Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn malolactic và ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu vang

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN ĐÌNH DŨNG NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN MALOLACTIC VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƯỢU VANG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2015 MỞ ĐẦU Rượu vang đồ uống có cồn sản xuất từ trình lên men dịch nói chung mà phổ biến từ nho Do nho loại có thành phần hoá học thích hợp cho nấm men phát triển có hương thơm đáp ứng yêu cầu cho sản xuất rượu vang chất lượng cao Trải qua lịch sử hình thành phát triển lâu đời, rượu vang nho với nồng độ rượu vừa phải từ 10-14%v đồ uống có lợi cho sức khỏe người với giá trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon ưa chuộng khắp nơi giới Từ nhiều năm nay, rượu vang nho trở thành thức uống phổ biến nước ta Thị trường rượu vang nước phát triển, nhiên chưa đáp ứng yêu cầu chất lượng Theo số liệu Tổng cục thống kê, kể từ năm 2010 đến nay, rượu vang nhập tăng khoảng 25%/ năm Trong đó, Ninh Thuận biết đến vùng trồng nho có sản lượng lớn nước, trồng chủ yếu giống nho Red Cardinal thường dùng để ăn tươi để lên men rượu cho màu sắc nhạt, không hấp dẫn Do vậy, chất lượng rượu vang Việt Nam chưa thật cao so sánh với rượu vang nhập hương vị sản phẩm chưa đạt tiêu chuẩn, màu sắc dễ bị nâu hoá, sản phẩm bị lắng cặn…Với tiềm thị trường lớn nước ta, việc cải tiến công nghệ để sản xuất rượu vang nho vấn đề quan tâm Nhiều nước giới giải vấn đề nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất rượu vang nho sâu làm rõ chế như: chuyển hóa thành phần nho thành chất thơm rượu vang, tác động điều kiện môi trường đến sinh trưởng phát triển vi khuẩn malolactic trình lên men malolactic[26, 27]…Quá trình lên men rượu vang trình lên men thực chủ yếu nhờ nấm men phần vi khuẩn lactic có mặt nho thiết bị làm rượu Nấm men sử dụng hệ enzym để chuyển hóa glucoza số đường khác thành rượu sản phẩm phụ khác (rượu bậc cao, este, axít hữu ), vi khuẩn lactic chuyển hóa axít malic thành axít lactic CO trình lên men malolactic Lên men malolactic đóng vai trò quan trọng sản xuất rượu vang đỏ số loại vang trắng, trình thiếu việc làm biến đổi thành phần hóa học, mang lại cho rượu vang hương vị đặc trưng Với điều kiện, công nghệ sản xuất rượu vang Việt Nam nay, việc phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn lactic để tối ưu hóa trình lên men malolactic cần thiết Điều giúp nhà sản xuất rượu vang kiểm soát trình sản xuất rượu vang tốt hơn, giảm rủi ro tạo sản phẩm hỏng có chất lượng không ổn định, đồng thời làm đa dạng chủng loại rượu vang phục vụ cho nhu cầu người tiêu dùng Từ mở hướng nghiên cứu cho công nghệ sản xuất rượu vang nho chất lượng cao Việt Nam giải vấn đề thực tiễn ngành sản xuất rượu vang nước.Vì vậy, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn malolactic ứng dụng công nghệ sản xuất rượu vang” CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung rượu vang 1.1.1 Vài nét rượu vang Rượu vang thức uống có cồn sản xuất phương pháp lên men không chưng cất từ dịch nho Nhờ tác nhân lên men (lên men giai đoạn) nhờ nấm men vi khuẩn lactic (lên men hai gian đoạn) tạo cho rượu vang có hương vị đặc trưng, giá trị dinh dưỡng cao hẳn loại rượu khác Thuật ngữ “Rượu vang”- tiếng la tinh “vinum”, bắt nguồn từ chữ “vinea”, có nghĩa nho Trước tiên việc sản xuất rượu vang tiến hành cách ép lấy dịch nho, sau lên men hoàn toàn tự nhiên hang đá Người La Mã có công truyền bá nghề trồng nho làm rượu sang Pháp Marseilles từ kỉ II, sau vùng Champagne Monselle Valley vào khoảng kỉ IV Pháp bắt đầu xuất rượu vang sang Anh Đức vào kỉ XII Vào năm 1857, lần lịch sử, Louis Pasteur công bố nghiên cứu trình lên men, xác định rõ vai trò quan trọng nấm men trình lên men rượu biến đổi hoá sinh trình lên men nấm men Đến có hàng trăm loại rượu vang khác đáp ứng nhu cầu đa dạng người tiêu dùng Phân loại rượu vang dựa màu sắc: vang màu vang trắng, loại vang màu rượu vang đỏ có giá trị cao Ngày nguyên liệu chế biến rượu vang mở rộng loại nguyên liệu khác nhau, phong phú màu sắc chất lượng 1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang Lên men trình trao đổi chất tác dụng enzyme tương ứng Tùy theo sản phẩm tích tụ sau trình lên men mà người ta chia kiểu lên men khác Có hai hình thức lên men lên men yếm khí lên men hiếu khí Lên men rượu trình lên men yếm khí với có mặt nấm men, chúng chuyển hóa đường thành ethanol CO Thực chất trình oxi hoá - khử có mặt enzyme nấm men Năng lượng sinh phục vụ cho hoạt động sống nấm men bị tiêu hao dạng nhiệt Sự thay đổi nhiệt độ trình lên men dẫn tới sốc nhiệt làm ảnh hưởng tới hoạt tính nấm men Do giữ nhiệt độ ổn định trình lên men yếu tố quan trọng giúp trình lên men hoàn thành Quá trình lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính: - Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn với có mặt oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối - Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu CO 2: giai đoạn nấm men hấp thụ chất dinh dưỡng sử dụng enzyme sẵn có thực xúc tác sinh học trình trao đổi chất để trì sống, tạo thành rượu CO Sản phẩm thu hồi trình lên men phức tạp Ngoài ethanol nhiều chất khác este, rượu bậc cao, axit hữu cơ, glycerol, dầu fusel Tỷ lệ sản phẩm phụ phụ thuộc vào điều kiện môi trường lên men Như vậy, ban đầu trình lên men rượu nấm men Saccharomyces cerevissiae đảm nhận Tiếp theo hoạt động vi khuẩn Leuconostoc oenos, Lactobacillus, Pediococcus chuyển hoá đường sót rượu vang non quan trọng trình lên men axít malic thành axít lactic axít xitric thành axít axetic, axetoin, diaxetyl, butađiol 2-3, góp phần đáng kể vào hình thành hương vị đặc trưng rượu vang “Đây trình lên men Malolactic” Trong công nghệ sản xuất rượu vang, trình lên men malolactic tiến hành sau lên men chính, dịch lên men gọi “vang non” tiến hành lắng gặn cặn chuyển sang bồn hay nồi lên men 1.2 Vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic phận hệ vi sinh vật tự nhiên nho, dịch đường rượu vang Vi khuẩn lactic tế bào Gram dương, dị dưỡng hoá hữu cơ, hoạt tính catalaza âm tính axít lactic xem sản phẩm cuối trình trao đổi chất chúng [34] Các loài thường gặp sản xuất rượu vang chủ yếu thuộc giống sau: Pediococcus, Leuconostoc, Oenococcưs Lactobacillus Sự xuất loại vi khuẩn lactic bề mặt nho nhỏ, khoảng 100 tế bào/g (Lafon- Lafourcade et al 1983) Trong suốt trình sản xuất rượu vang, vi khuẩn lactic phát triển, không số lượng mà có thay đổi loài Vi khuẩn phân lập vỏ nho trước thu hoạch thuộc chủ yếu loài Lactobacillus plantarum, L hilgardii L casei (Carre, 1982) Loài Oenococcus oeni trước gọi Leuconostoc oenos (Dicks et al 1995) xuất muộn lại quan trọng nhất, chúng có mặt nho, nho có số lượng Lên men malolactic hoàn thành cuối pha tĩnh đầu pha suy vong Nhưng có điều kiện thích hợp, lên men malolactic kết thúc cuối pha phát triển Cuối cùng, kết thúc lên men malolactic, cần phải Sulfit hoá rượu vang để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn sống 1.2.1 Phân loại kiểu hình vi khuẩn lactic rượu vang Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi sinh vật Gram dương nhuộm mầu phép thử Gram có liên quan tới cấu tạo thành tế bào Các vi khuẩn Leucơnostoc Oenococcus (hình 1-2) có dạng hình cầu Đó tế bào nhỏ (kích thước từ 0,5 - Lim) tròn dài tạo cặp chuỗi Tuỳ vào đa dạng sản phẩm trao đổi chất loại đường, vi khuẩn lactic phân biệt thành nhóm: - Nhóm sinh axít lactic (> 85%) từ glucoza gọi lên men đồng loài thuộc giống Pediococcus loài Lactobacillus mali Nhóm mà bên cạnh axít lactic, sản xuất axít axêtic, êtanol C02, gọi lên men dị hình 1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni Mặc dù có nhiều loài vi khuẩn malolactic sử dụng sản xuất rượu vang O oeni loài vi khuẩn lựa chọn đa số nhà sản xuất rượu vang O oeni có tên gọi trước Leuconostoc oenos, loài hiếu khí tùy tiện sinh trưởng môi trường có pH thấp (pH 4,2-4, 8) bổ sung nước cà chua nước nho [26] Ở vùng sản xuất rượu nho, có mặt dịch hèm rượu vang non Nguồn cacbon (có nguồn gốc từ loại đường), nitơ (từ axit amin tự chuỗi peptit ngắn), vitamin (axit nicotinic, thiamin uracil) toàn nhu cầu cho sinh trưởng tối ưu vi khuẩn Tế bào O oeni có hình cầu tồn dạng chuỗi sinh trưởng môi trường rắn 1.3 Quá trình lên men malolactic 1.3.1 Bản chất trình lên men malolactic Trong lên men rượu vang người ta gọi trình phân giải axit malic xitric tác dụng enzym malolactic O oeni trình lên men lactic, trình quan trọng bậc giai đoạn lên men phụ rượu vang sâm panh [3, 42] Trong rượu vang non, loại trực khuẩn cầu khuẩn lactic bị tiêu diệt gần hoàn toàn sót lại số lượng ỏi tế bào vi khuẩn O oeni từ 102-103 CFU/ml Tuy nhiêu, tác nhân trình quan trọng giai đoạn lên men phụ kéo dài trình lên men malolactic Đặc trưng trình chuyển hoá hoàn toàn diaxít malic xitric có dịch phần sinh sau trình lên men (khoảng 10 g/1) thành monoaxít lactic axetic vi khuẩn O oeni [32] 1.3.2 Vai trò trình lên men malolactic Những nghiên cứu gần cho thấy, rượu vang trải qua lên men malolactic cho chất lượng cao hẳn không trải qua giai đoạn Sự biến đổi chất lượng vang sau trình lên malolactic ba lí chủ yếu sau [3,4,42] - Để giảm độ chua vang axit malic (diaxit) chuyển thành axit lactic (monoaxit) - Làm tăng tính ổn định sinh học rượu vang phát triển vi khuẩn làm nghèo nguồn dinh dưỡng loại khỏi môi trường hai axit hữu quan trọng axit malic axít xitric - Làm tăng tổ hợp thơm vang hợp chất diaxetyl, axetoin 2,3butanediol tạo từ trình chuyển hóa axit xitric vi khuẩn hợp phần tạo nên hương thơm cho vang 1.3.3 Ảnh hưởng trình lên men malolactic đến thành phần chất lượng rượu vang 1.3.3.1 Sự giảm độ chua Mỗi phân tử axit L-malic chuyển hóa tạo axit L-lactic nhóm cacboxyl làm giảm tương ứng độ axit rượu vang Độ giảm axít sau trình lên men malolactic khác phụ thuộc vào nồng độ axít malic 1.3.3.2 Những thay đổi hương Các nhà nghiên cứu chủng vi khuẩn malolactic khác tăng giảm cường độ đặc tính hương vị rượu vang thay đổi phụ thuộc vào chủng vi khuẩn 1.3.3.3 Ảnh hưởng đến màu sắc rượu vang đỏ Lên men malolactic làm tăng kết tủa anthocyanin tannin Phản ứng làm ổn định màu rượu Tính chất cảm quan rượu tăng lên nhiều Hương rượu trở nên quyến rũ Rượu trở nên mềm mại khử gần hoàn toàn axit malic thành axít lactic Kết thúc trình lên men malolactic, hương vị rượu đầy đủ lại 1.4 Các kỹ thuật nhằm cải thiện trình lên men malolactic - Sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic - Sử dụng chế phẩm enzim malolactic để chuyển hoá axít malic - Sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp gen malolactat decacboxylaza sản xuất vang - Các phương pháp lên men malolactic khả ứng dụng để nâng cao chất lượng rượu vang CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, chủng vi sinh hóa chất -Chủng nấm men: Chủng nấm men S.cerevisiae SH09 phân lập Ninh Thuận năm 2008 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp công nghệ Qui trình lên men rượu vang: Sy rô nho pha với tỷ lệ 20%, sau bổ sung đường kính để đạt nồng độ chất khô 250 Bx Lên men chủng nấm men S.cerevisiae SH09 Kết thúc trình này, tiếp tục lên men dịch vòng 10 ngày nhiệt độ 25°C, thu rượu vang non Bổ sung vi khuẩn malolactic (tỷ lệ giống 10 tế bào/ml) để tiến hành lên men malolactic 2.2.2 Phương pháp vi sinh vật - Phương pháp phân lập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên liệu quả, nho - Phương pháp xác định khả lên men chủng vi khuẩn malolactic - Phương pháp xác định hình thái, kích thước tế bào nảy chồi chủng vi khuẩn malolactic kính hiển vi - Phương pháp xác định số lượng tế bào buồng đếm hồng cầu đánh them phương pháp [1]… 2.2.3 Phương pháp phân tích lý hóa - Phương pháp đo pH - Phương pháp đo độ đục - Xác định axít bay - Phương pháp phân tích axít tổng số Xác định hàm lượng cồn theo TCVN 378:1986 Etanol xác định phương pháp cất thiết bị Distiller Merck, sau xác định độ cồn alcohol metter Xác định hàm lượng axít L-malic, L-lactic axít axetic phương pháp kit chuẩn enzim (Boehringer Mánnhein, Đức) CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn malolactic cho sản xuất rượu vang 3.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn malolactic Ninh Thuận Các vi khuẩn có khả phân giải axít malic rượu vang gọi vi khuẩn malolactic Để phân lập chủng malolactic này, trước hết phải tiến hành phân lập sơ có định hướng (vi khuẩn gram dương, catalaza âm tính, khả phân giải CaCO3, ) để thu nhận chủng vi khuẩn lactic, xác định khả lên men malolactic chủng nhằm tìm chủng có đặc tính công nghệ phù hợp cho lên men malolactic rượu vang đỏ Phân lập sơ chủng vi khuẩn lactic có định hướng lên men malolactic từ nho Ninh Thuận, kết trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Đặc tính sinh lý chủng vi khuẩn lactic phân lập Tên Mầu sắc hình dạng khuẩn lạc Hình dạng tế bào NT1 Vàng nhạt, tròn, nhẵn, nhỏ NT2 chủng Gram Phân giải CaCO3 (+) Que ngắn, chuỗi 2, tế bào + + Trắng, tròn, xù xì, to Cầu nhỏ, chuỗi tế bào + + NT3 Trắng, tròn, gồ ghề, to Cầu, chuỗi , tế bào + + NT4 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu nhỏ, chuỗi tế bào + + NT5 Trắng, tròn, gồ ghề, vừa Cầu to, chuỗi tế bào + + NT6 Trắng, tròn, nhẵn, to Que ngắn, chuỗi 2, tế bào + + NT7 Vàng nhạt, tròn, xù xì, vừa Que dài, chuỗi tế bào + + NT8 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 3, tế bào + + NT9 Trắng nhạt, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 2, + + NT10 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 2,4 tế bào + + NT11 Trắng sữa, nhẵn, to Cầu, chuỗi tế bào + + NT12 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 2, tế bào + + NT13 Trắng , tròn, nhẵn, nhỏ Que dài, chuỗi tế bào + + NT14 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 3, tế bào + + NT15 Vàng, tròn, nhẵn, to Que ngắn, đơn bào + + NT16 Vàng, tròn, xù xì, dẹt Que dẹt, đơn bào + + NT17 Vàng, xù xì, nhỏ Que dẹt, chuỗi tế bào + + NT18 Trắng, xù xì, to Que ngắn, chuỗi tế bào + + NT19 Trắng, tròn, to Que, chuỗi 2, tế bào + + NT20 Vàng, xù xì, to Que, chuỗi tế bào + + Kết bảng 3.1 cho thấy 20 chủng vi khuấn gram (+) có vòng phân giải CaCO3 phân lập Trong đó, tương ứng với loại nguyên liệu nho nho Các chủng có hình thái khuấn lạc tròn, có bề mặt nhẵn xù xì, kích thước thay đổi từ nhỏ sang to chủ yếu có mầu trắng Hình dạng tế bào vi khuẩn thay đổi từ hình que đến hình cầu, có tế bào đơn lẻ chuỗi đôi, chuỗi 3.1.2 Xác định khả lên men malolactic chủng vi khuẩn phân lập Các chủng vi khuấn lactic phân lập được thí nghiệm lên men bình dulham nhằm xác định khả sinh khí kiểu hình lên men, thí nghiệm điều kiện có ôxy để xác định đặc tính kỵ khí hiếu khí Kết thí nghiệm trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 Đặc tính trao đổi chất chủng vi khuân lactic phân lập Tên Sinh Khí chủng Kiểu hình lên men Kiểu hô hấp Phân giải axít malic Hoạt tính catalaza NT1 + Dị hình Hiếu khí - - NT2 - Đồng hình Kỵ khí tùy tiện - - NT3 + Dị hình Kỵ khí + - NT4 + Dị hình Hiếu khí - - NT5 + Dị hình Hiếu khí - - NT6 + Dị hình Kỵ khí + - NT7 - Đồng hình Kỵ khí - - NT8 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + - NT9 + Dị hình Kỵ khí + - NT10 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + - NT11 - Đồng hình Kỵ khí - - NT12 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + - NT13 - Đồng hình Kỵ khí - - NT14 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + - Tên Sinh Khí chủng Kiểu hình lên men Kiểu hô hấp Phân giải axít malic Hoạt tính catalaza NT15 + Dị hình Hiếu khí - - NT16 - Đồng hình Kỵ khí - - NT17 + Dị hình Hiếu khí - - NT18 + Dị hình Hiếu khí - - NT19 + Dị hình Kỵ khí + - NT20 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện - - Từ bảng 3.2, chọn chủng NT3, NT6, NT8, NT9, NT10, NT12, NT14, NT19 có khả lên men malolactic Chúng chủng có hoạt tính catalaza âm tính, lên men dị hình, kỵ khí kỵ khí tuỳ tiện cho nghiên cứu Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuấn có khả lên men malolactic cao Chúng lấy chủng chọn NT3, NT6, NT8, NT9, NT10, NT12, NT14, NT19 cho nuôi cấy môi trường nước nho axít (AG), nhiệt độ nuôi cấy 25oC Kết tuyển chọn chủng vi khuấn có khả lên men malolactic cao môi trường nước nho axít (AG) trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Khả lên men malolactic chủng vi khuẩn phân lập Chủng vi khuấn Hàm lượng axít malic (g/l) Trước lên men Sau lên men Hàm lượng axít lactic (g/l) Trước lên men Sau lên men Thời gian lên men (ngày) NT3 2,15 0,81 0,3 1,38 29 NT6 2,15 0,39 0,3 1,39 31 NT8 2,15 0,92 0,3 1,05 26 NT9 2,15 0,28 0,3 1,56 24 NT10 2,15 0,49 0,3 1,37 40 NT12 2,15 0,20 0,3 1,61 23 NT14 2,15 1,01 0,3 1,01 28 NT19 2,15 1,29 0,3 0,98 36 Từ kết chọn chủng NT9 NT12 có khả phân giải axít malic tốt với hàm lượng axít malic dư dịch lên men thấp chủng NT9 0,28 g/l, chủng NT12 0,20 g/l Chủng NT9 NT12 có khả lên men malolactic triệt để thời gian ngắn từ 23 đến 24 ngày, lựa chọn cho nghiên cứu 3.1.3 Xác định khả chịu SO2 02 chủng vi khuẩn malolactic phân lập Để đánh giá khả chịu SO2 khả chịu etanol chủng malolactic phân lập tiến hành lên men chủng vi khuấn malolactic NT9 NT12 môi trường nước nho axít (AG) sulphit hóa với hàm lượng K2S2O5 100 mg/l bổ sung etanol tới nồng độ 14%v/v, nhiệt độ nuôi cấy 25oC Bảng 3.4 Hàm lượng axít malic axít lactic trước sau lên men Malolactic môi trường nước nho axít (AG) sulphit hóa với hàm lượng K2S2O5 bổ sung etanol tới nồng độ 14%v/v Chủng vi khuẩn malolactic Axít malic (g/l) Trước lên men Axít lactic (g/l) Sau lên men Trước lên men Sau lên men Thời gian lên men (ngày) NT9 2,15 1,45 0,3 0,8 30 NT12 2,15 0,14 0,3 1,68 25 Từ kết bảng 3.4 nhận thấy Chủng NT9 khả chịu SO2 etanol nên trình lên men malolactic diễn không hoàn toàn Hàm lượng axít malic lại cao, 1,45 g/l sau 30 ngày lên men Còn chủng vi khuẩn lại NT12 có khả phân giải malic tốt điều kiện môi trường sulphit hóa, có nồng độ cồn cao, thể hàm lượng malic lại sau lên men không đáng kể 0,14 g/l có thời gian lên men nhanh 25 ngày 3.2 Nghiên cứu trình lên men malolactic Chủng NT9 Chủng NT12 môi trường rượu vang non Rượu vang non lên men từ dịch nho 2.2.1 chủng nấm men S cervisiae SH09 (có thành phần etanol 12,8% v/v, đường sót 5,2 g/l, axít tong số 5,39 g/l) lên men malolactic chủng NT9, NT12 điều kiện nhiệt độ 25oC Kết phân giải axít malic trình bày bảng 3.5 hình 3.1 Bảng 3.5 Hàm lượng axít malic trước sau trình lên men malolactic chủng vi khuẩn malolactic môi trường rượu vang non Chủng vi khuấn NT9 Axít malic (g/l) Trước lên men 2,15 Sau lên men 0,75 NT12 2,15 0,12 Hình 3.1 So sánh hàm lượng axít malic trước sau trình lên men malolactic chủng vi khuẩn malolactic môi trường rượu vang non Kết bảng 3.5 hình 3.1 cho thấy: Khả phân giải axít malic - Chủng NT9 hàm lượng axít malic dư dịch sau lên men (0,75 g/l) - Chủng NT12 hàm lượng axít malic dư dịch sau lên men (0,12 g/l) Hình 3.2 So sánh hàm lượng axít lactic trước sau trình lên men malolactic chủng vi khuẩn malolactic môi trường rượu vang non Kết hình 3.2 cho thấy: Từ nhận xét nhận thấy Chủng NT12 có khả phân giải axít malic tương đối tốt môi trường vang non Khả phân giải axít malic Chủng NT12 có khả phân giải nhanh mạnh so với Chủng NT9, tạo axit lactic có hàm lượng cao 1,64 g/l Dịch lên men chủng malolactic phân tích thành phần axít axetic kết trình bày bảng 3.7 hình 3.3 Bảng 3.7 Hàm lượng axít axetic trước sau lên men malolactic chủng vi khuẩn malolactic Chủng vi khuấn Axít axetic (g/l) Trước lên men Sau lên men NT9 0,22 0,35 NT12 0,22 0,25 Kết bảng 3.7 hình 3.3 cho thấy: Khả tạo Axít axetic - Chủng NT9 hàm lượng Axít axetic tạo thành dịch sau lên men (0,35 g/l) - Chủng NT12 hàm lượng Axít axetic tạo thành dịch sau lên men thấp (0,25 g/l) Hình 3.3 So sánh hàm lượng axít axetic trước sau lên men malolactic chủng vi khuẩn malolactic Dịch lên men chủng malolactic phân tích thành phần diaxetyl kết trình bầy bảng 3.8 hình 3.4 Bảng 3.8 Hàm lượng diaxetyl trước sau lên men malolactic chủng vi khuẩn malolactic Chủng vi khuấn Diaxetyl (g/l) Trước lên men Sau lên men NT9 0,20 0,25 NT12 0,20 0,27 Kết bảng 3.8 cho thấy: Chủng vi khuẩn NT12 có khả tạo hàm lượng axít axetic thấp (0,25 g/l) tạo diaxetyl cao (0,27 mg/l) Diaxetyl chất quan trọng trình lên men malolactic Đối với vang đỏ, hàm lượng từ 0,2-0,4 mg/l đóng góp tích cực vào giá trị cảm quan rượu Từ nhận xét trên, rút kết luận chủng vi khuẩn NT12 có số ưu điểm Chủng NT9 Đặc biệt, khả tạo diaxetyl không cao Chủng NT12 phù hợp cho sản xuất loại rượu vang đỏ mùi bơ, ngậy 3.3 Nghiên cứu khả tạo chất thơm chủng vi khuẩn malolactic Ngoài khả khử axít L-malic thành axít L-lactic, lên men malolactic tác động tới cân hương vị rượu vang thành phẩm tạo nhiều chất thơm bay Hàm lượng số chất hay tạo thành sau trình lên men malolactic rượu vang non chủng trình bày bảng 3.9 Bảng 3.9 Một số chất bay tạo thành sau trình lên men malolactic 02 chủng Tên chủng Axít axetic (mg/L) Trước MLF Sau Axít Axetolactic (mg/L) Sau MLF Trước MLF MLF Diaxetyl (mg/L) Trước MLF Sau 2,3 Butanediol (mg/L) Sau MLF Trước MLF MLF NT9 216 405 1,15 1,48 0,21 0,25 234 345 NT12 221 251 1,17 1,78 0,32 0,31 231 415 Hình 3.5 So sánh hàm lượng axit axetic tạo thành sau trình lên men malolactic chủng Từ kết bảng 3.9 hình 3.5, chọn Chủng NT12 cho nghiên cứu Chủng NT12 có số đặc tính sau - Khả chịu SO2 tốt chủng phân lập được: K2S2O5 100mg/l - Khả lên men malolactic môi trường rượu vang non tốt chủng phân lập - Khả tạo chất thơm tốt trong chủng phân lập 3.4 Nghiên cứu xác định điều kiện tối ưu trình lên men malolactic O.oeni NT12 3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng chất dinh dưỡng bổ sung đến trình lên men malolactic Thí nghiệm tiến hành lên men malolactic mẫu sử dụng chất dinh dưỡng bổ sung (chế phẩm Essentials Oenos) 01 mẫu đối chứng Hình 3.6 Hàm lượng axít malic phân giải trình tàng trữ có bổ sung dinh dưỡng khác theo thời gian Từ kết hình 3.6, lựa chọn nồng độ Essentials Oenos thấp 0,025 g/l để bổ sung cho trình lên men malolactic 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men malolactic Tiến hành thí nghiệm với mẫu lên men malolactic bổ sung vi khuẩn lactic điều kiện nhiệt độ khác Kết thời gian lên men malolactic hình thành số tính chất quan trọng rượu vang trình bày bảng 3.12 Bảng 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ đến chuyển hóa axít malolaic thành axít lactic trình lên men malolactic Nhiệt độ lên men (0C) Axit malic (g/1) Axit lactic (g/1) Axít bay (g/1) axít axetic) Thời gian lên men malolactic (ngày) 15 1,45 0,92 0,28 45 20 0,12 1,80 0,30 23 25 0,12 1,81 0,35 20 30 0,11 1,82 0,46 19 Do vậy, nhiệt độ trình lên men malolactic chọn 20°C Tiến hành lên men malolactic điều kiện nhiệt độ 20°C, có bổ sung chế phẩm Essentials Oenos nồng độ 0,025 g/1, sau xác định thành phần rượu vang kết trình bày bảng 3.13 Bảng 3.13 Thành phần rượu vang sau kết thúc trình lên men malolactic Trước lên men Sau lên men malolactic 12,8 malolactic 12,3 Axít tổng số (g/1 H2SO4) 5,39 4,9 Axít bay (g/1 axít axetic) 0,23 0,28 Axít malic (g/1) 2,04 0,12 Axít lactic (g/1) 0,45 1,78 pH 3,4 3,5 Thành phần Etanol (%v/v) Từ kết thu được, đưa kết luận sau Quá trình lên men malolactic chủng môi trường rượu vang non đạt hiệu cao với hàm lượng axít malic lại 0,12 g/1 điều kiện bổ sung chế phẩm Essentials Oenos nồng độ 0,025 g/1, nhiệt độ lên men 20°C thời gian lên men 23 ngày 3.4.3 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic đến chất lượng rượu vang Thí nghiệm trình bày kết trình lên men mallolactic thực với thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic khác Quá trình lên men thực mục 2.2.1 nho sau nghiền xử lý với K 2S205 enzym Pectinex, lên men với chủng nấm men S.cerevisiae SH09, vi khuẩn lactic J cho vào thời điểm trước, sau trình lên men rượu Bảng 3.14 Thời gian lên men hàm lượng axít malic, axít lactic sau trình lên men malolactic thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic khác Mẫu Axít malic (g/1) Axít lactic (g/1) Thời gian lên men (ngày) ĐC 0,10 1,64 23 F 0,09 1,68 14 M 0,09 1,66 12 E 0,09 1,69 14 Đã xác định điều kiện tối ưu trình lên men malolactic cho chủng NT 12 môi trường rượu vang non quy trình sản xuất rượu vang đỏ: Nồng độ Essentials Oenos thấp 0,025 g/l để bổ sung cho trình lên men malolactic.Nhiệt độ lên men 200C Thời gian lên men 23 ngày Bổ sung bổ sung vi khuẩn lactic sau 48 h trình lên men rượu, hàm lượng đường khử giảm xuống khoảng 25% KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ kết thu được, rút số kết luận sau đây: Từ 20 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ vùng trồng nho Ninh Thuận, chủng có khả chuyển hóa axit malic thành axit lactic Tuyển chọn chủng NT12 có khả phân giải malolactic tốt hàm lượng axít malic dư dịch sau lên men malolactic 0,12 g/l Đã xác định điều kiện tối ưu trình lên men malolactic cho chủng NT12 môi trường rượu vang non quy trình sản xuất rượu vang đỏ: - Nồng độ Essentials Oenos thấp 0,025 g/l để bổ sung cho trình lên men malolactic - Nhiệt độ lên men 200C - Thời gian lên men 23 ngày - Bổ sung bổ sung vi khuẩn lactic sau 48 h trình lên men rượu, hàm lượng đường khử giảm xuống khoảng 25% Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu xác định thêm số điều kiện tối ưu cho chủng NT 12 để ứng dụng sản xuất thử nghiệm rượu vang đỏ chất lượng cao Việt Nam [...]... phù hợp cho sản xuất các loại rượu vang đỏ không có mùi bơ, ngậy 3.3 Nghiên cứu khả năng tạo chất thơm của các chủng vi khuẩn malolactic Ngoài khả năng khử axít L-malic thành axít L-lactic, lên men malolactic còn tác động tới sự cân bằng hương và vị của rượu vang thành phẩm do nó tạo ra nhiều chất thơm và bay hơi Hàm lượng một số chất hay hơi tạo thành sau quá trình lên men malolactic rượu vang non của... trình sản xuất rượu vang đỏ: - Nồng độ Essentials Oenos thấp nhất là 0,025 g/l để bổ sung cho quá trình lên men malolactic - Nhiệt độ lên men là 200C - Thời gian lên men là 23 ngày - Bổ sung bổ sung vi khuẩn lactic sau 48 h của quá trình lên men rượu, khi hàm lượng đường khử giảm xuống khoảng 25% 2 Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu xác định thêm một số điều kiện tối ưu cho chủng NT 12 để ứng dụng và sản xuất. .. sung vi khuẩn lactic khác nhau Quá trình lên men được thực hiện như ở mục 2.2.1 nho sau khi nghiền và xử lý với K 2S205 và enzym Pectinex, được lên men với chủng nấm men S.cerevisiae SH09, vi khuẩn lactic J được cho vào các thời điểm trước, giữa và sau quá trình lên men rượu Bảng 3.14 Thời gian lên men và hàm lượng axít malic, axít lactic sau quá trình lên men malolactic ở các thời điểm bổ sung vi khuẩn. .. axetic được tạo thành trong dịch sau lên men thấp nhất là (0,25 g/l) Hình 3.3 So sánh hàm lượng axít axetic trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic Dịch lên men của các chủng malolactic còn được phân tích thành phần diaxetyl kết quả trình bầy ở bảng 3.8 và hình 3.4 Bảng 3.8 Hàm lượng diaxetyl trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic Chủng vi khuấn Diaxetyl... quá trình lên men malolactic cho chủng NT 12 trên môi trường rượu vang non trong quy trình sản xuất rượu vang đỏ: Nồng độ Essentials Oenos thấp nhất là 0,025 g/l để bổ sung cho quá trình lên men malolactic. Nhiệt độ lên men là 200C Thời gian lên men là 23 ngày Bổ sung bổ sung vi khuẩn lactic sau 48 h của quá trình lên men rượu, khi hàm lượng đường khử giảm xuống khoảng 25% KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1 Kết luận... tôi chọn Chủng NT12 cho các nghiên cứu tiếp theo vì Chủng NT12 có 1 số đặc tính sau - Khả năng chịu SO2 là tốt nhất trong các chủng phân lập được: K2S2O5 100mg/l - Khả năng lên men malolactic trên môi trường rượu vang non là tốt nhất trong các chủng phân lập được - Khả năng tạo chất thơm tốt nhất trong trong các chủng phân lập được 3.4 Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ưu quá trình lên men malolactic. .. 30 ngày lên men Còn chủng vi khuẩn còn lại là NT12 có khả năng phân giải malic rất tốt trong điều kiện môi trường được sulphit hóa, có nồng độ cồn cao, thể hiện ở hàm lượng malic còn lại sau lên men là không đáng kể là 0,14 g/l và có thời gian lên men nhanh là 25 ngày 3.2 Nghiên cứu quá trình lên men malolactic của Chủng NT9 và Chủng NT12 trên môi trường rượu vang non Rượu vang non lên men từ dịch nho... trước và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non Kết quả trên bảng 3.5 và hình 3.1 cho thấy: Khả năng phân giải axít malic - Chủng NT9 hàm lượng axít malic còn dư trong dịch sau lên men là (0,75 g/l) - Chủng NT12 hàm lượng axít malic còn dư trong dịch sau lên men là (0,12 g/l) Hình 3.2 So sánh hàm lượng axít lactic trước và sau quá trình lên men malolactic. .. 3.2, chúng tôi chọn 8 chủng là NT3, NT6, NT8, NT9, NT10, NT12, NT14, NT19 có khả năng lên men malolactic Chúng đều là các chủng có hoạt tính catalaza âm tính, lên men dị hình, kỵ khí hoặc kỵ khí tuỳ tiện cho nghiên cứu tiếp theo Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuấn có khả năng lên men malolactic cao Chúng tôi lấy 8 chủng đã chọn NT3, NT6, NT8, NT9, NT10, NT12, NT14, NT19 cho nuôi cấy trong môi trường... chúng tôi chọn chủng NT9 và NT12 vì có khả năng phân giải axít malic tốt nhất với hàm lượng axít malic còn dư trong dịch lên men thấp nhất chủng NT9 là 0,28 g/l, chủng NT12 là 0,20 g/l Chủng NT9 và NT12 còn có khả năng lên men malolactic triệt để nhất trong thời gian ngắn từ 23 đến 24 ngày, được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo 3.1.3 Xác định khả năng chịu SO2 của 02 chủng vi khuẩn malolactic