vi khuẩn gây bệnh Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn lao có thể xảy ra trước khi xâm nhập (tiên phát) hoặc sau khi nhập vào cơ thể người bệnh (thứ phát) Vi khuẩn lao kháng thuốc tiên phát là hiện tượng lây nhiễm bởi một chủng đã kháng thuốc mà vi khuẩn này đã có sự đề kháng tự nhiên Vi vậy, bệnh nhân mắc lao do sự lây nhiễm này, ngay từ đầu vi khuẩn lao xâm nhập vào... với thuốc đang sử dụng Còn hiện tượng kháng thuốc thứ phát xảy ra đối với các chủng vi khuẩn lao ở bệnh nhân nào đó dùng thuốc chống lao không đúng quy định, không đúng liều lượng, thời gian sử dụng thuốc 11 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc do đó đã chọn lọc vi khuẩn lao khang thuốc [1, 38] Các chủng vi lao kháng thuốc được chia làm hai loại: (1) Các chủng lao kháng đa thuốc (MDR... trúc quần thể vi khuẩn lao ở bệnh nhân lao kháng thuốc, đa nh giá được tỷ lệ đột biến liên quan kháng thuốc trên các chủng lao phân lập từ các vùng địa lý khác nhau Qua đó làm tiền đề xây dựng một số bộ kit real-time PCR, nhằm phát hiện nhanh vi khuẩn lao kháng rifampicin và isoniazid tại Vi ̣t Nam 1.5.4 Kỹ thuật real-time PCR và multiplex real-time PCR Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà... lâm sàng 25 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn lao nhạy cảm với thuốc kháng sinh, kháng đơn thuốc (kháng một loại thuốc INH hoặc RIF), kháng đa thuốc (kháng ít nhất hai loại thuốc dòng thứ nhất là INH và RIF) và siêu kháng thuốc (kháng tất cả các thuốc chống lao hiện... hợp khi các chủng vi khuẩn lao kháng đồng thời hai thuốc chống lao mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin (2) Các chủng lao kháng thuốc phổ rộng (XDR – TB): Là trường hợp khi vi khuẩn lao đã ở tình trạng kháng đa thuốc và có thêm tính kháng một trong ba loại thuốc chống lao là capreomycin, kanamycin, amikacin [49] Ngày nay khi nghiên cứu về sinh học phân tử, người ta đã xác... vi khuẩn thuộc chi Mycobacterium, trước hết là của vi khuẩn lao (M tuberculosis) và vi khuẩn phong (M leprae) có tầm quan trọng đặc biệt trong nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử hỗ trợ dịch tễ học, di truyền học và nghiên cứu kháng thuốc, số liệu đã được lưu giữ tại một số trung tâm và có thể sử dụng một số chương trình để truy cập khám phá và sử dụng [11, 53] 1.4 CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC