Luận văn nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn malolactic và ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu vang

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Đình Dũng NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN MALOLACTIC VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƯỢU VANG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Đình Dũng NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN MALOLACTIC VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƯỢU VANG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Trương Hương Lan GS.TS Phạm Văn Ty Hà Nội LỜI CẢM ƠN Trong trình thực tập tốt nghiệp hoàn thành luận văn, nhận giúp đỡ nhiều mặt cấp lãnh đạo, tập thể cá nhân Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trương Hương Lan Chủ nhiệm môn thực phẩm dinh dưỡng - Viện Công nghiệp thực phẩm, người tận tình hướng dẫn, bảo cặn kẽ cho suốt trình thực hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đặc biệt, xin bày tỏ kính trọng lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Phạm Văn Ty - Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, thầy hướng dẫn, tạo điều kiện tốt cho suốt trình thực hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể cán bộ, nhân viên Phòng Thực phẩm dinh dưỡng - Viện Công nghiệp thực phẩm quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho trình thực luận văn tốt nghiệp Tôi xin cảm ơn chân thành tới thầy giáo, cô giáo, Khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội bảo, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt trình học tập hoàn thành luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè người thân bên tôi, tạo điều kiện vật chất lẫn tinh thần suốt trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Học viên Nguyễn Đình Dũng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men malolactic 46 DANH MỤC CÁC HÌNH 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men malolactic 46 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men malolactic 46 AG Acid Grape - Nước nho axít CoA Coenzyme A CFU Colony forming unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc HDL High density lipoprotein - Lipoprotein có tỷ trọng cao LAB Lactic acid bacteria - Vi khuẩn lactic MRS De Man, Rogosa and Sharp - Môi trường MRS NAD+ Nicotinamit Adenin Dinucleotide NADH Nicotinamit Adenin Dinucleotide Hydrogen EO Chế phẩm Essential oenos OD Optical density - Mật độ quang MLF Melolactic fermentaeion - Lên men malolactic DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU Rượu vang đồ uống có cồn sản xuất từ trình lên men dịch nói chung mà phổ biến từ nho Do nho loại có thành phần hoá học thích hợp cho nấm men phát triển có hương thơm đáp ứng yêu cầu cho sản xuất rượu vang chất lượng cao Trải qua lịch sử hình thành phát triển lâu đời, rượu vang nho với nồng độ rượu vừa phải từ 10-14%v đồ uống có lợi cho sức khỏe người với giá trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon ưa chuộng khắp nơi giới Từ nhiều năm nay, rượu vang nho trở thành thức uống phổ biến nước ta Thị trường rượu vang nước phát triển, nhiên chưa đáp ứng yêu cầu chất lượng Theo số liệu Tổng cục thống kê, kể từ năm 2010 đến nay, rượu vang nhập tăng khoảng 25%/ năm Trong đó, Ninh Thuận biết đến vùng trồng nho có sản lượng lớn nước, trồng chủ yếu giống nho Red Cardinal thường dùng để ăn tươi để lên men rượu vì cho màu sắc nhạt, không hấp dẫn Do vậy, chất lượng rượu vang Việt Nam chưa thật cao so sánh với rượu vang nhập hương vị sản phẩm chưa đạt tiêu chuẩn, màu sắc dễ bị nâu hoá, sản phẩm bị lắng cặn…Với tiềm thị trường lớn nước ta, việc cải tiến công nghệ để sản xuất rượu vang nho vấn đề quan tâm Nhiều nước giới giải vấn đề nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất rượu vang nho sâu làm rõ chế như: chuyển hóa thành phần nho thành chất thơm rượu vang, tác động điều kiện môi trường đến sinh trưởng phát triển vi khuẩn malolactic trình lên men malolactic[26, 27]…Quá trình lên men rượu vang trình lên men thực chủ yếu nhờ nấm men phần vi khuẩn lactic có mặt nho thiết bị làm rượu Nấm men sử dụng hệ enzym mình để chuyển hóa glucoza số đường khác thành rượu sản phẩm phụ khác (rượu bậc cao, este, axít hữu ), vi khuẩn lactic chuyển hóa axít malic thành axít lactic CO2 trình lên men malolactic Lên men malolactic đóng vai trò quan trọng sản xuất rượu vang đỏ số loại vang trắng, trình thiếu việc làm biến đổi thành phần hóa học, mang lại cho rượu vang hương vị đặc trưng Với điều kiện, công nghệ sản xuất rượu vang Việt Nam nay, việc phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn lactic để tối ưu hóa trình lên men malolactic cần thiết Điều giúp nhà sản xuất rượu vang kiểm soát trình sản xuất rượu vang tốt hơn, giảm rủi ro tạo sản phẩm hỏng có chất lượng không ổn định, đồng thời làm đa dạng chủng loại rượu vang phục vụ cho nhu cầu người tiêu dùng Từ mở hướng nghiên cứu cho công nghệ sản xuất rượu vang nho chất lượng cao Việt Nam giải vấn đề thực tiễn ngành sản xuất rượu vang nước.Vì vậy, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn malolactic ứng dụng công nghệ sản xuất rượu vang” CHƯƠNG – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung rượu vang 1.1.1 Vài nét rượu vang Rượu vang thức uống có cồn sản xuất phương pháp lên men không chưng cất từ dịch nho Nhờ tác nhân lên men (lên men giai đoạn) nhờ nấm men vi khuẩn lactic (lên men hai gian đoạn) tạo cho rượu vang có hương vị đặc trưng, giá trị dinh dưỡng cao hẳn loại rượu khác Thuật ngữ “Rượu vang”tiếng la tinh “vinum”, bắt nguồn từ chữ “vinea”, có nghĩa nho Trước tiên việc sản xuất rượu vang tiến hành cách ép lấy dịch nho, sau lên men hoàn toàn tự nhiên hang đá Người La Mã có công truyền bá nghề trồng nho làm rượu sang Pháp Marseilles từ kỉ II, sau vùng Champagne Monselle Valley vào khoảng kỉ IV Pháp bắt đầu xuất rượu vang sang Anh Đức vào kỉ XII Vào năm 1857, lần lịch sử, Louis Pasteur công bố nghiên cứu trình lên men, xác định rõ vai trò quan trọng nấm men trình lên men rượu biến đổi hoá sinh trình lên men nấm men [8] Đến có hàng trăm loại rượu vang khác đáp ứng nhu cầu đa dạng người tiêu dùng Phân loại rượu vang dựa màu sắc: vang màu vang trắng, loại vang màu thì rượu vang đỏ có giá trị cao Ngày nguyên liệu chế biến rượu vang mở rộng loại nguyên liệu khác nhau, phong phú màu sắc chất lượng Trải qua nhiều kỷ, rượu vang khẳng định vai trò với sức khỏe người Louis Pasteur nhiều lần khẳng định: “Rượu vang loại đồ uống vệ sinh có lợi cho sức khoẻ” Khoa học phát rượu vang đỏ có chứa chất trans-resveratrol chất chống oxi hóa, gặp vỏ nho đỏ (vỏ chứa khoảng 2µg trans-resveratrol) Các polyphenol Chất có tác dụng trung hòa tác nhân oxi hóa, chẳng hạn gốc tự tạo thành trình trao đổi chất bình thường tế bào Các gốc tự gây hư hại mô không nhanh chóng loại bỏ Chính tác dụng nói trans-resveratrol góp phần làm giảm nguy tử vong bệnh nhồi máu tim người [30] 1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang [7, 8, 12] Lên men trình trao đổi chất tác dụng enzyme tương ứng Tùy theo sản phẩm tích tụ sau trình lên men mà người ta chia kiểu lên men khác Có hai hình thức lên men lên men yếm khí lên men hiếu khí Lên men rượu trình lên men yếm khí với có mặt nấm men, chúng chuyển hóa đường thành ethanol CO2 Thực chất trình oxi hoá - khử có mặt enzyme nấm men Năng lượng sinh phục vụ cho hoạt động sống nấm men bị tiêu hao dạng nhiệt [7] Sự thay đổi nhiệt độ trình lên men dẫn tới sốc nhiệt làm ảnh hưởng tới hoạt tính nấm men Do giữ nhiệt độ ổn định trình lên men yếu tố quan trọng giúp trình lên men hoàn thành Nấm men nhạy cảm với nhiệt độ giai đoạn đầu phát triển nhân lên trở nên chống chịu tốt giai đoạn sau Do lên men rượu vang thì giai đoạn đầu trình lên men nên trì nhiệt độ 18-22oC sau cho phép tăng dần lên [7, 12] Nhiệt độ lên men ban đầu cao nguyên nhân gây tượng ì cuối Nho đỏ trình lên men Quá trình lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính: Nghiền/chà táchsựcuống - Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn với có mặt oxy, tế bào nấm men phát triển Cuống sinh khối Sulfite hóa SO2 chuyển đường thành rượu CO2: giai đoạn nấm men hấp thụ chất - Thời kỳ lên men dinh dưỡng sử dụng enzyme sẵn có thực xúc tác sinh học trình Ngâm trao đổi chất để trì sống, tạo thành rượu CO2 Sản phẩm thu hồi trình Tách dịchlên nhomen rỉ phức tạp Ngoài ethanol nhiều chất khác este, rượu bậc cao, axit hữu cơ, glycerol, dầu fusel Tỷ lệ Tách cặn Cặn sản phẩm phụ phụ thuộc vào điều kiện môi trường lên men Trong trình này, nấm men chuyển hóa đường thành rượu giải phóng Hiệu chỉnh thành phần Nấm dich nhonấm men tạo theo đường EnolCO2 mentác dụng xúc tác enzyme pyruvat [7] Hoạt hóa nấm men Lên men Vi khuẩn lactic Lên malolactic Ủ rượu Ổn định rượu Làm Rót sản phẩm Rượu Vang Cặn Bảng 3.11 Hàm lượng axít malic (g/l) phân giải trình tàng trữ có bổ sung dinh dưỡng khác theo thời gian Ngày 10 15 20 25 g/l 2,15 1,8 1,6 1,2 0,8 0,55 0,025 g/l 2,15 1,7 1,4 0,12 0,1 0,05 g/l 2,15 1,6 1,3 0,9 0,12 0,1 0,075 g/l 2,15 1,5 1,25 0,86 0,12 0,1 Nồng độ EO Ghi chú: Mẫu mẫu đối chứng không bổ sung Essentials Oenos Mẫu có bổ sung Essentials Oenos (EO) Hình 3.6 Hàm lượng axít malic phân giải trình tàng trữ có bổ sung dinh dưỡng khác theo thời gian Kết minh họa bảng 3.11 hình 3.6 cho thấy có khác biệt rõ ràng mẫu đối chứng không bổ sung Essentials Oenos mẫu thí nghiệm bổ sung Essentials Oenos khả phân giải axít malic thời gian lên men Ớ mẫu 45 đối chứng, điều kiện dịch vang non không bổ sung dinh dưỡng, hàm lượng axít malic ngày thứ 25 0,55 g/l, chứng tỏ trình lên men malolactic chưa hoàn thành Tiếp tục cho mẫu lên men ngày hàm lượng axít malic giảm xuống không đáng kể, 0,52 g/l (số liệu không trình bày) Trong đó, mẫu bổ sung Essentials Oenos, trình lên men malolactic kết thúc 20 ngày, với hàm lượng axít malic lại thấp, 0,12 g/l Sự khác mẫu thể hai mẫu có nồng độ Essentials Oenos cao (0,05 0,075 g/l) thì khởi động vi khuẩn lactic ngày đầu nhanh phải cần đến 20 ngày thì phân giải axít malic gần cạn kiệt (0,12 g/l) Vì vậy, lựa chọn nồng độ Essentials Oenos thấp 0,025 g/l để bổ sung cho trình lên men malolactic 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men malolactic Theo Henick - Kling nhiều tác giả, trình lên men malolactic không đơn trình chuyển axít malic thành axít lactic mà có ảnh hưởng lớn đển chất lượng cảm quan rượu vang Chất lượng cảm quan rượu cao hay thấp không phụ thuộc vào trình lên men rượu mà phụ thuộc nhiều vào trình lên men malolactic, phải kể đến yếu tố chủng vi khuấn lựa chọn, điều kiện trình lên men [33] Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến tiến trình lên men malolactic Tiến hành thí nghiệm với mẫu lên men malolactic bổ sung vi khuẩn lactic điều kiện nhiệt độ khác Kết thời gian lên men malolactic hình thành số tính chất quan trọng rượu vang trình bày bảng 3.12 Kết bảng 3.12 cho thấy lên men malolactic nhiệt độ 15°C không phù hợp vì sau 45 ngày lên men, hàm lượng axít malic lại nhiều rượu vang (1,45 g/l) Số lượng quần thể vi khuẩn malolactic đạt từ đầu trình lên men có ý nghĩa quan trọng lên men malolactic Nhiệt độ thấp 15°C không thúc đẩy phát triển vi khuẩn không đủ sinh khối tạo enzym chuyển hóa axít malic thành axít lactic 46 Bảng 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ đến chuyển hóa axít malolaic thành axít lactic trình lên men malolactic Nhiệt độ lên men (0C) Axit malic (g/1) Axit lactic (g/1) Axít bay (g/1) axít axetic) Thời gian lên men malolactic (ngày) 15 1,45 0,92 0,28 45 20 0,12 1,80 0,30 23 25 0,12 1,81 0,35 20 30 0,11 1,82 0,46 19 Từ bảng 3.12 cho thấy tất mẫu lên men từ 20 - 30°C có khả chuyển hoá axít malic thành axít lactic tương đối triệt để, khác thời gian lên men malolactic Điểm khác biệt lớn lên men 20, 25 30°C thời gian lên men malolactic nhanh ngày Tuy nhiên, khác biệt hình thành axít bay lại lớn mẫu Lên men nhiệt độ 20°C cho hàm lượng axít bay thấp (0,30 g/1) nhiệt độ 30°C, hàm lượng axít 0,46 g/1 Mặc dù lên men malolactic nhiệt độ thấp 20°C làm chậm thời gian so với 25°C ngày rõ ràng axít malic chuyển hóa triệt để, hàm lượng axít bay tạo lại giảm nhiều Chỉ tiêu axít bay biểu thị mạnh mẽ độ giảm chất lượng rượu vang Mặt khác, theo nhiều nghiên cứu, lên men nhiệt độ thấp làm giảm nguy bị nhiễm Do vậy, nhiệt độ trình lên men malolactic chọn 20°C Tiến hành lên men malolactic điều kiện nhiệt độ 20°C, có bổ sung chế phẩm Essentials Oenos nồng độ 0,025 g/1, sau xác định thành phần rượu vang kết trình bày bảng 3.13 Kết bảng 3.13 cho thấy rõ ràng hàm lượng axít tổng số giảm đi, hàm lượng axít bay tăng lên không nhiều, axít malic axít lactic hai thành phần bị thay đổi nhiều nhất, dư lượng axít malic lại dịch lên men không đáng kể hàm lượng axít lactic lại tăng lên đến 1,78 g/1 Điều góp phần quan trọng vào tính chất cảm quan sản phẩm, làm rượu trở nên mềm mại ổn định 47 Bảng 3.13 Thành phần rượu vang sau kết thúc trình lên men malolactic Trước lên men malolactic Sau lên men malolactic Etanol (%v/v) 12,8 12,3 Axít tổng số (g/1 H2SO4) 5,39 4,9 Axít bay (g/1 axít axetic) 0,23 0,28 Axít malic (g/1) 2,04 0,12 Axít lactic (g/1) 0,45 1,78 pH 3,4 3,5 Thành phần Từ kết thu được, đưa kết luận sau Quá trình lên men malolactic chủng môi trường rượu vang non đạt hiệu cao với hàm lượng axít malic lại 0,12 g/1 điều kiện bổ sung chế phẩm Essentials Oenos nồng độ 0,025 g/1, nhiệt độ lên men 20°C thời gian lên men 23 ngày 3.4.3 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic đến chất lượng rượu vang Theo Henick-Kling nhiều tác giả, trình lên men malolactic không đơn trình chuyển axít malic thành axít lactic mà có ảnh hưởng lớn đến chất lượng cảm quan rượu vang Chất lượng cảm quan rượu cao hay thấp không phụ thuộc vào trình lên men rượu mà phụ thuộc nhiều vào trinh lên men nialolactic, phải kể đến yếu tố chủng vi khuẩn lựa chọn, điều kiện trình lên men [33] Để trình lên men malolactic thành công, thời điểm xác để bổ sung vi khuẩn lactic quan trọng Xung quanh vấn đề có nhiều quan điểm tranh cãi Các ý kiến tán thành cho việc bổ sung vi khuẩn lactic đầu trình lên men rượu cho vi khuẩn phát triển tốt với nguồn dinh dưỡng dồi điều cho phép trình lên men malolactic kết thúc trước trình lên men rượu (Beelman, 1982, 1985) Tuy nhiên, Gallander LafonLafourcade lại báo cáo vi khuẩn phát triển chậm sir khử axít malic trở nên tương tác nấm men Sự cấy vi khuẩn lactic vào giai đoạn kết thúc trình lên men cồn có bất lợi như: môi trường dinh dưỡng cạn kiệt, hàm 48 lượng rượu etanol cao Cả hai điều kiện làm chậm trễ trình lên men malolactic (Lafon-Lafourcade, 1983) Một quan điểm khác tán thành việc bổ sung vi khuẩn lactic vào thời điêm lên men rượu phần với lý vi khuẩn vừa tận dụng nguồn dinh dưỡng môi trường mà không ảnh hưởng đến tiến trình lên men rượu (Fornairon, 2001) Thí nghiệm trình bày kết trình lên men mallolactic thực với thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic khác Quá trình lên men thực mục 2.2.1 nho sau nghiền xử lý với K2S2O5 enzym Pectinex, lên men với chủng nấm men S.cerevisiae SH09, vi khuẩn lactic J cho vào thời điểm trước, sau trình lên men rượu, cụ thể: Mẫu F: Lên men MLF, cấy vi khuẩn lactic đầu trình lên men rượu Mẫu M: Lên men MLF, cấy vi khuẩn lactic trình lên men rượu 48h Mẫu E: Lên men MLF, cấy vi khuẩn lactic trình lên men rượu vừa kết thúc Mẫu ĐC: Lên men MLF tự phát, không bổ sung malolactic Quá trình lên men malolacti thực điều kiện nhiệt độ 20°C Kết chuyển hoá axít Malic thời gian lên men malolactic trình bày bảng 3.14 49 Bảng 3.14 Thời gian lên men hàm lượng axít malic, axít lactic sau trình lên men malolactic thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic khác Mẫu Axít malic (g/1) Axít lactic (g/1) Thời gian lên men (ngày) ĐC 0,10 1,64 23 F 0,09 1,68 14 M 0,09 1,66 12 E 0,09 1,69 14 Kết bảng 3.14 cho thấy: Khả phân giải axít malic - Mẫu ĐC hàm lượng axít malic dư dịch lên men cao (0,10 g/l) - Mẫu F, M, E hàm lượng axít malic dư dịch lên men lại (0,09 g/l) Khả tạo Axít lactic - Mẫu ĐC hàm lượng axít lactic dư dịch lên men thấp (1,64 g/l) - Mẫu M hàm lượng axít lactic dư dịch lên men (1,66 g/l) - Mẫu F hàm lượng axít lactic dư dịch lên men (1,68 g/l) - Mẫu E hàm lượng axít lactic dư dịch lên men cao (1,69 g/l) Mẫu đối chứng (ĐC) lên men tự phát có thời gian lên men malolactic dài tất mẫu nghiên cứu Sau trình lên men rượu kết thúc, đến ngày thứ tám, trình lên men malolactic bắt đầu kết thúc vào thời điểm 16 ngày sau Tổng trình lên men malolactic 23 ngày Mẫu M, bổ sung vi khuẩn lactic sau 48 h trình lên men rượu, hàm lượng đường khử giảm xuống khoảng 25% có thời gian lên men malolactic nhanh nhất, 12 ngày sau kết thúc trình lên men rượu mẫu phù hợp 50 Mẫu E, bổ sung vi khuẩn lactic vào giai đoạn cuối trình lên men rượu có thời gian lên men malolactic 14 ngày Tuy nhiên, vì bổ sung lactic giai đoạn khác trình lên men rượu nên có tương tác nấm men vi khuẩn, ảnh hưởng đến trình lên men rượu, đặc biệt đến tạo thành etanol hàm lượng đường sót, ảnh hưởng trình bày bảng 3.15 hình 3.7 Bảng 3.15 Rượu etanol tạo thành hàm lượng đường sót sau trình lên men malolactic Mẫu Etanol (%v/v) Đường sót (g/1) ĐC 12,8 5,9 F 12,1 7,2 M 12,9 5,9 E 12,8 5,9 Hình 3.7 So sánh tạo thành rượu etanol sau trình lên men malolactic Kết quả, bảng 3.15 hình 3.7 cho thấy mẫu bổ sung vi khuẩn lactic vào thời điểm đầu trình lên men rượu khiến cho trình lên men cồn thực 51 không hoàn toàn, thể hàm lượng đường sót tương đối cao (7,2 g/1), hàm lượng cồn tạo thành tương đối thấp Tuy nhiên, hàm lượng cồn thấp mẫu vi khuẩn lactic tiêu thụ phần đường để lên men Mẫu bổ sung vi khuẩn lactic sau 48 h lên men (mẫu M) có hàm lượng cồn tạo hàm lượng đường sót tương tự mẫu lên men cồn mà tham gia vi khuẩn lactic (mẫu ĐC mẫu E) Việc bổ sung lactic giai đoạn khác trình lên men rượu nên có tương tác nấm men vi khuẩn, ảnh hưởng đến trình lên men rượu, ảnh hưởng đến tạo thành chất bay hơi, ảnh hưởng trình bày bảng 3.15 hình 3.8 Bảng 3.16 Sự tạo thành số chất bay tạo thành sau trình lên men malolactic Mẫu Axít bay (g/1) ĐC F M E 0,47 0,42 0,26 0,43 52 Hình 3.8 So sánh tạo thành số chất bay sau trình lên men malolactic Kết bảng 3.16 hình 3.8 cho thấy trình lên men malolactic tự phát tạo hàm lượng axít bay cao (0,47 g/1) Ở mẫu cấy vi khuẩn lactic sau 48 h thì hàm lượng axít bay giảm đáng kể (0,26 g/1) Ở hai mẫu lại, cấy vi khuẩn lactic vào giai đoạn đầu cuối trình lên men rượu thì hàm lượng axít bay tạo trung bình, 0,41 0,43 g/1 tương ứng Các axít bay yếu tố tiêu cực rượu, hàm lượng, rượu vang tăng lên chứng tỏ chất lượng rượu vang giảm Đã xác định điều kiện tối ưu trình lên men malolactic cho chủng NT 12 môi trường rượu vang non quy trình sản xuất rượu vang đỏ: Nồng độ Essentials Oenos thấp 0,025 g/l để bổ sung cho trình lên men malolactic.Nhiệt độ lên men 200C Thời gian lên men 23 ngày Bổ sung bổ sung vi khuẩn lactic sau 48 h trình lên men rượu, hàm lượng đường khử giảm xuống khoảng 25% 53 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận: Từ kết thu được, rút số kết luận sau đây: Từ 20 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ vùng trồng nho Ninh Thuận, chủng có khả chuyển hóa axit malic thành axit lactic Tuyển chọn chủng NT12 có khả phân giải malolactic tốt hàm lượng axít malic dư dịch sau lên men malolactic 0,12 g/l Đã xác định điều kiện tối ưu trình lên men malolactic cho chủng NT12 môi trường rượu vang non quy trình sản xuất rượu vang đỏ: - Nồng độ Essentials Oenos thấp 0,025 g/l để bổ sung cho trình lên men malolactic - Nhiệt độ lên men 200C - Thời gian lên men 23 ngày - Bổ sung bổ sung vi khuẩn lactic sau 48 h trình lên men rượu, hàm lượng đường khử giảm xuống khoảng 25% Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu xác định thêm số điều kiện tối ưu cho chủng NT 12 để ứng dụng sản xuất thử nghiệm rượu vang đỏ chất lượng cao Việt Nam 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi (2005), Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Trương Hương Lan, Lại Quốc Phong, Lê Đình Hùng, Trần Thị Minh Hà, Ngô Anh Tuấn, Yoshihiro Komiyama (2007), Nghiên cứu ứng dụng SO2 nâng cao độ ổn định chất lượng rượu vang trình bảo quản, Tạp chí Công nghiệp, Bộ Công nghiệp, số 3/2007, tr.22-25 Lại Quốc Phong (2007), “Nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Oenococcus oeni cho lên men malolactic rượu vang đỏ”, Các công trình nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học - công nghiệp thực phẩm giai đoạn 2001-2005, Nhà xuất Lao động-Xã hội, tr.196-202 Lê Thị Liên Thanh (1997), Nghiên cứu số đặc tính sinh lí hóa sinh Leuconostoc oenos ứng dung sản xuất rượu vang, Luận án Tiến sĩ khoa học, Đại học Bách khoa Hà Nội Khuất Hữu Thanh, Nguyễn Quang Hào (2003), Nghiên cứu hiệu sử dụng enzym chất phụ gia sản xuất vang Việt Nam chất lượng cao, Báo cáo khoa học, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2003, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr.569-572 Tiêu chuẩn Việt Nam (2002), Rượu vang - Quy định kỹ thuật, Trung tâm tiêu chuẩn Việt Nam TCVN:7045:2002 Trương Hương Lan, Lại Quốc Phong, Trần Thị Minh Hà, Ngô Anh Tuấn, Taillandier Patricia, Lonvaud Aline (2010), Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu vang chất lượng cao Việt Nam Báo cáo tổng hợp, tr 12-24 55 Tiếng Anh Amerine M.A and Cruess W.V (2003), The technology of wine making, The AVI Publishing Company Inc., Connecticut AOAC Oficial Method of Analyis (1995), 27, pp 2651-2659 10 Asmundson RV, Kelly WJ (2000), “The effect of temperature and etanol concentration on the growth of Leuconostoc oenos”, In: Williams PJ, Davidson D, Lee TH (Eds), Proceedings of the seventh Australian wine industry technical conference, 14-16 August 1989, Adelaide, S.A Winetitles, pp 251-252 11 Bartowsky E.J., and Henschke P.A., (2004), “The “buttery” attribute of wine- diacetyldesirability, spoilage and beyond”, Int J Food Microbiol., 96, pp 235-252 12 Boutlton R.B., V.L Singleton, L.F Bisson, and R.E Kunkee (2006), “Malolactic fermentation”, In: Principles and practices of winemaking , Chapman & Hall, Aspen Publishers, Maryland 13 Britz TJ, Tracey RP (1990), “The combination effect of pH, S02, etanol and temperature on the growth of Leuconostoc oenos”, J Appl Bacteriol., 68, pp 2331 14 Carreté R, Teresa Vidal M, Bordons A, Constanti M (2002), “Inhibitory effect of sulphur dioxide and other stressvcompounds in wine on the ATPase activity of Oenococcus oeni”, FEMS Microbiol Lett 211, pp.155-159 15 Collin C.H., Lyne M., Grange J.M (1989), Microbiological methods, Sixth Edition, Butterworth and Co (Publishers) Ltd London, pp.169- 233 16 Chu-Ky s, Tourdot-Marechal R, Marechal PA, Guzzo J (2005), “Combined cold, acid, etanol shocks in Oenococcus ami: Effects on membrane fluidity and cell viability”, Biochimica et Biophysica Acta.,1717, pp.118-124 17 Davis C.R., D Wibowo, T.H Eschenbruch, and G.H Fleet (1985), “Practical implications of malolactic fermentation: A review”, Am J Enol Vitic., 36, pp.290301 18 Delore A., Kraeva B., Martin M., Hunter J.J (2005), “Sugar loading and phenolic accumulation as affected by ripeness of Syrah R99 grapes”, Confference XIV International GESCO Viticulture Congress Geisenheim, Germany 23-27, August, 2005 56 19 Edwards CG, Beelman CE, McConnell AL (2000), “Production of decanoic acid and other volatile compounds and the growth of yeast and malolactic bacteria during vinification”, Am J Enol Vitic 41, pp 48-56 20 European Brewing Convention (1999), “Dertermination of sulfite content in vin”, Analytical EBC Methods 9-12, pp 31-132 21 Garde-Cerdan T., Rodriguez-Mozaz S., and Ancin-Azpilicueta C., (2002), “Volatile composition of aged wine in used barrels French oak and of American oak”, Food Research International, 35, pp 603-610 22 Gerbaux C.V., Villa A., Monamy C., and Bertand A (1997), “Use of lysozyme to inhibit malolactic fermentation and stabilize wine after malolactic fermentation”, Am J Enol.Vitic., 48, pp 49-54 23 Graca Da Silveira M, Golovina EA, Hoekstra FA, Rombouts FM, Abee T (2003), “Membrane fluidity adjustments In etanol-stressed Oenococcus oeni cells”, Appl Environ Microbiol 69, pp 5826-5832 24 Guzzo J, Jobin MP (1998), “Increase of sulphite tolerance in Oenococcus oeni by means of acidic adaptation”, FEMS Microbiol Lett 160, pp 43-47 25 Gvilang H, Winge M, Korch c (1998), “Regulation of S02 formation during fermentation”, European Brewery convention In: Proceedings of the 22nd Congress, Zurich, pp 347-354 26 Henick-Kling T (2005), “pH and regulation of malolactic activity in Leuconostoc oenos”, In: Actualités Orelogiques 89 Comptes rendus du 4e Symposium International d’Oenologie (Bordeaux, 1989), 320-325, Institut d’OEnologie Université de BordeauxDun.od, Paris 27 Henick-Kling T (2003), “Phage infection of malolactic fermentation”, In: Lee T H., (Ed) Malolactic fermentation Pro Semina, 16 August 1984, Melbourne The Australian Wine Research Institute, Glen Osmond, South Australia, pp 128-143 28 Henick-Kling T (2007), “Malolactic fermentation”, In: Fleet G H., (Ed) Wine microbiology and biotechnology, Harwood Academic Publishers, pp 289-326 29 Henick-Kling T., and Park H Y (1994), “Considerations for the use of yeast and bacterial starter cultures: SO2 and timing of inoculation”, Am J Enol Vitic., 45, pp 464-469 57 30 Holm, E.H., Nissen, P (2003), “Red wine extract creates long-life fruit”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 18, pp 728-824 31 Jackson R.S (1994) Wine Science, Principles and Applications, Academic Press, San Diego 32 Laurent M H., T Henick and T E Acree (2004), “Changes in the aroma and odour of Chadonnay wine due to malolactic fermentation”, Vitic Enol Sci., 49, pp.3-10 33 Liu S.-Q (2002), “Malolactic fermentation in wine - beyond acidification”, J Appl.Microbiol., 92, pp 589-601 34 Liu JWR and Gallander J.F (2001), “Effect of pH and sulphur dioxide on the rate of malolactic fermentation in red table wines”, Am J Enol Vitic., 34, pp 44-46 35 Lonvaud-Funel A, Joyeux A, Dessens c (2001), “Inhibition of malolactic fermentation of wines by products of yeast metabolism”, J Sci Food A OTIC.,44, pp 183 -191 36 Nelson Somogy, (1992), “Dertemination of ruducing surgar in beer”, J Biol Chem., 25, pp 151-255 37 Nielsen J C., and M Richekieu, (1999), “Control of flavour development in wine during and after malolactic fermentation”, Appl Environ Microbiol., 65, pp 470475 38 P Ribéreau-Gayon, Y Glories, A Maujean and D Dubourdieu (2000), “Handbook of Enology”, Volume 2: The chemistry of wine and stabilization and treatments, John Wiley & Sons Ltd, pp 43 39 Ramos A A., J S Lolkema, W N Konings, and H Santos (1995), “Enzymebasis for pH regulation of citrate and pyruvat metabolism by Leuconostoc oenos”, Appl Environ Microbiol., 61, pp 1303-1310 40 Rapp A., Mandery H., (1986), “Wine aroma”, Experientia, 42, pp 873-884 41 Ribéreau-Gayon J., Peynaud E., Sudraud P and Ribéreau-Gayon P ,(1982), “Sciences et Techniques du Vin” , Vol 1: Analyse et Contrôle du Vin, 2nd edn Dunod, Paris 42 Romano P., Suzzi G., Domizio P and Fatichenti F (1997), “Secondary products formation as a tool for discrimination non-Saccharomyces wine strains”, Antonie van Leeuwenhoek, 71, pp 239-242 58 43 Swiegers J.H and Pretorius I.S (2005), “Yeast modulation of wine flavor”, Adv Appl Microbiol., 57, pp 131-175 44 Todd B.E.N (1995), “Enhancing the sensory properties of wine using glycosidase activity of wine micro-organisms”, Aust Grapegrow Winemaker 382, pp 22-23 45 Van Vuuren, H J J., and L M T Dicks (1991), “Leuconostoc oenos: A review”, Am J Enol Vitic., 44, pp 99-112 46 Vaughan-Martini A and Martini A (1995), “Facts, myths and legends on the prime industrial microorganism”, J Indust Microbiol., 14, pp 514- 522 47 Wibowo D, Fleet GII.Lee TH, Eschenbrush RE (1988), “Factors affecting the induction of malolactic fermentation in red wines with Leuconostoc oenos”, J Appl Bacteriol 64, pp 421-428 48 Zoecklein B W., Fugelsang K C., Gump B H., Nury F S (1989), “Sampling, fermentation, and production analysis”, In: Zoecklein B W., Fugelsang K C., Gump B H., Nury F S., (Eds), Production wine analysis Van Nostrand Reinhold, New York, pp 9-181 59 [...]... quá trình lên men malolactic, hương và vị của rượu đầy đủ hơn nhưng lại thanh hơn [7] 1.3.3.4 Các chất ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic và quá trình lên menmalolactic 16 Thành phần rượu vang, phương pháp sản xuất và mối tương tác giữa vi khuẩn malolactic và các vi sinh vật khác có thế ảnh hưởng tới sự sống sót và sinh trưởng củavi khuấn malolactic trong rượu vang và vi vậy ảnh hưởng tới... L-malic, L-lactic và axít axetic bằng phương pháp kit chuẩn enzim (Boehringer Mánnhein, Đức) 28 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn malolactic cho sản xuất rượu vang 3.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn malolactic tại Ninh Thuận Các vi khuẩn có khả năng phân giải axít malic trong rượu vang được gọi là vi khuẩn malolactic Để phân lập được các chủng malolactic này, trước... Lactobacillus casei và Lactobacillus plantarum có các enzym của cả hai con đường (đường phân và pentoza-photphat) và chúng thích nghi với một trong hai con đường này phụ thuộc vào điều kiện môi trường [14] 1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni Mặc dù có rất nhiều loài vi khuẩn malolactic sử dụng trong sản xuất rượu vang nhưng O oeni vẫn là loài vi khuẩn được lựa chọn bởi đa số các nhà sản xuất rượu vang O oeni có... 5-10% so với rượu ngoại tương ứng và gây tiêu tốn ngoại tệ cho vi c nhập khuẩn rượu [7] Sản xuất vang theo truyền thống thì lên men malolactic diễn ra tự phát trong suốt quá trình bảo quản vang non trong thời gian vài tháng hoặc nhiều năm Vi khuẩn có nguồn gốc trên vỏ quả nho hoặc ở thùng gỗ Tuy nhiên, trong công nghệ sản xuất vang hiện đại với quá trình chế biến sạch hơn và thời gian bảo quản cần giảm... đoạn nóng và ít mưa kéo dài, thì các vi khuẩn lactic sẽ xuất hiện nhiều hơn trên bề mặt quả nho Tuy nhiên, các loài vi sinh vật ban đầu này xuất hiện rất ít trong rượu vang mà phần lớn là các loại vi khuẩn nhiễm tạp từ các dụng cụ làm rượu trong các giai đoạn khác nhau diễn ra trong quá trình bơm dịch nước nho vào thùng lên men Mặc dù người ta có thể bắt gặp trong các loại rượu vang một số vi khuẩn tự... axít và hàm lượng cồn cao trong rượu Rượu vang cấy các chủng O oeni đã tuyển chọn cho phép dễ dàng kiểm soát toàn bộ quá trình lên men malolactic Ngoài ra, vi c lựa chọn một chủng o oeni có thể cho phép các nhà sản xuất rượu đảm bảo về các tính chất được tạo ra trong sản phẩm cuối cùng Do vậy, rượu vang tạo ra đặc trưng Mặc dù, thường chỉ một chủng vi khuẩn được lựa chọn, nhưng trong một số trường hợp... vi khuẩn E.coli CBT313 và S.cerevisiae RH100 - 4 tái tổ hợp Thành công này cho phép nghĩ tới vi c ứng dụng các chủng nấm men tái tổ hợp trong tương lai, khi chúng hội tụ đầy đủ các tính chất cần có của một chủng nấm men công nghiệp và đồng thời có hoạt tính lên men malolactic mạnh [43] 1.5 Các phương pháp lên men malolactic và khả năng ứng dụng để nâng cao chất lượng rượu vang 20 Rượu vang mới chỉ xuất. .. kiện thuận lợi cho các vi khuẩn Đây là tác nhân quyết định chính tới số lượng của quần thể các vi khuẩn và đối với sự phát triển của chúng trong giai đoạn đầu của quá trình lên men Trong quá trình sản xuất rượu vang, có lên men malolactic, quần thể vi khuẩn tự nhiên pháp triển trải qua rất nhiều pha khác nhau Trong những ngày đầu tiên của quá trình lên men rượu, các loại vi khuẩn và nấm men tự phát... sắc của rượu vang 1.3.3.2 Những thay đổi về hương Các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn malolactic khác nhau có thể tăng hoặc giảm cường độ của các đặc tính hương và vị của rượu vang và những thay đổi này phụ thuộc vào chủng vi khuẩn Ngoài ra, hương rượu vang chịu tác động của lên men malolactic có thể là mùi bơ, mùi hạt dẻ, mùi nấm men, mùi gỗ sồi, mùi mồ hôi và mùi đất Lên men malolactic. .. trưởng của các vi khuẩn malolactic [7] 1.4 Các kỹ thuật nhằm cải thiện quá trình lên men malolactic 1.4.1 Sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic Với mục đích khắc phục một cách hiệu quả các yếu tố bất lợi nói trên người ta đã sử dụng chủng giống vi khuẩn thuần khiết có khả năng lên men malolactic mạnh trong quá trình sản suất rượu vang Để sử dụng các chế phấm này một cách hiệu quả, các nhà sản xuất khuyến cáo

Định dạng
Số trang	65
Dung lượng	1,41 MB