Nghiên cứu cố định vi khuẩn lactobacillus reuteri sử dụng làm chế phẩm sinh học

Khả năng chống chịu của vi khuẩn cố định trên các loại chất mang so với vi khuẩn không được cố định ở điều kiện nhiệt độ cao.... Khả năng chống chịu của vi khuẩn cố định trên các loại ch

NGUYỄN THỊ HẠNH

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH VI KHUẨN LACTOBACILLUS REUTERI

SỬ DỤNG LÀM CHẾ PHẨM SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khóa học : 2012 – 2016

THÁI NGUYÊN – 2016

NGUYỄN THỊ HẠNH

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH VI KHUẨN LACTOBACILLUS REUTERI

SỬ DỤNG LÀM CHẾ PHẨM SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khóa học : 2012 – 2016 Giáo viên hướng dẫn : ThS Bùi Tuấn Hà

THÁI NGUYÊN – 2016

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Tuấn Hà đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lời cho tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Qua đây tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè, người thân luôn quan tâm, động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường để tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 6 năm 2016

Nguyễn Thị Hạnh

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Trang

Bảng 2.1: Những điểm tương đồng về mặt hình thái của L.reuteri và Lactobacillus 4

Bảng 2.2: Những khác biệt về hình thái của L.reuteri so với Bacillus 4

Bảng 2.3 :Tỷ lệ rửa trôi sau tái sử dụng lên men chế phẩm tế bào cố định (%) 12

Bảng 2.4: So sánh chất mang alginate và chất mang BC trong cố định tế bào nấm men: 15

Bảng 3.1: Thành phần môi trường MRS 24

Bảng 3.2: Các thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụng trong thí nghiệm: 25

Bảng 4.1: Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định tế bào vi khuẩn bằng chất mang algiante 38

Bảng 4.2: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với điều kiện nhiệt độ 40oC 41

Bảng 4.3: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với điều kiện nhiệt độ 45oC 42

Bảng 4.4: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với điều kiện nhiệt độ 50oC 43

Bảng 4.5: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với pH = 1 44

Bảng 4.6: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với pH = 2 45

Bảng 4.7: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với pH = 3 46

Bảng 4.8: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với muối ăn nồng độ 3% 48

Bảng 4.9: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với muối ăn nồng độ 5% 49

Bảng 4.10: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với nồng độ NaCl 7% 50

Bảng 4.11: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với độ ẩm 5% 51

Bảng 4.12: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với độ ẩm 8% 52

Bảng 4.13: Sự chống chịu của vi khuẩn cố định với độ ẩm 10% 53

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ

Trang

Hình 2.1: Lactobacillus reuteri dưới kính hiển vi 3

Hình 2.2: Sơ đồ các phương pháp cố định tế bào.[23] 8

Hình 2.3: Sơ đồ công nghệ sản xuất chế phẩm probiotics 16

Hình 3.1: Sơ đồ pha loãng mẫu lỏng theo dãy thập phân 27

Hình 3.2: Sơ đồ pha loãng mẫu cấy lên môi trường đĩa thạch 27

Hình 4.1: Khuẩn lạc sau khi được cố định trên các chất mang ở điều kiện 40oC 40

Hình 4.2: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện nhiệt độ 40oC 41

Hình 4.3: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện nhiệt độ 45oC 42

Hình 4.4: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện nhiệt độ 50oC 43

Hình 4.5: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện pH = 1 44

Hình 4.6: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện pH = 2 45

Hình 4.7: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện pH = 3 46

Hình 4.8: Khuẩn lạc sau khi được cố định trên các chất mang với NaCl 3% 47

Hình 4.9: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện NaCl 3% 48

Hình 4.10: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện NaCl 5% 49

Hình 4.11: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện NaCl 7% 50

Hình 4.12: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện độ ẩm 5% 51

Hình 4.13: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện độ ẩm 8% 52

Hình 4.14: Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang khác nhau ở điều kiện độ ẩm 10% 53

DANH MỤC CÁC CỤM, TỪ VIẾT TẮT

BC: Bacterial cellulose

WHO: World Health Organization

FAO: Food and Agriculture Organization

ATSH : An toàn sinh học

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN Error! Bookmark not defined

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC CỤM, TỪ VIẾT TẮT iv

MỤC LỤC v

Phần 1 : MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích của đề tài 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 2

1.4 Ý nghĩa của đề tài 2

Phần 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Cơ sở khoa học 3

2.1.1 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Lactobacillus reuteri 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Lactobacillus reuteri 3

2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri 4

2.1.4 Chức năng của probiotic 6

2.2 Các phương pháp cố định vi khuẩn 8

2.2.1 Khái quát chất mang 8

2.2.2 Chất mang Alginate 10

2.2.3 Bacterial cellulose (BC) 12

2.3 Chế phẩm sinh học probiotics 16

2.3.1 Công nghệ sản xuất chế phẩm probiotic 16

2.3.2 Ứng dụng của chế phẩm sinh học trong đời sống 17

2.4 Tình hình nghiên cứu 20

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 21

2.4.2 Tình hình nghiên cứu thế giới 21

Phần 3 : ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 24

3.1.1 Môi trường nuôi cấy 24

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ, hóa chất 25

3.2 Địa điểm và thời gian ngiên cứu 25

3.3 Nội dung nghiên cứu 25

3.4 Phương pháp nghiên cứu 26

3.4.1 Phương pháp chuẩn bị dụng cụ, hóa chất 26

3.4.2 Phương pháp đổ đĩa thạch 26

3.4.3 Xác định số lượng vi khuẩn L reuteri theo phương pháp đếm khuẩn lạc 27

3.4.4 Phương pháp thí nghiệm 28

3.4.5 Phương pháp nghiên cứu 29

3.4.6 Phương pháp nghiên cứu khả năng chống chịu của vi khuẩn L reuteri cố định trên chất mang Natri - alginate ở các điều kiện khác nhau 30

3.4.7 Phương pháp nghiên cứu khả năng chống chịu của vi khuẩn L reuteri cố định trên chất mang Bacterial Cellulose ở các điều kiện khác nhau 33

3.4.8.Phương pháp nghiên cứu khả năng chống chịu của vi khuẩn L reuteri ở môi trường tế bào tự do 36

Phần 4 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Kết quả thí nghiệm 37

4.1.1 Cố định vi khuẩn L reuteri lên trên chất mang Natri - alginate 37

4.1.2 Cố định vi khuẩn L reuteri lên trên chất mang Bacterial Cellulose 38

4.2 Kết quả nghiên cứu khả năng chống chịu của vi khuẩn L reuteri cố định trên các loại chất mang ở các điều kiện khác nhau 39

4.2.1 Khả năng chống chịu của vi khuẩn cố định trên các loại chất mang so với vi khuẩn không được cố định ở điều kiện nhiệt độ cao 40

4.2.2.Khả năng chống chịu của vi khuẩn cố định trên các loại chất mang so với vi khuẩn không được cố định ở điều kiện pH thấp 44

4.2.3 Khả năng chống chịu của vi khuẩn cố định trên các loại chất mang so với vi

khuẩn không được cố định ở điều kiện nồng độ muối ăn cao 47

4.2.4 Khả năng chống chịu của vi khuẩn cố định trên các loại chất mang so với vi khuẩn không được cố định ở điều kiện độ ẩm thấp 51

Phần 5 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

5.1 Kết luận 54

5.2 Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Cơ thể người và động vật, đặc biệt là đường tiêu hóa, chứa một hệ thống phức tạp và đa dạng các chủng vi khuẩn Chúng ta có xu hướng nghĩ rằng các vi khuẩn đều có hại như "vi trùng", nhưng thực ra nhiều vi khuẩn có vai trò quan trọng trong

việc hỗ trợ các chức năng của cơ thể.Vi khuẩn Lactobacillus được sử dụng phổ biến

làm probiotic cho người và động vật Cách đây hơn 100 năm, con người đã sử dụng

các vi khuẩn Lactobacillus bổ sung vào thực phẩm nhằm tăng thời gian bảo quản,

tăng vị ngon, tạo ra các cấu trúc khác nhau trong thực phẩm Hương vị của sản

phẩm là do các sản phẩm trao đổi chất của Lactobacillus, chẳng hạn Yogurt là sản

phẩm được bán rất phổ biến ở Mỹ, Yogurt được làm từ sữa bò, dê, cừu,…[32] kết

hợp với các loại Streptococcus thermophiles và Lactobacillus acidophilus hoặc lactobacillus bulgaricus; diacety có trong các sản phẩm sữa lên men; trong các sản phẩm sữa lên men bổ sung Lactobacillus acidophilus có thể giúp cho những người

không có khả năng hấp thu sữa có khả năng hấp thu tốt hơn Ngoài ra, còn nhiều sản phẩm khác mang tính chất truyền thống như dưa muối, cà muối,…[22]

Tuy nhiên một trở ngại lớn đối với tác dụng có lợi của vi khuẩn là khả năng sống sót trong hệ tiêu hóa của đối tượng sử dụng Ví dụ, độ pH của dạ dày là rất thấp, chỉ khoảng 2-4, điều này quan trọng cho quá trình tiêu hoá và tiêu diệt các vi khuẩn có hại, độ pH tăng dần từ dạ dày đến ruột già; có nhiều loại hợp chất và kháng khuẩn tác động không tốt tới các loại vi khuẩn như muối mật, acid dạ dày; chúng có thể bị hủy diệt làm giảm số lượng lớn khi phải đi qua một đoạn đường ở ống tiêu hóa dài.[4]

Có nhiều giải pháp để khác phục vấn đề trên như việc chọn giống vi khuẩn, chuyển vi khuẩn về dạng bào tử và trong đó việc cố định tế bào vi khuẩn lên chất mang là một phương pháp được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong thực tiễn Chẳng hạn cố định lên Natri alginate, Bacterial Cellulose, agar,…là những loại chất mang rẻ tiền và dễ tìm nên được sử dụng nhiều trong nghiên cứu cố định vi sinh vật

Vì vậy em tiến hành nghiên cứu đề tài : Nghiên cứu cố định vi khuẩn Lactobacillus reuteri sử dụng làm chế phẩm sinh học nhằm xác định phương

pháp cố định phù hợp cho vi khuẩn Lactobacillus reuteri và đánh giá hiệu quả của

phương pháp cố định tới khả năng chống chịu của vi khuẩn

1.2 Mục đích của đề tài

- Tìm ra được hướng bảo quản tốt nhất chủng Lactobacillus reuteri mà vẫn đảm

bảo yêu cầu về kinh tế

- Tìm ra được chất mang phù hợp nhất cố định cho vi khuẩn Lactobacillus reuteri

1.3 Yêu cầu của đề tài

- Nghiên cứu được cố định vi khuẩn Lactobacillus reuteri trên Bacterial Cellulose

- Nghiên cứu được cố định vi khuẩn Lactobacillus reuteri trên Natri alginate

- Đánh giá được khả năng chống chịu của vi khuẩn cố định trên các loại chất mang chất mang ở các điều kiện khác nhau

1.4 Ý nghĩa của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học

- Kết quả nghiên cứu sẽ xác định được loại chất mang và điều kiện mà vi khuẩn

lactobacillus reuteri có thể chống chịu được

- Đề tài là tài liệu tham khảo các sinh viên, các nhà nghiên cứu khi tìm hiểu về

các việc cố định vi khuẩn lactobacillus reuteri

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn đời sống

Áp dụng để bảo quản tốt chủng vi khuẩn lactobacillus reuteri

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cơ sở khoa học

2.1.1 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Lactobacillus reuteri

Lactobacillus reuteri là một vi khuẩn gram dương, sống tự nhiên trong đường tiêu hóa của động vật có vú và chim Vào đầu thế kỷ 20, các loài Lactobacillus reuteri đã được công nhận và được ghi trong phân loại khoa học của vi khuẩn axit lactic, nó đã bị nhầm như một thành viên của Lactobacillus fermentum Năm 1960,

vi sinh vật học người Đức Gerhard Reuter có đã phân biệt được L reuteri từ Lactobacillus fermentum L reuteri cuối cùng đã được xác định là một loài riêng

biệt vào năm 1980 bởi Kandler et al Họ đã chọn tên loài là "reuteri" sau phát hiện

của Gerhard Reuter, và L reuteri có kể từ khi được công nhận là một loài riêng biệt trong chi Lactobacillus.[42]

* Đặc điểm phân loại

Vi khuẩn L reuteri có đặc điểm phân loại như sau:

Tộc: Lactobacilleae Loài: Lactobacillus reuteri

* Đặc điểm phân bố: vi khuẩn L.reuteri có mặt trong các sản phẩm đồ hộp,

chúng phân bố tương đối rộng rãi trong tự nhiên

2.1.2 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Lactobacillus reuteri

Hình 2.1: Lactobacillus reuteri dưới kính hiển vi

Vì có quan hệ với hai giống Bacillus và Lactobacillus nên hình thái của L.reuteri có những điểm tương đồng Lactobacillus và khác biệt với Bacillus

Bảng 2.1: Những điểm tương đồng về mặt hình thái của L.reuteri và

Bảng 2.2: Những khác biệt về hình thái của L.reuteri so với Bacillus

Hình dạng khuẩn lạc Khuẩn lạc Bacillus có bề mặt nhẵn, L.reuteri có bề mặt

2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri

- Môi trường nuôi cấy: khó nuôi cấy, cần những hợp chất phức tạp để phát triển như: pepton, cao thịt, cao nấm men Môi trường nuôi cấy thích hợp: MRS

- Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu là khoảng 37 – 42oC

- pH tăng trưởng tối ưu là khoảng 6,5

L reuteri không đòi hỏi điều kiện yếm khí cho sự tăng trưởng, bình thường sống trong bầu khí quyển oxy hạn chế Chủng L reuteri dựa vào sự sẵn có của các loại đường dễ dàng lên men, acid amin, vitamin và các nucleotide, L reuteri có thể

sử dụng một số chất nhận electron bên ngoài (fructose, glycerol, nitrat, pyruvate,

citrate và oxy) để đạt được năng lượng bổ sung và tăng tốc độ tăng trưởng hơn nữa (Gerez et al, 2008)[21]

* Các yếu tố ảnh hưởng đến vi khuẩn L reuteri

2.1.3.1 Ảnh hưởng của pH

pH là số đo hoạt tính của ion hydrogen trong môi trường, thang pH thay đổi từ

0 – 14, pH có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật vi sinh vật ưa acid có pH phát triển tốt nhất khoảng 0 – 5.5, vi sinh vật ưa trung tính từ 5.5 – 8, vi sinh vật ưa kiềm từ 8.5 – 11.5, vi sinh vật ưa kiềm cực đoan sinh trưởng tối ưu ở pH 10 và lớn hơn Mặc dù, mỗi nhóm vi sinh vật có khoảng pH khá rộng nhưng mức chịu đựng của chúng có giới hạn nhất định Khi pH của tế bào có sự biến đổi đột ngột sẽ phá vỡ màng sinh chất, ức chế hoạt tính của enzyme hay

protein chuyển màng.(Phạm Thị Thúy Nga, 2009)[10]

Hoạt động của vi khuẩn Lactobacillus, đặc biệt là hệ enzyme của chúng, chịu tác động mạnh của sử thay đổi pH môi trường Vi khuẩn lactobacillus sinh tưởng

tối ưu ở khoảng pH 5.6 – 6.5, sự sinh trưởng và phát triển sẽ bị kiềm hãm nếu pH môi trường thấp hơn 4 hoặc cao khoảng tối ưu

2.1.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng đến quá trình sống của mỗi tế bào Mỗi loài vi sinh vật sống trong khoảng nhiệt độ khác nhau gọi là vùng sinh trưởng, trong đó có một khoảng nhiệt độ tối thích Ví dụ như một số chủng có thể sinh trưởng được ở 55oC, trong khi có một số khác có thể sinh trưởng ở 5oC Tuy nhiên, đa số vi khuẩn

lactobacillus sinh trưởng ở 15-40oC.(Trần Hạnh Triết, 2005)[14]

2.1.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl

Nồng độ NaCl ảnh hưởng đến màng sinh chất của vi khuẩn, với nồng độ NaCl lớn hơn hoặc bằng 5% sự sinh trưởng của phần lớn các vi khuẩn bị ức chế Nồng độ muối cao làm chênh lệch giữa áp suất thẩm thấu nội bào và ngoại bào của vi khuẩn,

vi khuẩn gram âm dễ mẫn cảm với NaCl hơn vi khuẩn gram dương, nguyên nhân là

do các enzyme của vi khuẩn bị ức chế bởi ion Cl.(Phạm Thị Thúy Nga, 2009)[10]

2.1.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ glucose

Đường là nguồn cacbon chủ yếu cho vi khuẩn sinh tổng hợp, nồng độ đường càng cao thì axit sinh ra càng nhiều Tuy nhiên, nồng độ đường quá cao làm cho áp suất thẩm thấu môi trường cao dẫn đến hiện tượng co nguyên sinh ảnh hưởng đến

sự sinh trưởng của tế bào vi khuẩn

2.1.4 Chức năng của probiotic

Probiotics là các vi khuẩn sống được coi là có lợi cho sức khỏe vì chúng giúp thiết lập cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, hỗ trợ tiêu hóa Probiotics còn tham gia hình thành các vitamin B, K, đồng thời tăng cường tạo các kháng thể giúp nâng cao khả năng miễn dịch

Các nhà nghiên cứu tại Viện Bách khoa Virginia và Đại học bang Ohio cũng đã xem xét và kết luận probiotics có tác dụng tăng cường miễn dịch, chống tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ em, đồng thời giúp ích cho quá trình tiêu hóa (Glenn R et al, 2007)[22]

* Tác động kháng khuẩn

Giảm số lượng vi khuẩn để ngăn chặn các mầm bệnh cụ thể là:

Tiết ra các chất kháng khuẩn: Vi khuẩn Probiotic tạo ra các chất đa dạng có thể

ức chế cả khuẩn Gram (+) và Gram (-), gồm có các acid hữu cơ, hydrogen peroxide

và chất diệt khuẩn Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những sinh vật mang mầm bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH khoang ruột thông qua sự tạo ra các acid béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, và butyrate, nhất là acid lactic.(Lương Đức Phẩm, 2008)[4]

Cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính vào đường ruột và cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh

* Tác động trên mô biểu bì ruột

- Đẩy mạnh sự liên kết chặt giữa những tế bào biểu mô

- Giảm việc kích thích bài tiết và những hậu quả do bị viêm của sự lây nhiễm

vi khuẩn

- Đẩy mạnh sự tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy

* Tác động miễn dịch (Lương Đức Phẩm, 2011)[3]

Probiotic được xem như là phương tiện phân phát các phân tử kháng viêm cho đường ruột Cụ thể:

- Đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm

- Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng

- Cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy và táo bón

* Tác động đến vi khuẩn đường ruột

Điều chỉnh thành phần cấu tạo của vi khuẩn đường ruột Sự sống sót của probiotic được tiêu hóa ở những phần khác nhau của bộ phận tiêu hóa thì khác nhau giữa các giống Khi tập trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ sinh thái đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ thực phẩm có probiotic, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của giống vi khuẩn Kết quả chỉ ra rằng với sự tiêu thụ thường xuyên, vi khuẩn định cư một cách tạm thời trong ruột, một khi chấm dứt sự tiêu thụ thì số lượng vi sinh vật probiotic sẽ giảm xuống Điều này thì đúng cho tất cả các loại probiotic

Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường ruột Probiotic có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme của sinh vật đường ruột Đồng thời tăng sự dung nạp đường lactose: giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu những loại thức ăn có chứa nhiều lactose và làm tăng vi khuẩn có lợi và giảm vi khuẩn gây hại (Tamime A,2005)[34]

* Một số vai trò khác đối với cơ thể

- Chống ung thư: nhiều nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn probiotic có thể làm giảm nguy cơ ung thư ruột kết và ung thư bàng quang Ngoài ra còn có tác dụng khử chất độc gây ung thư có trong cơ thể và làm chậm sự phát triển của các khối u bướu

- Chống dị ứng: thực phẩm probiotic góp phần chống lại một số dị ứng của cơ thể, cung cấp nhiều chất quan trọng cho cơ thể như (folic acid, niacin, riboflavin, vitamin B6 và B12).(Glenn R et al, 2007)[22]

- Probiotic có tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh, làm giảm huyết áp cao Ngoài ra còn giúp nhanh chóng bình phục sau khi mắc bệnh tiêu chảy và sử dụng nhiều kháng sinh

- Lên men (levure)

Ngoài ra, cố định tế bào còn được định nghĩa đơn giản hơn, đó là việc gắn các

tế bào vào chất mang không hòa tan trong nước Tế bào sau khi được cố định có thể

sử dụng được nhiều lần, không lẫn vào sản phẩm và có thể chủ động ngừng phản ứng theo ý muốn.(Nguyễn Thuý Hương, 2008)[7]

hệ sợi

Nhốt trong cấu trúc gel

Liên kết chéo

Màng Membrance

Cố định tế bào vi sinh vật

2.2.1.2 Yêu cầu của chất mang

Theo Trevan một chất mang lí tưởng cần có những tính chất sau: (Th.S Huỳnh

- Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn công của vi sinh vật

- Chất mang phải có độ trương nở tốt, diện tích bề mặt tiếp xúc lớn Tính chất này của chất mang vừa tăng khả năng cố định vi khuẩn, vừa tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất với vi khuẩn, nhờ đó làm tăng hoạt tính của vi khuẩn cố định và số lần tái sử dụng

- Chất mang có thể có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có thể ở dạng hạt, dạng màng, dạng phiến mỏng,…

* Chỉ tiêu đánh giá hiệu quả cố định tế bào:

- Khả năng sống của tế bào trong chất mang: lượng tế bào còn sống sót và hoạt động sau một thời gian nhất định; khả năng chuyển hóa cơ chất và thành phần dinh dưỡng đi vào; sản phẩm trao đổi chất đi ra

- Độ bền cơ học của chất mang: sức chịu đựng của chất mang ở pH, nhiệt độ, lực tác động của môi trường và của lực khuấy, lực thổi của không khí đưa vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật

- Khả năng bảo vệ vi sinh vật trong chất mang, tính đến yếu tố bất lợi với điều kiện ngoại cảnh Khả năng tái sử dụng nhiều lần, quá trình sản xuất liên tục vi sinh vật không bị rửa trôi.(Nguyễn Đức Lượng và cs, 2006)[6]

2.2.1.3 Chất mang cố định tế bào vi sinh vật

* Chất mang vô cơ: Thông dụng là vật liệu thủy tinh xốp, vật liệu oxit kim loại (nhôm oxit, mangan oxit, magie oxit, titan oxit), diatomite (celit) và gốm Đặc điểm: cấu trúc lỗ xốp, kích thước các lỗ này có thể điều chỉnh được Có khả năng hấp thụ tốt các enzyme và tế bào

* Chất mang hữu cơ:

- Polymer tổng hợp: gồm một số polymer như polystyren, polyvinylalcol, polyacrylamid, polyvinylacetate, polyacrylic dùng cố định enzyme và tế bào bằng phương pháp nhốt trong lòng chất mang

- Polymer sinh học: chất mang protein: gellatin, keratin, albumin Cố định tế bào bằng phương pháp nhốt trong cấu trúc gel

- Chất mang polysaccharid: cellulose, agarose, sephadex, và dẫn xuất Ngoài ra, còn có nhiều vật liệu khác như tinh bột, chitin, chitosan, alginate, carrageenan

2.2.2 Chất mang Alginate

2.2.2.1 Định nghĩa về alginate

Alginate là thuật ngữ dùng cho các muối acid alginic Alginate đôi khi được gọi bằng thuật ngữ “algin”

Alginate là một polymer sinh học có nguồn gốc từ tảo biển, có nhiều trong vách

tế bào tảo nâu (Paccophyceae) dưới dạng muối canxi, magie, natri của acid alginic

Và là loại polymer sinh học nhiều thứ 2 trên thế giới sau cellulose.[43]

2.2.2.2 Cấu tạo của alginate

Công thức của acid alginic là (C6H8O6)n từ đó công thức của natri alginate là (C6H7NaO6)n, canxi alginate là (C6H7Ca1/2O6)n

Alginate là một polymer được cấu tạo từ 2 monomer là acid -D-Mannuronic (M) và acid -L-Gluconic (G) với các cầu nối là liên kết 1-4 glucoside, chỉ khác ở nhóm cacboxyl nằm ở trên và dưới mặt phẳng của vòng pyranoza Chúng tham gia vào cấu thành và màng tế bào, chúng thường tồn tại ở dạng: G-G-G-G…, M-M-M-M-…, M-G-M-G-… Sự phân bố của thành phần M,G biến đổi nhiều theo loài, do

đó có nhiều loại Alginate và có tính chất khác nhau (Th.S Bùi Văn Tú, 2004)[12]

2.2.2.3 Phân loại

- Alginate Natri: (C6H7NaO6)n

- Alginate Kali: (tương tự như Alginate Natri)

Ngoài ra, độ nhớt alginate phụ thuộc vào quá trình bảo quản Khi đang ở dạng bột thành phẩm, alginate vẫn tiếp tục bị cắt mạch, sau một thời gian, độ nhớt của nó giảm đáng kể Để khắc phục điều này, ta có thể cho vào alginate thành phẩm một lượng nhỏ canxi sao cho chưa đến ngưỡng tạo gel Khi sử dụng kết hợp alginate với các dạng gum khác như pactin sẽ làm tăng đáng kể độ nhớt của dung dịch

Alginate tạo dạng màng mỏng (films) của natri hoặc canxi alginate với dạng sợi (fibres) của canxi alginate Tính chất này của alginate được ứng dụng trong việc tạo nên các lớp phủ bên ngoài.(Th.S Huỳnh Ngọc Oanh, 2005)[13]

như CaCl2 Các hạt gel alginate canxi sẽ hình thành có dạng hình cầu Trong mỗi hạt gel, tạo thành một mạng lưới bao quanh các tế bào, cấu trúc hạt gel như vậy sẽ tạo thành các lỗ xốp, thuận tiện cho việc khuếch tán cơ chất vào và khuếch tán sản phẩm ra khỏi hạt gel (ThS Bùi văn Tú, 2004)[12]

Một nghiên cứu của Nguyễn Thuý Hương, Cố định vi khuẩn Oenococcus oeni,

sử dụng dịch nho-dâu tằm sau giai đoạn lên men chính có hàm lượng acid malic là 3,7 g/l, acid lactic là 0,5g/l, cố định trên 3 chất mang Kết quả như sau: (Trần Thị Minh Tâm, 2009)[8]

Bảng 2.3 : Tỷ lệ rửa trôi sau tái sử dụng lên men chế phẩm tế bào cố định (%)

(x): không tiếp tục tái sử dụng

Một nghiên cứu khác của ThS Huỳnh Ngọc Oanh, khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme Termamyl cố định lên gel CMC/Alginate ở nồng

độ alginate 0,75%, CaCl2 6%, CMC 2%, pH=6, nhiệt độ 70o

C Tiến hành tái sử dụng enzyme cố định ở nhiệt độ 90oC hạt gel sau hai lần sử dụng bị co lại và vỡ ra; tái sử dụng ở nhiệt độ 80oC có thể sử dụng được 3 lần sau đó hạt gel co lại và vỡ ra Tiến hành tái sử dung enzyme cố định ở 70oC, kết quả cho thấy hoạt tính của enzyme cố định lên gel CMC-Alginate khá ổn định Hoạt tính của enzyme Termamyl sau 10 lần tái sử dụng giảm đi một nửa (half-time), đến lần thứ 13 gel bắt đầu không còn giữ nguyên cấu trúc ban đầu (dễ bị vỡ ra)

2.2.3 Bacterial cellulose (BC)

2.2.3.1 Định nghĩa cellulose

Cellulose là đại phân tử tồn tại phổ biến nhất trên trái đất, là thành phần chính của sinh khối thực vật cũng như đại diện cho các polymer ngoại bào của vi sinh vật Cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose – BC) là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và chủ yếu tạo màng bảo vệ, BC được tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn, trong đó vi

khuẩn Acetobacter xylinumsinh tổng hợp BC hiệu quả nhất và được nghiên cứu

nhiều nhất

Cellulose vi khuẩn có nhiều đặc tính tốt của một chất mang cố định tế bào vi sinh vật như: độ tinh khiết cao, có khả năng hút, giữ ẩm tốt nhờ cấu trúc mạng lưới cellulose, có khả năng đàn hồi tốt, các tính chất cơ lý bền, dễ dàng phù hợp với hình dạng thiết bị phản ứng sinh học So sánh với yêu cầu của một chất mang trong kĩ thuật cố định tế bào vi sinh vật, cho thấy BC phù hợp với các tiêu chuẩn cơ bản của chất mang và BC có tác động bảo vệ tế bào

Kỹ thuật cố định tế bào đang được đề cập và quan tâm nhiều, đặc biệt trong các lĩnh vực lên men sản xuất các sản phẩm trao đổi chất Tế bào cố định có nhiều ưu điểm so với việc sử dụng tế bào tự do như: tế bào sau khi được cố định có thể sử dụng được nhiều lần, không lẫn vào sản phẩm và có thể chủ động ngừng phản ứng theo ý muốn Bacteriocin được sản sinh bởi vi khuẩn lactic là tác nhân sinh học an toàn trong bảo quản thực phẩm thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học Bacteriocin là những phân tử peptid do vi khuẩn sinh tổng hợp có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn gây hại trong thực phẩm

2.2.3.2 Cấu trúc của cellulose

Cellulose là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc glucopyranose nối với nhau bởi liên kết -1,4-glucan Các nghiên cứu cho thấy BC

có cấu trúc hóa học y hệt PC (cellulose thực vật); tuy nhiên, cấu trúc đa phân và thuộc tính của BC khác với PC, chiều rộng của các sợi cellulose được tạo ra từ gỗ thông là 30000 - 75000nm, trong khi những dải vi sợi cellulose có chiều dài từ 1 -

9m hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc được ổn định bởi các nôi hydrogen, BC khác với PC về chỉ số kết chặt và mức độ polymer hóa.(Bielecki et al, 2001)[16] Hai dạng kết tinh phổ biến của cellulose trong tự nhiên là I và II, được phân biệt bởi các kỹ thuật phân tích bằng tia X, quang phổ và tia hồng ngoại Tùy thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy và giống vi khuẩn mà cellulose dạng nào chiếm

ưu thế Cellulose I và II đều được tổng hợp trong tự nhiên, trong đó cellulose I phổ biến hơn, cellulose I có thể được chuyển thành cellulose II, nhưng cellulose II thì không thể chuyển thành cellulose I, rất ít tế bào eukaryote tổng hợp cellulose II,

Acetobacter xylinum thì tổng hợp được cả 2 loại: (El - Saied et al, 2004)[18]

Cellulose I: được tổng hợp bởi đa số thực vật và Acetobacter xylinum ở môi

trường tĩnh Các chuỗi -1,4-glucan được sắp xếp song song với nhau theo một trục Năm 1984, Atallar và Vander Hart đã xác định được cấu trúc cellulose I và cellulose I

Cellulose II thường được tổng hợp trong môi trường nuôi cấy lắc Các chuỗi 1,4-glucan được sắp xếp một cách ngẫu nhiên, hầu như không song song và nối với nhau bởi một số lượng lớn nối hydrogen, làm cho cellulose II có độ bền về nhiệt

-2.2.3.3.Tính chất của BC.[16],[18]

- Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn, thành phần tỉ lệ I cao

- Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao, đăc biệt là cellulose

- Khả năng giữ nước và hấp phụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc

- Có độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin và hemocellulose

- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài nguyên có thể phục hồi

- Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt

- Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có độ bền cao, ứng suất dài lớn, trọng lượng nhẹ, tính bền rất cao

- Độ tinh khiết cao: BC là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp không có chứa lignin và hemicellulose Do đó, BC có thể bị vi khuẩn phân hủy hoàn toàn và

là nguồn nguyên liệu tái sinh

- Độ bền dai cơ học lớn: BC có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao, trọng lượng nhẹ, độ bền đáng kể

- Màng cellulose được hình thành trực tiếp trong quá trình sinh tổng hợp, vì vậy việc sản xuất giấy, sợi không cần qua các bước trung gian

- Tổng hợp trực tiếp các dẫn xuất của cellulose nhờ vào sự tác động lên gen liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose từ đó giúp kiểm soát hình dạng và trọng lượng phân tử của cellulose

2.2.3.4 Phương pháp

Gồm 2 giai đoạn: Bẫy – hấp phụ: hấp phụ nấm men lên chất mang BC – bẫy tăng sinh nấm men trên và trong giá thể BC

Theo Nguyễn Thúy Hương (2006), các điều kiện tối ưu cố định

Corynebacterium sp trên chất mang BC: hấp phụ bằng máy lắc, thời gian ủ 3 ngày,

ở nhiệt độ 30oC, lượng tế bào vi khuẩn cố định trên chất mang đạt được như sau:

- Mật độ trung bình là: 8,8 x109 /g

- Mật độ vi khuẩn mặt ngoài chất mang là: 4,9x104 tế bào/cm2

- Mật độ vi khuẩn bên trong chất mang là: 4,3x104 tế bào/cm2

* So sánh chất mang alginate và chất mang BC trong cố định tế bào nấm men:

Bảng 2.4: So sánh chất mang alginate và chất mang BC trong cố định tế bào

Bẫy – hấp phụ: gồm 2 giai đoạn: hấp phụ nấm men lên chất mang BC – bẫy tăng sinh nấm men trên và trong giá thể

BC Hiệu suất cố định cao Tính chất cơ lý Mềm, dễ vỡ dưới tác

dụng khuấy đảo Độ chịu lực cao Khả năng phù hợp

hình dạng phản ứng

sinh học

Dạng hạt

Dạng màng, dạng hạt, dạng sợi với kích thước mong muốn

Tác động kìm hãm

hoạt động sống của vi

sinh vật cố định

Chưa phát hiện tác động kìm hãm tế bào Tác động bảo vệ tế bào

Sau khi hết tái sử dụng tế bào

cố định vẫn có khả năng tái sử dụng chất mang

Khả năng thu nhận

chất mang trong điều

kiện Việt Nam

Giá thành ước lượng 1.200.000 đồng/kg 200.000 đồng/kg

(Nguồn: Nguyễn Thúy Hương, 2010)[9]

2.3 Chế phẩm sinh học probiotics

2.3.1 Công nghệ sản xuất chế phẩm probiotic

Ngày nay, probiotics được ứng dụng và nghiên cứu rộng khắp thế giới Chế phẩm probiotic hiện đang rất đa dạng và dần dần thay thế phương pháp trị liệu các đường tiêu hóa bằng kháng sinh, nâng cao hệ thống miễn dịch của người và động vật nuôi, giúp vật nuôi tăng trưởng và tăng chất lượng sản phẩm Hiện nay, trên thị trường Việt Nam cũng xuất hiện nhiều sản phẩm dạng probiotics như sản phẩm Probio

thuốc dạng đông khô, chứa tế bào L acidophilus trị một số bệnh đường ruột [32]

Quy trình sản xuất chế phẩm probiotics rất phức tạp và trải qua nhiều giai đoạn,

sơ đồ tổng quát như sau:

Hình 2.3: Sơ đồ công nghệ sản xuất chế phẩm probiotics

Hấp khử trùng

2.3.2 Ứng dụng của chế phẩm sinh học trong đời sống

2.3.2.1 Trong nông nghiệp

* Trong nuôi trồng thủy hải sản

Ở Việt Nam, năm 2002 chính phủ đã quyết định thủy sản là ngành kinh tế ưu tiên, xuất khẩu trên 2 tỉ USD thủy sản, trong đó tôm chiếm 50% đứng hàng thứ 5 trên thế giới Tuy nhiên, ngành thủy sản đang mắc phải khó khăn chủ yếu là dịch bệnh do vi khuẩn, virus, nấm và kí sinh trùng gây ra Khi phát hiện bệnh, nông dân thường sử dụng kháng sinh đổ xuống ao hồ hoặc bổ sung trực tiếp vào thức ăn, kháng sinh có thể điều trị tức thời đối với các vi khuẩn gây bệnh; tuy nhiên khi sử dụng nhiều lần vi khuẩn sẽ trở nên kháng thuốc, mặt khác khi sử dụng thường xuyên sẽ để lại dư lượng kháng sinh trong tôm, cá gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người.(Bùi Quang Tề, 2006)[1]

- Virus là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm, là mối đe dọa hàng đầu đối với ngành nuôi trồng thủy sản

- Vi khuẩn cũng là tác nhân gây bệnh nguy hiểm, đặc biệt là Virio làm tôm chết rất nhanh Bên cạnh đó, nấm và kí sinh trùng cũng là tác nhân gây bệnh trên tôm Cùng với đó ao nuôi tôm cá còn tích lũy một số lượng lớn chất hữu cơ, gây ra tình trạng thiếu ôxy và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hình thành các loại khí độc ảnh hưởng đến sức khỏe của tôm, cá Sự gia tăng các chất độc cũng thay đổi thành phần vi sinh vật trong môi trường đất, nước và đáy ao, đặc biệt là gia tăng mật độ vi sinh vật gây bệnh; thức ăn dư thừa dẫn đến hiện tượng phú dưỡng hóa làm tảo phát triển, các chất hữu cơ trong ao tích lũy ngày một cao sẽ làm giảm lượng oxy hòa tan Hiện nay, biện pháp tốt nhất là sử dụng probiotics trong phòng và chữa bệnh trong nuôi trồng thủy sản, probiotics tác động theo cơ chế: cạnh tranh vị trí gắn kết với vi khuẩn, sản xuất ra các chất ức chế, cạnh tranh nguồn năng lượng, tăng cường khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng, nâng cao đáp ứng miễm dịch, nâng cao chất lượng nước ao (Bùi Quang Tề, 2006)[1]

* Trong chăn nuôi

Việc tăng mật độ nuôi thách thức bệnh tật gia tăng do bị nhiễm các mầm bệnh

khác nhau, đặc biệt là vi khuẩn đường ruột như: E.coli, Salmonela ssp, và

Campylobacter ssp Bệnh đường ruột có ảnh hưởng rất lớn đến ngành chăn nuôi,

chúng làm giảm năng suất, tăng tỷ lệ chết và là nguồn nhiễm tiềm năng cho các sản phẩm thịt, giảm an toàn thực phẩm cho con người; Với ý thức ngày càng tăng về sự kháng thuốc của vi khuẩn, nên việc sử dụng kháng sinh chữa bệnh, phòng bệnh cho gia súc, gia cầm đã giảm dần Ở trạng thái bình thường thì trong đường ruột có sự cân bằng giữa vi khuẩn có lợi và gây bệnh; nó bị ảnh hưởng bởi các tương tác, quan

hệ cộng sinh và cạnh tranh; cộng đồng vi khuẩn đó không chỉ bảo vệ bộ máy tiêu hóa mà còn tăng khả năng sản xuất trong động vật chủ Do đó, một biện pháp thay thế tốt nhất và kinh tế nhất là sử dụng các chế phẩm probiotics bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi.[30]

Probiotics sử dụng trị các bệnh rối loạn hệ vi sinh đường ruột và tăng khả năng thẩm thấu của ruột; trong hệ tiêu hóa vi khuẩn di chuyển qua dạ dày đến ruột non và bám chặt vào biểu mô, chúng giúp tăng tốc độ phát triển và khả năng chuyển hóa thức ăn ở heo, gà và thú con Những sản phẩm probiotics được biết đến nhiều như sữa lên men và bơ sữa, các sản phẩm probiotics sử dụng trong chăn nuôi là giúp nâng cao hệ thống miến dịch chống lại các tác nhân gây bệnh.(YUAN KUN LEE et

al, 2009)[39]

2.3.2.2 Trong thực phẩm và dược phẩm

Thực phẩm probiotics là thực phẩm có chứa vi khuẩn sống có lợi và không ảnh hưởng đến sức khẻo con người Một số thực phẩm truyền thống như: phomat, sữa chua, dưa cải, giấm, dưa cải bắp ở Đức, kim chi ở Hàn Quốc, choucroute ở Pháp.…Thực phẩm probiotics hiện nay được bán rất phổ biến và thân thiện, ở Mỹ

phần lớn là yogurt, yogurt được làm từ sữa kết hợp với các loài Streptococcus thermophiles và L acidophilus hoặc L bulgaricus, sữa có nguồn gốc từ bò, dê,

cừu,… Kefir cũng là một sản phẩm lên men có thể được làm từ nhiều nguồn khác nhau: sữa bò, cừu, dê; ngoài ra có thể làm từ sữa đậu nành, sữa gạo và nước dừa Năm 2007, New Food lần đầu tiên giới thiệu thức uống probiotics được khám phá

bởi Steve Demos, đây là loại đồ uống chứa L plantarum 299v (WHO, 2001)[41]

Probiotics được sử dụng như một loại thuốc chữa bệnh, trên thị trường hiện nay ngoài các sản phẩm dưới dạng thực phẩm, còn có dạng viên nén, dạng dịch, dạng bột dùng điều trị một số bệnh đường tiêu hóa:

- Tiêu chảy cấp: Tác nhân chính của bệnh là do V cholerae hoặc vi khuẩn E

coli, cũng như rotavirus Những trẻ em bị suy dinh dưỡng hoặc có miễn dịch bị suy

yếu có nhiều nguy cơ bị tử vong do tiêu chảy hơn những trẻ khỏe mạnh, chủ yếu là

trẻ em ở các nước đang phát triển Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng L rhamnosus GG, bifidobacterium bifidum và streptococcus thermophiles làm giảm lượng rotavirus trong hệ tiêu hóa (Tamime A, 2005)[34] Một nghiên cứu cho thấy rằng khi sử dụng L rhamnosusGG có thể rút ngắn một nửa thời gian chữa trị, kết quả nghiên cứu sử dụng L rhamnosus GG đã bị bất hoạt bởi nhiệt cũng mang lại kết quả tương tự như L rhamnosus GG sống.(Phạm Văn Ty và cs, 2007)[11]

- Tiêu chảy do kháng sinh:

Nhiều probiotic có giá trị trong việc giảm thiểu nguy cơ tiêu chảy liên quan đến kháng sinh ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ Đánh giá hiệu quả phòng ngừa tiêu chảy liên quan đến kháng sinh từ 6 nghiên cứu với số lượng trẻ tham gia 766 trẻ cho thấy

nguy cơ tiêu chảy giảm từ 28,5% đến 11,9% B.lactis và S.Thermophilus cho vào sữa công thức và L.Rhamnosus (GG) dưới dạng bổ sung có tác dụng tốt nhất Chưa

có nhiều nghiên cứu đánh giá tác động của probiotic lên tiêu chảy do C.Difficile ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ.(Kandler et al, 1980)[25]

- Ngừa ưng thư: một số vi khuẩn đường ruột có khả năng tiết ra các enzyme

như: glycosidase, azoreductase, nitroreductase và - glucoronidase chúng sẽ hoạt

hóa các chất tiền ưng thư thành các chất ưng thư hoạt hóa; những nghiên cứu trên

người sử dụng L casei hoặc L acidophilus làm giảm đáng kể hoạt động của các

enzyme đó.(Senok A et al, 2011)[32]

- Viêm đường tiêu hóa: có nhiều tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus, kí

sinh trùng, chúng xâm nhập vào các tế bào ở đỉnh nhung mao ruột, phá hủy nhung

mao, làm mất khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng, nhiễm rotavirus và helicobacter pylori gây viêm loét và ưng thư dạ dày Do khả năng hấp thụ dinh

dưỡng kém, các chất cacbohydroxit tồn động trong ruột dẫn đến tiêu chảy và mất nước nghiêm trọng gây nguy hiểm cho trẻ sơ sinh và trẻ suy dinh dưỡng (Phạm Văn

Ty và cs, 2007).[11]

- Tăng cường khả năng tiêu hóa lactose và hoạt động của các enzyme khác: hiện tượng không có khả năng tiêu hóa lactose tìm thấy khắp trên thế giới do

cơ thể không có enzyme lactase thủy phân lactose, enzyme này được giải phóng khi

vi khuẩn bị dung giải do tác động của acid mật; bệnh thường gây triệu chứng phình bụng, đầy hơi, tiêu chảy(Senok A et al, 2011)[32] Ở trẻ sơ sinh cho uống Saccharomycine cerevisiae để khắc phục chứng kém tiêu hóa đường saccarose, vì trong nấm men có chứa enzyme saccarase

- Giảm cholesterol: cholesterol là một chất béo steroid, có ở màng tế bào của

tất cả các mô trong cơ thể và được vận chuyển trong huyết tương của mọi động vật Cholesterol trong máu cao sẽ gây một số bệnh tim mạch như: xơ vữa động mạch,

huyết áp tăng, bệnh ký ở hệ thống mạch vành [35]

2.4 Tình hình nghiên cứu

Những nghiên cứu về Probiotics mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 19, những nghiên cứu đầu tiên về sự tương tác của vi sinh vật với cơ thể vật chủ đã bị phủ định Đến đầu năm 1885, Escherich đã miêu tả về sự hình thành hệ vi sinh vật trong ruột của trẻ em và nêu ra những lợi ích của chúng trong tiêu hóa Doderlin khẳng định rằng

sự có lợi của vi khuẩn trong âm đạo bằng cách sản xuất ra acid lactic, nó có thể ngăn chặn hoặc ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh

Năm 1900, Henry Tissier là một bác sĩ khoa nhi người Pháp đã quan sát và kiểm tra phân của những trẻ em bị tiêu chảy thấy chỉ chứa một lượng ít các vi khuẩn

“Bifi” Trong khi đó, vi khuẩn này lại tồn tại một lượng lớn trong phân của các trẻ

có sức khỏe tốt Ông cho rằng vi khuẩn này có thể giúp bệnh nhân hồi phục lại.(WHO, 2001)[41]

Sau đó, đến năm 1907, Elie Metchchnikoff - người Nga , đạt giả Nobel đã

chứng minh rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh

đường ruột Ông giải thích được điêu bí ẩn về sức khỏe của những người Cô – đắc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và có thể sống tới 115 tuổi hoặc hơn Nguyên nhân

có thể do họ tiêu hóa rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này đã được ông mô tả trong sách “kéo dài cuộc sống”.[28]

Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic Năm 1917, trước khi Alexander Fleming khám phá ra ampicillin, giáo sư

Alfred Nissle người Đức đã phân lập ra một chủng thuộc loài E.coli không gây bệnh

từ phân của các chiến binh trong chiến tranh Thế giới thứ nhất và ông đặt tên chủng này là Nissle 1917 Các chiến binh này bị bệnh viêm ruột kết và chủng vi khuẩn Nissle 1917 được sử dụng như là probiotics để trị bệnh cho các chiến sĩ.(WGO, 2008)[40]

Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota đã phân lập được các vi khuẩn lactic từ phân của các trẻ em khỏe mạnh Cùng năm đó, các nhà nghiên cứu

Hoa Kỳ đã chững minh là L acidophilus có khả năng làm giảm táo bón thường

xuyên Nhiều nhà khoa học của Đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không

tự sinh ra được Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là Yakult từ sữa được cho là có khả năng hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intertinal health) được sản xuất Khái niệm chung Probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa Probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên 80.[38]

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nhóm nghiên cứu sự biểu hiện của enzyme lactase ở 2 chủng Lactobacillus reuteri L103 và L461 Nghiên cứu cho thấy 2 enzyme biểu hiện 2 tiểu phần (2 chuỗi

peptide có trọng lượng là 35kDa và 85kDa) Các enzyme này có khoảng pH hoạt động khá hẹp, một enzyme từ pH 3.8 – 4.0 (chủng L461) và một pH 4.6 – 4.8 (chủng L103) Kết quả nghiên cứu này sau đó được trình bày tại Hội nghị lần thứ V, Trường Đại học Khoa học Hà Nội, (2006) và đã đăng trong tạp chí quốc tế [13]

2.4.2 Tình hình nghiên cứu thế giới

Một dạng sinh học cụ thể của Lactobacillus fermentum (dạng sinh học IIb) lần

đầu tiên được phân lập bởi Lerche và Reuter vào năm 1962 Năm 1980, Kandler et

al mô tả dạng sinh học này như L reuteri, một phân loài mới của lactobacilli heterofermentative, dựa trên DNADNA tương đồng (L reuteri khác với L fermentum trong nội dung GC, 39-41mol% DNA của nó, và có lysine là

diaminoacid peptidoglycan) (Kandler et al, 1980).[25]

Năm 2010, CLAUDIO ROMANO cho rằng bổ sung L.reuteri có thể giảm mức

độ đau bụng cơ năng ở mức độ cảm nhận được Ông tiến hành nghiên cứu ở trẻ em (độ tuổi từ 6-16) bị đau bụng cơ năng (FAP), 60 bệnh nhân được huy động tham gia thử nghiệm mù đôi, ngẫu nhiên có giả dược – chứng này Trẻ em sẽ được phân bổ

một cách ngẫu nhiên để được nhận L reuteri (2x108 CFU/ngày) hoặc giả dược,

đồng nhất trong vòng 4 tuần và sau đó là một thời kỳ dài 4 tuần không có bổ sung

Kết quả là nhóm trẻ em bổ sung L reuteri có mức độ đau thấp hơn rõ rệt so với giả

dược.(Claudio romano et al, 2010)[17]

Gần đây, hai báo cáo cho thấy rằng uống Lactobacillus reuteri GMNL-263

(Lr263) có thể ngăn chặn xơ thận do tiểu đường, cải thiện sức đề kháng insulin, và cải thiện tình trạng gan nhiễm mỡ ở chuột ăn fructose cao (Hsieh et al, 2012),(Lu et

al, 2010)[28] L reuteri được sử dụng như là một probiotic cho táo bón mãn tính

(Ojetti et al, 2014)[29]

Một nghiên cứu in vitro đánh giá đồng hóa cholesterol trong môi trường nuôi cấy và dưới điều kiện đường ruột mô phỏng, kết quả cho thấy rằng hầu hết các

chủng Lactobacillus đồng hóa mạnh cholesterol và Lactobacillus reuteri NCIMB

701.089 đồng hóa hơn 67% của cholesterol.(Brunt J et al, 2005)[15]

L reuteri 263 là một chủng rất có ích cho việc cải thiện các triệu chứng của

bệnh tiểu đường (US 20110300117 A1) và xơ hóa thận trong bệnh tiểu đường (US

20120183504 A1), từ các dòng khác nhau như L reuteri L3 để ngăn ngừa bệnh béo phì ở chuột béo phì (Qiao et al, 2015)[31] hoặc các sản phẩm L.reuteri LR6 - sản

phẩm lên men cho việc kiểm soát tăng lipid máu ở chuột (Singh et al, 2015)[33] Ngoài ra, các loài của các chủng vi khuẩn tương tự hoặc thậm chí chủng của cùng

một loài có đặc tính chức năng sinh học khác nhau (Qiao et al, 2015)[31] Qiao et al chứng minh rằng L reuteri L3 và L reuteri L10 có khả năng chống viêm và chống

béo phì thuộc tính cho những con chuột béo phì [31]

- Việc sử dụng chế phẩm sinh học để phòng ngừa ung thư trực tràng đang được

sử dụng ngày càng rộng rãi, các chủng L reuteri với hoạt động tăng sinh chống lại

các tế bào ung thư đại trực tràng Các nhà khoa học đã nghiên cứu tác dụng của việc tăng sinh và hiệu quả của các chuỗi axit béo chuỗi ngắn được tiết ra bởi các chủng

L reuteri Năm chủng L reuteri đã được sàng lọc và tiết ra axit béo chuỗi ngắn,

tăng sinh trên Caco-2 colon chống lại tế bào ung thư ruột kết (Kahouli et al,

2015)[26] L reuteri cũng đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc làm giảm

cả viêm nứu và mảng bám răng ở bệnh nhân viêm lợi nặng, cho thấy cải thiện sức khỏe răng miệng (Gabriela Sinkiewicz, 2010).[21]

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

* Đối tượng nghiên cứu:

- Vi khuẩn Lactobacillus reuteri

- Cellulose vi khuẩn (Bacterial cellulose – BC)

- Chất mang Na – alginate (Kanta, Nhật Bản)

* Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu cố định vi khuẩn Lactobacillus reuteri sử

dụng làm chế phẩm sinh học

3.1.1 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường MRS dạng lỏng (không có agar)

- Môi trường MRS dạng thạch (có agar)

Bảng 3.1: Thành phần môi trường MRS