Nghiên cứu cố định vi khuẩn lactobacillus acidophilus ATCC 4356 để sản xuất calci lactate

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH VI KHUẨN Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 ĐỂ SẢN XUẤT CALCI LACTATE LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH VI KHUẨN Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 ĐỂ SẢN XUẤT CALCI LACTATE LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHIỆP DƯỢC – BÀO CHẾ MÃ SỐ: 607103 Người hướng dẫn khoa học: TS ĐÀM THANH XUÂN HÀ NỘI 2012 MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Trang ĐẶT VẤN ĐỀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn lactic 1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn lactic 1.1.2 Chi Lactobacillus 1.1.3 Loài Lactobacillus acidophilus 1.2 Sản xuất acid lactic 1.2.1 Acid lactic 1.2.2 Các phương pháp sản xuất acid lactic 1.2.2.1 Phương pháp tổng hợp hóa học 1.2.2.2 Phương pháp lên men vi sinh vật 10 1.2.3 Calci lactate 13 1.3 15 Phương pháp bất động tế bào 1.3.1 Nguyên tắc 15 1.3.2 Các phương pháp bất động tế bào 15 1.3.3 Ứng dụng phương pháp bất động tế bào 16 1.4 Alginate 19 1.4.1 Cấu trúc alginate 19 1.4.2 Tính chất alginate 20 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị máy móc 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 25 2.2.2 Phương pháp bất động tế bào vào chất 25 2.2.3 Phương pháp pha loãng liên tục – Tính số lượng vi khuẩn cố định rửa trơi q trình lên men 26 2.2.4 Phương pháp lên men thu sản phẩm calci lactate 27 2.2.5 Phương pháp tính hiệu suất q trình tạo calci lactate thông qua phương pháp định lượng glucose 29 2.2.6 Phương pháp lên men liên tục tạo acid lactic hạt cố định 30 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Nghiên cứu cố định tế bào L acidophilus gel alginate 32 3.1.1 Xác định thời điểm thu sinh khối tế bào vi khuẩn đem cố định 32 3.1.2 Xác định tỷ lệ phối trộn dung dịch alginate 3% với sinh khối tế bào vi khuẩn 35 3.1.3 Lựa chọn trạng thái phối trộn tế bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus với dung dịch alginate 3% 37 3.1.4 Xác định lượng hạt cố định để lên men sản xuất calci lactate theo phương pháp lên men mẻ 37 3.2 Ứng dụng cố định tế bào vi khuẩn L acidophilus chất alginate để sản xuất calci lactate theo phương pháp lên men mẻ 39 3.2.1 Khả tổng hợp calci lactate tế bào L acidophilus cố định gel calci alginate 40 3.2.2 Đánh giá khả lưu giữ tế bào vi khuẩn L acidophilus hệ gel calci alginate q trình ni lên men 42 3.2.3 Khả tái sử dụng tế bào L acidophilus cố định hệ gel calci alginate để sản xuất calci lactate 45 3.2.4 Đánh giá khả chịu acid tế bào cố định 49 3.3 Khảo sát trình lên men liên tục sinh tổng hợp calci lactate 51 3.3.1 Khảo sát sơ khả sinh tổng hợp calci lactate sử dụng môi trường lên men chứa lactose chứa sữa 52 3.3.2 Lên men liên tục sản xuất calci lactate 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phụ lục 1: Sơ đồ biểu diễn khối lượng calci lactate tạo thành sau 96h lên men với tế bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus dạng tự dạng cố định với alginate Phụ lục 2: Đồ thị biểu diễn khối lượng calci lactate trung bình tạo thành lần tái sử dụng Phụ lục 3: Đồ thị biểu diễn lượng glucose tế bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus cố định alginate sử dụng lần tái sử dụng Phụ lục 4: Đồ thị biểu diễn biến thiên pH dịch lên men lô khác LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian học tập trường, đồng thời em xin chân thành cảm ơn đến thầy cô giáo, cán kỹ thuật viên giảng dạy làm việc mơn Cơng nghiệp dược đóng góp ý kiến giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài luận văn thạc sỹ Đặc biệt, với kính trọng lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành TS Đàm Thanh Xuân, người thầy trực tiếp hướng dẫn, chia sẻ, động viên giúp đỡ em suốt trình hồn thành luận văn mơn Trong q trình nghiên cứu khoa học thân em nhận thấy nhiều vấn đề khó khăn mà chưa giải được, em mong ý kiến đóng góp khoa học, xác đáng thầy cô bạn bè để hoàn thiện đường nghiên cứu khoa học Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 07 tháng 11 năm 2012 Học viên Lê Thị Thu Hiền DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT – APA Acid – amino penicillanic B cereus Bacillus cereus B cougulans B megatherium E coli Bacillus cougulans Bacillus megatherium Escherichia coli L acidophilus Lactobacillus acidophilus L amylovorus Lactobacillus amylovorus L brevis L buchneri L bulgaricus L casei Lactobacillus brevis Lactobacillus buchneri Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus casei L delbrueckii Lactobacillus delbrueckii L fermentum Lactobacillus fermentum L helvesticus Lactobacillus helvesticus L leichmenii Lactobacillus leichmenii L plantarum Lactobacillus plantarum L salivarius Lactobacillus salivarius L rhamnosus Lactobacillus rhamnosus S cerevisiae Sacharomyces cerevisiae MRS cfu De Man – Rogosa - Sharpe Cology forming units DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Nguyên liêu hóa chất sử dụng 22 Bảng 2.2: Máy móc thiết bị sử dụng 22 Bảng 2.3: Môi trường MRS lỏng 23 Bảng 2.4: Môi trường lên men 23 Bảng 2.5: Các thông số sử dụng lên men liên tục tạo calci lactate hạt cố định 31 Bảng 3.1: Mật độ tế bào L acidophilus theo thời gian dịch nhân giống 33 Bảng 3.2: Mật độ tế bào vi khuẩn L acidophilus cố định gel calci alginate 3% cố định với lượng sinh khối khác 36 Bảng 3.3: Mật độ vi khuẩn L acidophilus đạt 1g hạt calci alginate sử dụng 50ml dịch nhân giống phối trộn với 50ml dung 38 dịch natri alginate 6% Bảng 3.4: Lượng hạt chứa tế bào vi khuẩn L acidophilus tương 39 đương với số lượng tế bào 10ml môi trường nhân giống sau 20h Bảng 3.5: Lượng calci lactate thu 100ml môi trường lên men sau 96h lên men với tế bào vi khuẩn L acidophilus trạng thái tự trạng thái cố định hệ gel calci alginate 41 Bảng 3.6: Lượng đường tiêu thụ tế bào vi khuẩn L acidophilus cố định gel alginate sau 96h lên men với tế bào dạng tự 41 Bảng 3.7: Mật độ tế bào vi khuẩn L acidophilus hạt calci 43 alginate dịch nuôi cấy sau khoảng thời gian lên men Bảng 3.8: Khả tái sử dụng hạt len men khối lượng calci lactate tạo thành sau lần tái sử dụng 45 Bảng 3.9: Mật độ vi khuẩn L acidophilus 1g hạt calci alginate 47 sau 96h lên men sau tái sử dụng hạt đến lần thứ Bảng 3.10: Lượng glucose tế bào vi khuẩn L acidophilus cố định gel alginate tiêu thụ sau lần tái sử dụng 48 Bảng 3.11: pH dịch lên men thời điểm lên men khác mẫu lên men lượng calci lactate tạo thành sau 96h lên men 50 Bảng 3.12: Lượng calci lactat hình thành sử dụng môi trường lên men chứa lactose môi trường lên men chứa sữa 53 Bảng 3.13: pH dịch lên men thời điểm khác phương pháp lên men liên tục sản xuất calci lactate 54 Bảng 3.14: Lượng calci lactate tạo thành (g/100ml dịch lên men) 55 thời điểm khác theo phương pháp lên men liên tục Bảng 3.15: Lượng glucose tế bào vi khuẩn L acidophilus tiêu thụ 55 thời điểm khác theo phương pháp lên men liên tục Bảng 3.16: Lượng vi khuẩn L acidophilus thoát khỏi hạt alginate thời điểm khác phương pháp lên men liên tục 56 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Lactobacilus acidophillus kính hiển vi điện tử Hình 1.2 Lactobacillus acidophillus kính hiển vi quang học Hình 1.3 : Các phương pháp bất động tế bào 17 Hình 1.4: Cấu trúc β–D–Mannuronic acid α–L–Guluronic acid 19 Hình 1.5: Cấu dạng β–D–Mannuronic acid α–L–Guluronic acid 20 Hình 1.6: Hình thể block GGGG, MMMM, MGMG 20 Hình 1.7: Liên kết ion Ca2+ với alginate 21 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình kết tinh calci lactate 28 Hình 3.1 Đồ thị thể đường cong sinh trưởng L acidophilus 34 men, để hạt lên men tĩnh khoảng 24h cho vi khuẩn sử dụng đường tổng hợp acid lactic, sau tiến hành rút dịch lên men thời điểm từ 0h đến 72h, sau khoảng thời gian lấy khoảng 100ml dịch lên men đem định lượng glucose theo phương pháp trình bày mục 2.2.5, đo pH dịch lên men tiến hành thu sản phẩm calci lactate theo phương pháp 2.2.4 Kết thể bảng 3.13, 3.14, 3.15: Bảng 3.13 pH dịch lên men thời điểm khác phương pháp lên men liên tục sản xuất calci lactate Thời điểm khảo sát pH 0h 6,01 20h 3,24 48h 3,35 72h 4,72 Bàn luận: Như thời điểm ban đầu pH dịch lên men pH môi trường lên men - pH trung tính, sau lên men 24h pH có thay đổi – pH giảm nhiều (từ 6,01 đến 3,24) điều chứng tỏ có lượng acid lactic hình thành làm acid hóa mơi trường lên men Sau 24h pH gần giữ mức ổn định thời điểm 48h thời điểm 72h pH có gia tăng đến thời điểm không tiến hành đo pH hạt bắt đầu bị vỡ nhiều, môi trường lên men bị đục hạt bị vỡ gây tắc dòng chảy dịch lên men Sau đo pH thời điểm khác dịch lên men tiến hành thu sản phẩm calci lactate, trình thu sản phẩm sử dụng calci carbonat làm chất đệm trung hòa lượng acid tạo thành, cho calci carbonat tiếp 54 xúc với dịch lên men khoảng thời gian định, lắc tiến hành thu sản phẩm calci lactate theo phương pháp trình bày mục 2.2.4, kết thể bảng 3.14: Bảng 3.14: Lượng calci lactate tạo thành (g/100ml dịch lên men) thời điểm khác theo phương pháp lên men liên tục Thời điểm 20h 48h 72h Lượng calci lactate tạo thành (g/100ml) 1,21 2,1 0,52 Theo số liệu bảng 3.14 ta thấy lượng calci lactate tạo thành 100ml dịch lên men tương đối thấp so với phương pháp lên men mẻ, lượng calci lactate tạo thành lớn thời điểm 48h đạt 2,1g Tại thời điểm 72h sản phẩm không tạo thành đạt 0,52g/100ml dịch lên men Đồng thời tiến hành định lượng glucose thời điểm theo phương pháp 2.3.5 để đánh giá khả tế bào sử dụng glucose môi trường lên men, kết thể bảng 3.15: Bảng 3.15: Lượng glucose tế bào vi khuẩn L acidophilus tiêu thụ thời điểm khác theo phương pháp lên men liên tục Thời điểm (h) 20h 48h 72h Lượng glucose tiêu thụ (X) 2,69 4,35 3,11 7,07 Lượng đường khởi điểm (p) Hiệu suất tiêu thụ đường H = X/p x100% 38,05 55 61,52 43,99 Theo bảng 3.15 cho thấy lượng glucose tế bào vi khuẩn tiêu thụ không nhiều, hiệu suất tiêu thụ glucose đạt tối đa 61,52% thời điểm 48h, lên men liên tục không đem lại hiệu lên men tĩnh Tại thời điểm 72h lượng glucose tế bào vi khuẩn tiêu thụ gần 44% lượng calci lactate tạo thành 0,52mg, đồng thời quan sát hạt lên men có vỡ hạt dịch lên men đục có nhiều bọt khí có nhiễm chủng vi sinh vật khác cột lên men, vi sinh vật sử dụng lượng glucose định môi trường lên men mà không tạo thành acid lactic Ngồi tiêu chí số lượng vi khuẩn thoát khỏi hạt tiêu chí quan trọng để để đánh giá chất lượng phương pháp lên men liên tục Khi tiến hành lên men tĩnh lắc bình yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến thoát vi khuẩn khỏi hạt, với phương pháp lên men liên tục khơng có lắc bình trình lên men nhiên dòng chất thường xuyên chảy qua hạt nên lý khiến vi khuẩn dễ bị ngồi Vì chúng tơi tiến hành xác định lượng vi khuẩn L acidophilus bị rửa trôi vào môi trường thời điểm khác theo phương pháp pha lỗng liên tục trình bày mục 2.2.3, kết thể bảng 3.16: Bảng 3.16 Lượng vi khuẩn L acidophilus thoát khỏi hạt alginate thời điểm khác phương pháp lên men liên tục Thời điểm (h) Lượng vi khuẩn thoát khỏi hạt (cfu/ml) 24 235 48 2,5 × 104 60 3,43 × 106 56 Theo kết bảng 3.16 cho thấy thời điểm 60h lượng vi khuẩn bị rửa trơi q trình lên men lớn đến 106 cfu/ml Sau 60h không tiến hành đếm số lượng vi khuẩn bị rửa trôi hạt bắt đầu có trương nở vỡ nhiều Tại thời điểm 24h đầu hạt giữ cố định cột lên men đồng thời khơng có dòng chất chảy qua nên lượng tế bào ngồi khơng đáng kể Khi dòng chất bắt đầu cung cấp liên tục dịch lên men rút đồng thời tế bào vi khuẩn bắt đầu ngồi lớn dần Như dòng chất chảy qua hạt alginate ảnh hưởng đến khả rửa trôi tế bào vi khuẩn khỏi hạt cố định So với lên men hạt cố định phương pháp lên men tĩnh hiệu suất tổng hợp calci lactate theo phương pháp lên men liên tục thấp hẳn, nguyên nhân thời gian dịch lên men lưu cột ngắn (dòng chảy liên tục), dòng chất chảy qua hạt cố định liên tục có phần glucose vi khuẩn L acidophilus sử dụng để chuyển hóa thành acid lactic Trong lên men tĩnh thời gian lên men 96h, hạt cố định tiếp xúc lâu với dịch lên men nên hầu hết lượng glucose sử dụng, kết định lượng đường vi khuẩn L acidophilus sử dụng lên men tĩnh lên men liên tục khẳng định thêm điều Đồng thời q trình lên men liên tục có lượng lớn vi khuẩn thoát khỏi hạt lẫn vào dịch lên men nên làm giảm lượng vi khuẩn L acidophilus có hạt dẫn đến khả sinh tổng hợp acid lactic giảm theo thời gian Về hạt lên men, sau lên men 60h hạt bắt đầu có tượng trương nở vỡ làm đục môi trường lên men, gây tắc cột lên men Nguyên nhân nồng độ acid dịch lên men giữ mức acid làm cho hạt gel calci – alginate không bền, đồng thời dịch lên men chảy qua hạt cố định tạo điều kiện cho acid lactic ức chế sinh trưởng - phát triển vi khuẩn điều góp phần vào việc giảm hiệu suất sinh tổng hợp calci lactate 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện, đề tài thu kết sau: - Thời điểm thu dịch nuôi cấy đem tiến hành cố định tế bào vi khuẩn L acidophilus 20h, mật độ tế bào vi khuẩn dịch nhân giống 1,33×109 tế bào/ml, số lượng tế bào vi khuẩn cố định hạt gel calci alginate 3% vào khoảng 2,87 – 9,8×108 tế bào/g lượng hạt cần thiết để cấy vào 100 ml môi trường lên men tương đương với 10ml dịch nhân giống 30g hạt - Tế bào vi khuẩn L acidophilus cố định hệ gel calci alginate có khả tái sử dụng đến lần giữ hoạt tính sinh tổng hợp acid lactic (lượng calci lactate tạo thành 57,17% so với lần lên men thứ nhất) - Đánh giá số tiêu chí quan trọng trình lên men liên tục sản xuất calci lactate hạt cố định tế bào vi khuẩn: + Lượng calci lactate tạo thành đạt cao thời điểm 48h (2,1g/100ml dịch lên men) + Hiệu suất sử dụng glucose đạt tối đa 61,52% thời điểm 48h + Vi khuẩn ngồi tương đối lớn đạt 106 cfu/ml 58 ĐỀ XUẤT - Tiếp tục nghiên cứu trình cố định tế bào L acidophilus với chất mang khác nhằm ứng dụng không vấn đế sản xuất acid lactic mà ứng dụng sản xuất chế phẩm Probiotics, ngành thực phẩm để sản xuất phomat, sữa chua - Nghiên cứu cố định tế bào với chủng vi khuẩn sinh acid lactic khác để sản xuất acid lactic công nghiệp - Nghiên cứu thêm yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men liên tục để hạn chế tượng bị nhiễm trình lên men chất đệm thích hợp để thu sản lượng calci lactate lớn 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình vi sinh vật học cơng nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật, tr.113 – 228 Nguyễn Lân Dũng cộng (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 2, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Trần Minh Giỏi (1996), Lên men sinh tổng hợp calci lactate, Khóa luận dược sĩ, trường Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Thị Thanh Hải (2008), Sinh tổng hợp acid lactic phương pháp bất động tế bào Lactobacillus acidophilus, Khóa luận dược sĩ, trường Đại học Dược Hà Nội Lê Xuân Hoành (2006), “Phân lập, tuyển chọn, phân loại số chủng Lactobacillus acidophilus sinh acid lactic mạnh nhạy cảm với vitamin B12”, Luận văn thạc sĩ dược học, trường Đại học Dược Hà Nội Kiều Thị Hồng (1999), Tối ưu hóa trình lên men sinh tổng hợp calci lactate, Luận văn tốt nghiệp thạc sỹ dược học, Trường đại học Dược Hà Nội Nguyễn Đức Lượng (1996), Công nghệ vi sinh vật, tập Thực phẩm lên men truyền thống, Trường đại học kỹ thuật TP HCM Trần Thị Ngọc Mai (2007), Nghiên cứu khả bất động tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae gel Ca- aginate, Khóa luận dược sĩ, trường đại học Dược Hà Nội Ngô Đăng Nghĩa (1998), Nghiên cứu động học phản ứng trình lên men ethanol tế bào Saccharomyces cerevisiae cố định gel alginate, Tạp chí khoa học công nghệ, tr.19-24 10 Ngô Đăng Nghĩa (1999), Tối ưu hóa quy trình cơng nghệ sản xuất alginate natri từ rong mơ Việt Nam ứng dụng số lĩnh vực sản xuất, Luận án Tiến sĩ kỹ thuật, Trường Đại học Thủy sản 11 Hà Thị Thanh (1997), Góp phần nghiên cứu tối ưu hóa q trình lên men sinh tổng hợp calci lactate, Luận văn tốt nghiệp dược sỹ đại học, khóa 1992-1997 12 Lê Thị Thảo (2009), Đánh giá khả bất động Lactobacillus acidophilus chất Ca – alginate Agar – agar, Khóa luận dược sĩ, trường đại học Dược Hà Nội 13 Phạm Bá Thăng (2011), Khảo sát trình tạo calci lactate phương pháp cố định tế bào Lactobacillus acidophilus, Khoá luận dược sĩ, Trường đại học Dược Hà Nội 14 Cao Văn Thu (1997), Góp phần nghiên cứu tối ưu hóa q trình lên men sinh tổng hợp calci lactate, Thông báo khoa học, Trường Đại học Dược Hà Nội 15 Cao Văn Thu Kiều Thị Hồng (1998), Quy hoạch thực nghiệm phi tuyến tính lên men sinh tổng hợp calci lactate, Thông tin khoa học dược, Trường Đại học Dược Hà Nội Tiếng Anh 16 Atsuo Tanaka and Takuo Kawamoto, Cell immobilization, Kyoto University Kyoto, Japan, page 505-512 17 Bodalo, A., Bastido, J., Gomez, E., Alcaraz, I Anh Asanza, M L (1997), Stabilization studies of L-aminoacylase producing Pseudomonas sp BA2 immobilized in calcium alginate gel, Enzyme Microbiol technol, Vol 21, page 64-69 18 Boyaval, P and Goulet, J 1988, Optimal conditions for production of lactic acid from cheese whey permeate by calcium alginate ectrapped Lactobacillus helveticus, Enzyme Microbiol technol, Vol 10, page 725728 19 Bruno, J.M, Ragout, A.L., Cordoba, P.R and Sineriz, F 1999, Continuous production of L (+) lactic acid by Lactobacillus casei in twostage systems, Applied Microbiology Biotechnology, Vol 51, page 31624 20 Demi C.G, S.C Prescettle (1959), The production of lactic acid by fermentation, Ind Micr, New York, page 304-331 21 Dominguw R.M (1998), Optimization of the L-lactic acid production as feedstock for the polymers formation, Polymer preprints, American Chemical society, Division of polymer chemistry No.1, Vol.39, page 282- 283 22 Edited by A Steinbiichee & K S Phee (2005), Polysaccharides & Polyamides in the food industry Properties, Production & patents, Weinheim 23 Fritsche W (1983), Cơ sở hóa sinh vi sinh vật học công nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật 24 Gassem, M.A et.al 2000, Lactic acid production by Lactobacillus delbrueckii ssp Bulgaricus in camel's and cow's wheys, Milchwissenschaft, No.7, Vol 55, page.374-377 25 Giivene (1997), Batch and continuous production of lactic acid from beet mollasses by L delbrueckii IFO 3202 J Chem Tech biotechnol, Vol.69, page 399-404 26 Groben G.J (1998), Enhancement of exopolysaccarid production by L delbrueckii NCFB 2772 with a simplified defined medium, Applied and environmental microbiology 1333-1337, No.4, Vol.64 27 Gouqiang, D and Kaul, R and Mattiasson, B 1991, Evaluation of alginate immobilized Lactobacillus casei for lactate production, Applied Microbiol Biotechnol, Vol.36, page 309-314 28 Hagerdal B.H (1997), L- lactic acid production from whole wheat flour hydrolysate using strains of lactobacillus and lactococci, Enzyme and microbial technology, Vol 20, page 301- 307 29 Jiyeon Ha (2005), Bioremediation of the organophosphate pesticide, coumaphos, using microorganisms immobilized in calcium- alginate gel beads, Submitted to the Office of Graduate Studies of Texas A & M University in partial fulfillment of the requirements for the degree of doctor of philosophy, page.26 30 Klinkenberg, G and Lystad, K.Q and Levine, D W and Dyrset, N 2001, Cell release from alginate immobilized Lactococcus lactic ssp Lactic in chitosan and alginate coated beads, Jourmal of Dairy Science, Vol 84, page 1118-1127 31 Kotzamanidis, C.H., Roukas, T and Skaracis, G 2002, Optimization of lactic acid production from beet molasses by Lactobacillus delbrueckii NCIMB 8130, World Journal of Microbiology and Biotechnology, Vol 18, page 441-448 32 Krishnan, S and Gowthaman, M.K and Misra, M C and Karanth, N.G 2001, Chitosan treated polypropylene matrix as immobilization for lactic acid production using Lactobacillus plantarum NCIM 2084, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, Vol 76, page 461-468 33 Litchefield J.H (1996), Microbiological production of lactic acid, Advances in applied microbiology, vol.12 34 Moon S.H and Tsai S.P (1998), An intergrated bioconversion process for production of L – lactic acid from starchy potato feed stocks, Applied biochemistry and biotechnology, vol 70-72 35 Monteggudo J.M (1997), Kinetics of lactic acid fermentation by L delbrueckii grown on beet molasses, J Chem Tech Biotechnol, Vol.68, page 271-276 36 Meltem Gunduz (2005), Lactic acid production by Lactobacillus casei NRRL B-441 immobilized in chitosan stabilized calcium alginate bead, A thesis submitted to the graduate sciences of izmir institute of Technology in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science 37 Roukas, T and Kotzekidou, P 1991, Production of lactic acid from deproteinized whey by immobilized lactobacillus casei and Lactococcus lactic cells, Enzyme Microbiol Technology, Vol 38, page 33 - 38 38 Rymowicz, W., Wojtatowicz, M., Robak, M and Jurgielewicz, W 1993, The use of immobilized Yarrowia lipolytica cells in calcium alginate for citric acid production, Acta Microbiologica polonica, Vol 42, page 163170 39 Shelef L.A (1994), Antimicrobial effects of lactates, A review, J of food protection, vol 57, page 445 – 450 40 Tsen Jen – Horng, Lin Yeu – Pyng, King V.An – Erl, Fermentation of banana medio by using κ–carrageenan immobilized Lactobacillus acidophilus, International Journal of Food Microbiology, 91, 215 – 220 (2004) 41 Zhan Ying Zang (2007), “Production of lactic acid from renewable by Rhyzopus fungi”, Biochemical engineering Journal, Vol 35, page 251– 263 Phụ lục 1: Đồ thị biểu diễn khối lượng calci lactate tạo thành sau 96h lên men với tế bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus dạng tự dạng cố định với alginate Sản phẩm calci lactate (g) 8.25 7.62 7.04 6.21 5.91 5.25 tế bào tự tế bào cố định mẻ mẻ mẻ Phụ lục 2: Đồ thị biểu diễn khối lượng calci lactate trung bình tạo thành lần tái sử dụng Sản phẩm calci lactate (g) 8.18 7.02 5.79 5.27 4.37 3.86 3.31 2.81 1.82 sd lần sd lần sd lần sd lần sd lần sd lần sd lần sd lần sd lần Phụ lục 3: Đồ thị biểu diễn lượng glucose tế bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus cố định alginate sử dụng lần tái sử dụng Lượng glucose sử dụng 6.02 6.67 6.33 5.73 5.19 4.96 4.76 3.21 2.49 sd sd sd sd sd sd sd sd sd lần lần lần lần lần lần lần lần lần Phụ lục 4: Biểu đồ biểu diễn biến thiên pH dịch lên men lô khác pH Thời gian(h) 0 20 Lô (Tb cố định, có CaCO3) 40 60 Lơ (Tb tự do, có CaCO3) 80 100 120 Lơ (Tb tự do, không CaCO3) ... bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus cố định để sản xuất calci lactat NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nội dung nghiên cứu nhằm đạt mục tiêu sau Nghiên cứu cố định tế bào L acidophilus gel alginate - Xác định. .. thực đề tài Nghiên cứu cố định tế bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus để sản xuất calci lactat” nhằm đạt mục tiêu sau: Nghiên cứu trình cố định tế bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus gel alginate... alginate 3% - Xác định lượng hạt cố định để lên men sản xuất calci lactate theo phương pháp lên men mẻ Ứng dụng cố định tế bào vi khuẩn L acidophilus chất alginate để sản xuất calci lactat theo