Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu cơ chế kháng đa thuốc ở vi khuẩn lao

Nguyên nhân gây kháng thuốc

- Những thay đổi xảy ra ở mức độ phân tử và cơ chế xâm nhập của thuốc vào bên trong tế bào vi khuẩn làm cho nồng độ thuốc bên trong tế bào không đạt tới nồng độ tối thiểu có khả năng giết chết vi khuẩn gây bệnh. Các chủng vi lao kháng thuốc được chia làm hai loại: (1) Các chủng lao kháng đa thuốc (MDR – TB): Là trường hợp khi các chủng vi khuẩn lao kháng đồng thời hai thuốc chống lao mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin. Trong luận văn này, chúng tôi tập trung nghiên cứu cơ chế kháng đa thuốc, tức là trường hợp vi khuẩn lao kháng đồng thời hai thuốc chống lao mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin, điều đó đồng nghĩa với việc nghiên cứu các đột biến trên gen rpoB với katG.

Rifampicin và cơ chế kháng

Khi rifampicin gắn với tiểu đơn vị β của RNA polymerase (rpoB), làm ức chế các hoạt động sao chép tạo ra các mRNA của vi khuẩn lao và do đó làm ngưng trệ các hoạt động sống của vi khuẩn lao. - Khi xảy ra đột biến gần vựng lừi của gen rpoB sẽ làm thay đụ̉i cấu trỳc tiểu phần β của RNA polymerase mà nó mã hóa nên làm cho khả năng kết hợp của RMP với tiểu phần này giảm đi. Điều này cho thấy cần phải xác định thêm những đột biến khác trên gen này hoặc những gen khác có liên quan để xác định chính xác và toàn bộ cơ chế kháng rifampicin của vi khuẩn lao [19, 37].

Isoniazid và cơ chế kháng

Cơ chế phân tử của tính kháng INH chủ yếu có liên quan tới đột biến thêm đoạn/mất đoạn hoặc các đột biến nhầm nghĩa/vô nghĩa, trong đó chủ yếu diễn ra tại codon 315 (Ser à Thr) của gen katG mã hóa catalase peroxidase [26]. Nếu có sự biến dạng hay đột biến ở base thứ 2 tại codon 315 của gen katG (AGC biến đổi thành ACC hay ACA) sẽ dẫn đến làm giảm hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của catalase peroxidase, do đó M. Do đó phát hiện sự thay đổi di truyền này trong gen katG có thể cung cấp một phương pháp sàng lọc nhanh và chính xác cho việc phát hiện các chủng M.

Xác định kiểu hình

Gồm các phương pháp sau: Phương pháp xác định tương quan, phương pháp xác định tỷ lệ kháng, phương pháp đo màu, phương pháp khử nitrate và nhiều phương pháp khác [13]. Các phương pháp này đều xác định khả năng phát triển của vi khuẩn lao trong môi trường nuôi cấy có kháng sinh, từ đó đưa ra kết luận về khả năng kháng thuốc của chủng vi khuẩn lao đang nghiên cứu [12]. Nhược điểm của các phương pháp này là vi khuẩn lao mọc chậm, trên môi trường Lowenstein-Jensen thường mất 4-6 tuần.

Xác định kiểu gen

Các phương pháp chẩn đoán xác định kiểu gen dựa trên cơ sở phát hiện đột biến ở các gen có liên quan tới tính kháng thuốc tương ứng [51], sử dụng các kỹ thuật cao, đòi hỏi thiết bị hiện đại, tốn kém và cần nhân lực có trình độ chuyên sâu nhưng thời gian chẩn đoán bằng phương pháp này nhanh hơn, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Sau khi giải trình tự đoạn gen vừa được tách dòng từ chủng lao nghiên cứu ta sẽ so sánh trật tự sắp xếp các nucleotide ở mẫu thí nghiệm với trật tự nucleotide chuẩn để biết được các vị trí sai lệch [22, 16]. Việc xác định các đột biến có liên quan kháng thuốc rifampicin và isoniazid bằng kỹ thuật giải trình tự cho biết chính xác vị trí đột biến cũ và mới trên gen cần nghiên cứu, mang lại hiểu biết sâu sắc về sự đa dạng của cấu trúc quần thể vi khuẩn lao ở bệnh nhân lao kháng thuốc, đánh giá được tỷ lệ đột biến liên quan kháng thuốc trên các chủng lao phân lập từ các vùng địa lý khác nhau.

Kỹ thuật real-time PCR và multiplex real-time PCR

Chất huỳnh quang này phải làm thế nào để ống phản ứng có thể phát được huỳnh quang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích một khi trong ống phản ứng này có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại từ DNA đích, và sẽ không thể phát được huỳnh quang nếu không có sản phẩm khuếch đại trong ống. Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung, do vậy reporter của Taqman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Kỹ thuật multiplex real-time PCR cho phép tiết kiệm thời gian, công sức và đóng vai trò rất quan trọng trong chẩn đoán phân tử bao gồm phân tích đột biến gen, tính đa hình DNA và phân tích định lượng, phản ứng multiplex real-time PCR rất hữu ích cho việc phát hiện trực tiếp các đột biến của M.

Vật liệu thiết bị và dụng cụ nghiên cứu Bảng 2.1. Các sinh phẩm hóa chất chính

H/c sinh phẩm dùng trong tách dòng Pepton

• PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Sơ đồ nghiên cứu

Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Viện CNSH Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ). *) Các máy và thiết bị chính. Trong đó, cặp mồi katG-F và katG-R nhân đoạn gen katG có chứa codon 315 liên quan kháng thuốc isoniazid, cặp mồi rpoB-F và rpoB-R nhân đoạn gen rpoB có chứa đoạn nóng 81 bp liên quan tới kháng thuốc rifampicin. STT Thành phần Nồng độ Thể tớch (àl). Theo chu kỳ nhiệt như sau. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng chạy điện di trên gel agarose 0,8%. Để phục vụ cho giải trình tự gen, đoạn gen katG và rpoB được tinh sạch và dòng hóa vào vector tách dòng pBT để tạo vector tái tổ hợp. Tạo dòng gen. *) Tạo sản phẩm nối ghép. Thành phần hỗn hợp phản ứng nối ghép. tế bào có vector tái tổ hợp. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào tế bào khả biến E. Chọn một khuẩn lạc trắng trên mỗi đĩa tiếp tục được chọn nuôi qua đêm trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 mg/l. *) Tách chiết Plasmid và kiểm tra.

STT Thành phần Thể tớch (àl). Sau phản ứng cắt, sản phẩm được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Những mẫu nào có vạch tương ứng với kích thước của đoạn gen cần nghiên cứu thì có thể sử dụng để xác định trình tự. *) Phân tích kết quả. Sau khi tách dòng và giải trình tự đoạn gen katG và rpoB của các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu được phân lập tại các vùng miền khác nhau tại Việt Nam, qua phân tích các đột biến, các probe sẽ được thiết kế nhằm phát hiện các đột biến có liên quan kháng INH và RIF ở vi khuẩn lao bằng phản ứng multiplex real-time PCR. Do trong phản ứng multiplex real-time PCR sử dụng 2 probe khác nhau trong cùng một phản ứng nên việc lựa chọn 2 probe này phải gắn 2 reporter (chất phát huỳnh quang) khác nhau để có thể phân biệt ở các bước sóng khác nhau.

Probe dùng cho phản ứng real-time PCR sử dụng cho nghiên cứu này được thiết kế theo công nghệ TaqMan MGB (Minor Groove Binding) probe (TaqManR Chemistry) của hãng Applied Biosystems dạng TaqMan này có ưu điểm đó là có thể thực hiện phản ứng real-time PCR ở nhiệt độ cao, từ đó làm tăng độ đặc hiệu của các probe. TaqMan hay phương pháp nuclease đầu 5’ là một trong những thí dụ về các loại probe thủy phân, tín hiệu huỳnh quang phát ra do sự thủy phân các đoạn probe được dùng để phát hiện các đoạn sản phẩm PCR. Trong nghiên cứu chúng tôi sử dụng 2 probe có gắn 2 reporter khác nhau, reporter gắn FAM cho phép phát tín hiệu huỳnh quang khi đo ở bước sóng 530 nm và reporter còn lại được gắn VIC phát huỳnh quang ở bước sóng 560 nm.

Các quencher được gắn ở đầu 3’ của mỗi probe là các BHQ phát nhiệt, các BHQ phát nhiệt hiện nay được ưa chuộng sử dụng vì khả năng hấp thụ huỳnh quang rất mạnh, các BHQ được xem như các lỗ đen (black hole quencher – BHQ) hút lấy tất cả các huỳnh quang từ reporter không cho bất cứ huỳnh quang nào phát ra được từ reporter, đồng thời rất dễ dàng để thiết kế các Taqman probe dùng cho multiplex real-time PCR mà không lo đến phổ huỳnh quang của các reporter có bị trùng với phổ huỳnh quang của quencher vì quencher không hề phát huỳnh quang.