acidophilus cố định trong gel alginate tiêu thụ sau mỗi lần tái sử dụng 48 Bảng 3.11: pH dịch lên men tại các thời điểm lên men khác nhau của các mẫu lên men và lượng calci lactate tạo
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LÊ THỊ THU HIỀN
NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH VI KHUẨN
Lactobacillus acidophilus ATCC 4356
ĐỂ SẢN XUẤT CALCI LACTATE
LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI 2012
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LÊ THỊ THU HIỀN
NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH VI KHUẨN
Lactobacillus acidophilus ATCC 4356
ĐỂ SẢN XUẤT CALCI LACTATE
LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHIỆP DƯỢC – BÀO CHẾ
MÃ SỐ: 607103
Người hướng dẫn khoa học: TS ĐÀM THANH XUÂN
HÀ NỘI 2012
Trang 42.3.1 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 25 2.2.2 Phương pháp bất động tế bào vào cơ chất 25 2.2.3 Phương pháp pha loãng liên tục – Tính số lượng vi khuẩn được
cố định và rửa trôi trong quá trình lên men
26
2.2.4 Phương pháp lên men và thu sản phẩm calci lactate 27 2.2.5 Phương pháp tính hiệu suất quá trình tạo calci lactate thông qua phương pháp định lượng glucose
29
2.2.6 Phương pháp lên men liên tục tạo acid lactic bằng hạt cố định 30
3.1 Nghiên cứu cố định tế bào L acidophilus trên gel alginate 32 3.1.1 Xác định thời điểm thu sinh khối tế bào vi khuẩn đem cố định 32 3.1.2 Xác định tỷ lệ phối trộn dung dịch alginate 3% với sinh khối tế bào vi khuẩn
35
3.1.3 Lựa chọn trạng thái phối trộn tế bào vi khuẩn Lactobacillus
37
3.1.4 Xác định lượng hạt cố định để lên men sản xuất calci lactate theo phương pháp lên men mẻ
37
3.2 Ứng dụng cố định tế bào vi khuẩn L acidophilus trên cơ chất
alginate để sản xuất calci lactate theo phương pháp lên men mẻ
39
Trang 53.2.1 Khả năng tổng hợp calci lactate của tế bào L acidophilus khi cố
định trên gel calci alginate
40
3.2.2 Đánh giá khả năng lưu giữ tế bào vi khuẩn L acidophilus trên
hệ gel calci alginate trong quá trình nuôi lên men
42
3.2.3 Khả năng tái sử dụng các tế bào L acidophilus khi cố định trên
hệ gel calci alginate để sản xuất calci lactate
45
3.2.4 Đánh giá khả năng chịu acid của tế bào cố định 49 3.3 Khảo sát quá trình lên men liên tục sinh tổng hợp calci lactate 51 3.3.1 Khảo sát sơ bộ khả năng sinh tổng hợp calci lactate khi sử dụng môi trường lên men chứa lactose và chứa sữa
52
3.3.2 Lên men liên tục sản xuất calci lactate 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Phụ lục 1: Sơ đồ biểu diễn khối lượng calci lactate tạo thành sau 96h
lên men với tế bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus dạng tự do và
dạng cố định với alginate.
Phụ lục 2: Đồ thị biểu diễn khối lượng calci lactate trung bình tạo thành ở 9 lần tái sử dụng
Phụ lục 3: Đồ thị biểu diễn lượng glucose tế bào vi khuẩn
sử dụng
Phụ lục 4: Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH dịch lên men ở các lô khác nhau
Trang 6LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
em trong suốt thời gian học tập tại trường, đồng thời em xin chân thành cảm
ơn đến các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên đang giảng dạy và làm việc tại
bộ môn Công nghiệp dược đã đóng góp ý kiến và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài luận văn thạc sỹ
Đặc biệt, với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm
ơn chân thành TS Đàm Thanh Xuân, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chia
sẻ, động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn tại bộ môn
Trong quá trình nghiên cứu khoa học bản thân em nhận thấy còn nhiều vấn đề khó khăn mà chưa giải quyết được, vì vậy em rất mong những ý kiến đóng góp khoa học, xác đáng của thầy cô và bạn bè để hoàn thiện hơn trên con đường nghiên cứu khoa học của mình
Em xin chân thành cảm ơn!
Trang 7DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Trang 8Bảng 2.5: Các thông số sử dụng trong lên men liên tục tạo calci
Bảng 3.2: Mật độ tế bào vi khuẩn L acidophilus cố định trên gel
calci alginate 3% khi cố định với các lượng sinh khối khác nhau
36
Bảng 3.3: Mật độ vi khuẩn L acidophilus đạt được trong 1g hạt calci
alginate khi sử dụng 50ml dịch nhân giống phối trộn với 50ml dung
dịch natri alginate 6%
38
Bảng 3.4: Lượng hạt chứa tế bào vi khuẩn L acidophilus tương
đương với số lượng tế bào trong 10ml môi trường nhân giống sau
20h
39
Bảng 3.5: Lượng calci lactate thu được trong 100ml môi trường lên
men sau 96h lên men với tế bào vi khuẩn L acidophilus ở trạng thái
tự do và ở trạng thái cố định trong hệ gel calci alginate
41
Bảng 3.6: Lượng đường tiêu thụ của tế bào vi khuẩn L acidophilus
khi cố định trên gel alginate sau 96h lên men với tế bào ở dạng tự do
41
Bảng 3.7: Mật độ tế bào vi khuẩn L acidophilus trong hạt calci 43
Trang 9alginate và dịch nuôi cấy sau các khoảng thời gian lên men
Bảng 3.8: Khả năng tái sử dụng các hạt len men và khối lượng calci
lactate tạo thành sau mỗi lần tái sử dụng
45
Bảng 3.9: Mật độ vi khuẩn L acidophilus trong 1g hạt calci alginate
sau 96h lên men và sau khi tái sử dụng hạt đến lần thứ 9
47
Bảng 3.10: Lượng glucose tế bào vi khuẩn L acidophilus cố định
trong gel alginate tiêu thụ sau mỗi lần tái sử dụng
48
Bảng 3.11: pH dịch lên men tại các thời điểm lên men khác nhau của
các mẫu lên men và lượng calci lactate tạo thành sau 96h lên men
50
Bảng 3.12: Lượng calci lactat hình thành khi sử dụng môi trường lên
men chứa lactose và môi trường lên men chứa sữa
53
Bảng 3.13: pH dịch lên men tại các thời điểm khác nhau trong
phương pháp lên men liên tục sản xuất calci lactate
54
Bảng 3.14: Lượng calci lactate tạo thành (g/100ml dịch lên men) tại
các thời điểm khác nhau theo phương pháp lên men liên tục
55
Bảng 3.15: Lượng glucose tế bào vi khuẩn L acidophilus tiêu thụ tại
các thời điểm khác nhau theo phương pháp lên men liên tục
55
Bảng 3.16: Lượng vi khuẩn L acidophilus thoát ra khỏi hạt alginate
tại các thời điểm khác nhau trong phương pháp lên men liên tục
56
Trang 10DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1 Lactobacilus acidophillus dưới kính hiển vi điện tử 5
Hình 1.2 Lactobacillus acidophillus dưới kính hiển vi quang học 5 Hình 1.3 : Các phương pháp bất động tế bào cơ bản 17 Hình 1.4: Cấu trúc của β–D–Mannuronic acid và α–L–Guluronic acid 19 Hình 1.5: Cấu dạng của β–D–Mannuronic acid và α–L–Guluronic acid 20 Hình 1.6: Hình thể của block GGGG, MMMM, MGMG 20 Hình 1.7: Liên kết của ion Ca2+ với alginate 21 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình kết tinh calci lactate 28
Hình 3.1 Đồ thị thể hiện đường cong sinh trưởng của L acidophilus 34
Trang 11ĐẶT VẤN ĐỀ
Đã có rất nhiều nghiên cứu về quá trình lên men và các sản phẩm lên men của vi sinh vật Các sản phẩm này ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong mọi lĩnh vực của đời sống như y dược, thực phẩm, dệt may, mỹ phẩm… mang lại hiệu quả kinh tế cao và góp phần giảm thải ô nhiễm môi trường
Trong các loài vi sinh vật được nghiên cứu, Lactobacillus acidophilus được
quan tâm nghiên cứu nhiều do vai trò to lớn của chúng đối với con người và
tự nhiên Đây là một trong số những chủng vi khuẩn có lợi của đường tiêu hóa với lượng khá lớn, cũng như sự có mặt trong rất nhiều sản phẩm mang lại lợi ích cho sức khỏe con người Chính vì vậy chúng được ứng dụng khá nhiều trong thực tiễn như tạo acid lactic, tạo các chế phẩm probiotics…
Cùng với sự phát triển của các ngành khoa học - công nghệ tiên tiến, công nghệ sinh học nói chung và công nghệ vi sinh nói riêng đã có nhiều thành tựu đổi mới, các thành tựu đó đã được ứng dụng rộng rãi trong thực tế nhằm nâng cao hiệu quả của quá trình lên men Một trong những kỹ thuật
hướng nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu là “phương pháp bất động
tế bào”, đây là phương pháp xuất hiện từ rất lâu nhưng vẫn mang lại nhiều
hiệu quả to lớn trong công nghệ lên men Nhiều nghiên cứu đã áp dụng phương pháp này để tạo ra các sản phẩm cho ngành dược và các ngành công nghiệp khác
Từ thực tế đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu cố định tế bào vi
khu ẩn Lactobacillus acidophilus để sản xuất calci lactat” nhằm đạt được
các mục tiêu sau:
1 Nghiên cứu quá trình cố định tế bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
trên gel alginate
2 Sử dụng tế bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus đã cố định để sản
xuất calci lactat
Trang 12NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung nghiên cứu nhằm đạt được các mục tiêu sau
1. Nghiên cứu cố định tế bào L acidophilus trên gel alginate
- Xác định thời điểm thu sinh khối tế bào vi khuẩn đem cố định
- Xác định tỷ lệ phối trộn dung dịch alginate 3% với sinh khối tế bào vi khuẩn
- Lựa chọn trạng thái phối trộn tế bào vi khuẩn L acidophilus với dung
dịch alginate 3%
- Xác định lượng hạt cố định để lên men sản xuất calci lactate theo phương pháp lên men mẻ
2. Ứng dụng cố định tế bào vi khuẩn L acidophilus trên cơ chất
alginate để sản xuất calci lactat theo phương pháp lên men mẻ
- Khả năng tổng hợp calci lactate của tế bào L acidophilus khi cố định
trên gel calci alginate
- Đánh giá khả năng lưu giữ tế bào vi khuẩn L acidophilus trên hệ gel
calci alginate trong quá trình lên men
- Khả năng tái sử dụng các tế bào L acidophilus khi cố định trên gel
calci alginate để sản xuất calci lactate
- Đánh giá khả năng chịu acid của tế bào cố định
3 Khảo sát quá trình sinh lên men liên tục sinh tổng hợp calci lactate
- Khảo sát sơ bộ khả năng sinh tổng hợp calci lactate khi sử dụng môi trường lên men chứa lactose và chứa sữa
- Lên men liên tục tổng hợp calci lactate
Trang 13CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn lactic
1.1.1 Đặc điểm của vi khhuẩn lactic
Hầu hết các vi sinh vật sinh acid lactic đều thuộc chi lactobacillaceae và
được xếp vào bốn chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và
Hình dạng và kích thước của vi khuẩn lactic khá phức tạp và đa dạng: có thể dạng hình cầu, hình oval hay hình que, có thể mọc đơn, mọc đôi hoặc mọc thành chuỗi
Về mặt sinh lý thì chúng khá tương đồng, tất cả đều là vi khuẩn Gram (+), không tạo bào tử, hầu như không di động, ưa nhiệt, hô hấp yếm khí hoặc
vi hiếu khí, thu năng lượng từ phân giải glucid và tiết ra acid lactic [2] Nhóm
vi khuẩn này phát triển và tồn tại tốt trong điều kiện pH tương đối thấp (pH=4,5 – 6,8), nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng
là từ 10 – 500C Đây là vi khuẩn thuộc loại dị dưỡng nên chúng đòi hỏi môi trường dinh dưỡng khá phức tạp và giàu chất dinh dưỡng, bao gồm các vitamin, acid amin, thậm chí cả các peptid ngắn Chúng có khả năng đồng hóa nhiều loại đường như glucose, mantose, lactose, saccarose…, còn đối với đường cao phân tử thì chỉ một vài loài mới có khả năng sử dụng để lên men tạo acid lactic
Trang 14các sản phẩm khác chỉ xuất hiện dưới dạng vết nhỏ Trong quá trình chuyển hóa, acid lactic được tạo thành thông qua chu trình EMP (Embden–
Meyerhorf Parnas) Đại diện nhóm này là L acidophilus, L bulgaricus, L delbrueckii…
Nhóm 2: Gồm các chủng lên men lactic dị hình không bắt buộc, sản phẩm của quá trình lên men có thể là acid lactic, acid acetic, acid formic và ethanol phụ thuộc loại đường cung cấp trong môi trường Nếu là đường có 6 nguyên tử carbon như glucose, hexose, fructose thì quá trình lên men đồng hình, còn nếu là các đường khác thì lên men dị hình tạo acid lactic nhờ sự
cảm ứng của enzyme phosphoketolase Đại diện nhóm này là L plantarum, L casei, L helvesticus, L leichmenii…
Nhóm 3: Bao gồm các chủng lên men dị hình bắt buộc, chuyển hóa glucose theo con đường ED (Entner - Doudoroff), sản phẩm cuối cùng là acid lactic, acid acetic, carbonic và ethanol Vi khuẩn nhóm này chủ yếu dạng hình que dài hoặc mảnh, nhiệt độ phát triển tối ưu là 30 – 400C Chúng phân bố
khá rộng trong tự nhiên như đất, nước, rau quả… Đại diện nhóm này là L brevis, L buchneri, L fermentum
1.1.3. Loài Lactobacillus acidophilus [2], [5]
Loài L acidophilus thuộc giới vi khuẩn, ngành Fermicutes, lớp bacilli,
bộ lactobacilliales, họ lactobacillaceae, giống lactobacillus Vi khuẩn này
được mô tả đầu tiên bởi bác sĩ Brumo Oppler và nhà nghiên cứu dạ dày – ruột
Isodor Boas Tên Lactobacillus acidophilus bắt nguồn từ “lacto” với nghĩa là sữa, “bacillus” chỉ hình dáng giống cây gậy và acidophilus có nghĩa là “ ưa
acid”
chuỗi ngắn không sinh bào tử, không di động, kị khí không bắt buộc và có
Trang 15phản ứng catalase âm tính L acidophilus phát triển tốt ở nhiệt độ tối ưu là
370C, chịu được pH tương đối thấp (pH từ 5 đến 6)
trong hệ thống đường tiêu hóa nhờ khả năng bám dính và liên kết với nhau thành tập đoàn nhằm hạn chế sự phát triển của vi khuẩn có hại Khi vào cơ thể chúng sẽ định cư ở đường ruột và cạnh tranh vị trí gắn kết trên thành ruột với
vi khuẩn có hại, làm hạn chế số lượng vi khuẩn có hại trong đường ruột đồng thời sản sinh ra các chất hữu ích như niacin, acid folic… hỗ trợ phân giải lactose trong quá trình tiêu hóa thức ăn ở dạ dày - ruột
Hiện nay, L.acidophilus được sử dụng nhiều trong các chế phẩm
Probiotics như: Antibio, Lactomin, Lacteolforte… để điều trị các trường hợp rối loạn tiêu hóa do dùng kháng sinh dài ngày hoặc trong các trường hợp đầy bụng khó tiêu, trẻ kém ăn, chậm lớn Bên cạnh các sản phẩm Probiotic thì chúng còn có khả năng lên men tạo acid lactic, một dung môi được ứng dụng nhiều trong thực tiễn như bảo quản thực phẩm hay dùng trong dung dịch vệ sinh phụ nữ Dạ hương, Lactacyd…
1.2 Sản xuất acid lactic
Trang 16Cấu trúc của acid lactic
- Công thức tổng quát: C3H6O3
- Khối lượng phân tử: 90,08
- Công thức cấu tạo
- Các dạng của acid lactic: do trong phân tử của acid lactic có 1 carbon bất đối (C*), nên acid lactic có 1 cặp đối quang là acid D (-) lactic và acid L (+) lactic
Acid D(-) lactic Acid L(+) lactic
Cấu trúc không gian của phân tử acid D, L-lactic:
Ngoài các dạng đồng phân trên, acid lactic còn một dạng chứa đồng thời
cả 2 đối quang, gọi là hỗn hợp racemic Dạng acid racemic – (DL) lactic thường là kết quả từ phương pháp tổng hợp hóa học đi từ hợp chất lactonitril
Trang 17[33], [34], [39] hoặc nhờ hoạt động của enzyme DL – lactatdehydrogenase do một số loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp acid lactic tạo ra [33]
Các acid lactic có tính quang hoạt khi bị chiếu bởi ánh sáng phân cực đi qua mặt phẳng dao động thì nó bị quay một góc α Các dạng phân cực này cũng có thể chuyển thành dạng acid racemic (có trị số góc quay cực bằng 0)
dưới tác dụng của enzyme racemase từ một vài loài vi khuẩn lactic
Tính chất của acid lactic
- Ở dạng dung dịch acid lactic là chất lỏng trong suốt không màu, không mùi, có vị chua đặc trưng, tan tốt trong nước và không bay hơi [39]
- Acid lactic dạng tinh thể ở áp suất khí quyển rất dễ tan thành dạng chất lỏng Dạng acid D (-) lactic có sự trao đổi chất khác nhau trong cơ thể con người và có thể gây bệnh đối với trẻ em, do đó trong bảo quản chế biến thực phẩm người ta chỉ sử dụng acid lactic dạng acid L (+) lactic [34]
- Ở pha lỏng, acid lactic dễ dàng chuyển sang dạng dimer mạch thẳng lactoyl lactate và polymer mạch thẳng cao hơn, khi đó nhóm hydroxyl của phân tử này sẽ liên kết ester với nhóm carbonyl của phân tử khác Hơn nữa dạng dimer mạch vòng lactid cũng có thể được hình thành nếu được thực hiện đun nóng kéo dài ở 1400C dưới áp suất thấp và khi chưng cất chúng có thể bị đổi độ quay cực [33]
Vai trò của acid lactic
Acid lactic có vài trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực:
Với ngành y - dược, acid lactic thường được sử dụng dưới dạng muối calci lactate và dùng trong các trường hợp thiếu calci hoặc nhu cầu cơ thể tăng như phụ nữ có thai, phụ nữ cho con bú, trẻ em còi xương… Nó có thể được dùng kết hợp với calci carbonat hoặc calci gluconat Bên cạnh đó, các muối lactate còn là thành phần chủ yếu của dịch truyền bổ sung chất điện giải như Ringerlactate được sử dụng phổ biến Ngoài ra, acid lactic cũng được sử
Trang 18dụng nhiều trong ngành mỹ phẩm như dung dịch vệ sinh phụ nữ Dạ hương, Lactacyd…
Với ngành công nghiệp thực phẩm, quá trình lên men tạo acid lactic được sử dụng phổ biến nhất Lên men lactic để bảo quản và chế biến thực phẩm thực chất là tạo cho sản phẩm tích lũy được một lượng acid đủ để ngăn cản sự hoạt động của các vi sinh vật gây thối, đồng thời là chất phụ gia thực phẩm tạo hương vị chua phù hợp với khẩu vị, chuyển nguyên liệu từ dạng sống về dạng chín sinh học và tăng hệ số chuyển hóa thức ăn so với nguyên liệu ban đầu Các sản phẩm được tạo thành nhờ lên men lactic rất phong phú như sữa chua, nem chua, hoa quả muối, pho mat, muối rau dưa, kim chi… Hơn nữa acid lactic và vi khuẩn lactic còn là những nhân tố giúp ích cho quá trình tiêu hóa, tạo sự ngon miệng và góp phần duy trì tốt sự cân bằng của hệ
vi sinh vật có lợi cư trú trong đường ruột [7]
Trong quá trình sản xuất rượu vang, sự có mặt của acid lactic có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc chuyển hóa acid malic, làm cho vị của rượu vang không bị đắng chát, khó chịu, acid lactic có trong dịch sẽ làm ức chế sự hoạt động của vi khuẩn butyric là loại vi khuẩn gây hỏng rượu vang Quá trình tạo acid lactic này gọi là quá trình lên men malolactic có tính chất quyết định làm ổn định đặc tính sinh học của rượu vang và góp phần cải thiện chất lượng của sản phẩm [39]
Ngày nay, người ta cũng nghiên cứu tổng hợp được acid polylactic, đây
là một hợp chất polymer sinh học được sử dụng nhiều trong y học như làm chỉ khâu vết thương, làm lành hóa vết thương và tạo các bộ phận thay thế trong cơ thể [26]
Thêm vào đó, sự phát triển của acid lactic trên cơ sở trùng hợp polymer cũng được ứng dụng trong các ngành công nghiệp mới Trong đó ngành công nghiệp được quan tâm nhiều là công nghệ môi trường với tiềm năng có thể
Trang 19thay thế các chất liệu plastic thông thường bằng các loại polymer sinh học Đặc tính hay nhất của hợp chất polymer sinh học là chúng có thể bị phân hủy tạo thành CO2 và H2O dưới sự hoạt động của hệ vi sinh vật trong tự nhiên Hiện nay, các hợp chất này đã ứng dụng sản xuất ở nhiều quốc gia và được sử dụng rộng rãi để sản xuất các đồ nhựa như chai, lọ, túi, phim… và các sản phẩm có ích khác Đây là một xu hướng mới và rất có tiềm năng để phát triển
trong tương lai và đó cũng đang được coi là giải pháp “xanh” đối với môi
trường [34]
Ngoài các ứng dụng trên acid lactic cũng được sử dụng nhiều trong công nghiệp thuộc da, công nghiệp dệt và công nghiệp đồ nhựa [33]
1.2.2 Các phương pháp sản xuất acid lactic
Acid lactic được ứng dụng rộng rãi và trở thành một acid hữu cơ quan trọng trong ngành công nghiệp, acid lactic được sản xuất bởi 2 phương pháp:
Phương pháp tổng hợp hóa học
Phương pháp lên men
Hai phương pháp đều có những ưu điêm riêng và cạnh tranh lẫn nhau [28]
1.2.2.1 Phương pháp tổng hợp hóa học
Ở Mỹ những thập kỷ trước, các nhà khoa học đã nghiên cứu sản xuất acid lactic bằng phương pháp tổng hợp hóa học, khi đó phương pháp này được coi là phương pháp hữu hiệu và chiếm ưu thế hơn hẳn so với phương pháp vi sinh vật do có ưu điểm:
- Dễ dàng thu được acid lactic từ các nguồn khác nhau như: [3], [6], [11] + Thủy phân α – halogenid acid từ acid α – cloropropionic
+ Khử hóa ceton acid bằng hydro mới sinh đi từ acid pyruvic
+ Cộng hợp ái nhân với tác nhân HCN từ nguồn acetaldehyd
- Giá thành rẻ
- Thời gian thực hiện nhanh
Trang 20Do vậy phương pháp này được sử dụng rất rộng rãi tạo acid lactic cho các ngành công nghiệp khác nhau như tổng hợp các chất phụ gia thực phẩm, các hợp chất dẻo và một số các sản phẩm khác [33]
Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu cho thấy khi tổng hợp acid lactic bằng phương pháp hóa học thường tạo ra dạng acid D (-) lactic và acid racemic D,L lactic, các dạng này thường ít dùng đối với con người do chúng gây hại đối với sức khỏe Chính vì vậy mà hiện nay người ta vẫn tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện không ngừng kỹ thuật lên men vi sinh sản xuất acid lactic do tạo ra sản phẩm tự nhiên là acid L (+) lactic là chủ yếu [21], [28]
1.2.2.2 Phương pháp lên men vi sinh vật
Ưu điểm
- Tạo ra sản phẩm tự nhiên là acid L(+) lactic
- Nguyên liệu ban đầu để sản xuất acid lactic là các chất thải của các ngành công nghiệp khác như công nghiệp sản xuất đường, bánh kẹo, công nghiệp chế biến sữa, chế biến gỗ, chế biến nông lâm sản… Đây là nguồn nước thải chứa hàm lượng chất hữu cơ cao, gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng trực tiếp đến đời sống con người cũng như các sinh vật xung quanh khác [33], [34]
Các phương pháp lên men sản xuất acid lactic
Lên men sản xuất acid lactic là phương pháp vừa cổ điển vừa hiện đại, bởi đây là phương pháp được phát hiện từ rất sớm, song đến gần đây mới được cải tiến và áp dụng nhiều Năm 1881, việc sản xuất acid lactic thuần khiết chính thức ra đời bởi Mass Delbrucck [20], [6] Mặc dù phương thức lên men sản xuất acid lactic từ vi sinh vật trở thành một ngành sản xuất quan trọng phát triển ở Châu Âu nhưng việc sản xuất trên quy mô công nghiệp lớn
và mang tính chất thương mại hóa lại xuất hiện đầu tiên ở Mỹ vào năm 1883 tại công ty Averylatate Littleton, Massachusett [28], [33]
Trang 21Quá trình tạo thành acid lactic là do quá trình chuyển hóa kỵ khí đường nhờ các vi sinh vật yếm khí hoặc vi hiếu khí vì vậy trong sản xuất chỉ áp dụng lên men chìm mới có ý nghĩa
Công nghệ sản xuất acid lactic vẫn đang nhận được sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu ở nhiều nơi trên thế giới, hiện nay 90% sản lượng acid lactic được sản xuất trên thế giới từ công nghiệp lên men vi khuẩn, một phần rất nhỏ từ tổng hợp hóa học và nhu cầu thị trường thế giới không ngừng tăng lên từ 10% đến 15% mỗi năm [41]
Lên men công nghệ sinh học có ý nghĩa tốt với việc bảo vệ môi trường
vì nó có thể tái hồi phục lại nguồn tài nguyên thiên nhiên với nhiệt độ sản xuất không cao, năng lượng thấp và sản phẩm tạo thành với sự tinh khiết cao
Acid L (+) lactic được tạo ra bởi các vi khuẩn sinh lactic như L pentosus, L
nguồn nguyên liệu tinh bột, các loại đường glucose, lactose…, hạt lúa mì, ngũ cốc
Có nhiều phương thức lên men sản xuất acid lactic, các quá trình lên men bị ảnh hưởng bởi nhiều nhân tố: nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ dịch lên men và oxy
Đã có nhiều nghiên cứu được công bố trên thế giới và tại Việt Nam như: Cheng (1992) tiến hành sản xuất acid lactic từ dịch thủy phân tinh bột có
bổ sung cao nấm men, chủng sản xuất là L amylovorus, quá trình được duy
trì ở pH = 6 trong thùng lên men có dung tích 1-2 lít ở 400C Sau 48h lên men tốc độ sản phẩm cực đại trong pha sản xuất là 7,36g/l.h và nồng độ acid lactic trong dịch là 120,7g/l, hiệu suất tiêu thụ cơ chất là 0,94g/g [33]
Jose M Monteagudo và cộng sự đã nghiên cứu động học quá trình lên
men tạo acid lactic từ rỉ đường củ cải nhờ chủng L delbrueckii CECT 286, sử
dụng bình lên men 5 lít có cánh khuấy tốc độ 100 vòng/phút ở 490C, pH được
Trang 22điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 2M Nồng độ acid lactic đạt được cao nhất
là 57g/l với hiệu suất chuyển hóa cơ chất là 91% [6], [35]
Keller và Gerhardt (1975) sử dụng chủng L delbrueckii – subsp
phomat chứa 50g/l lactose Thùng lên men có dung tích 14 lít, hệ thống bình lên men gồm 2 cấp, nhiệt độ lên men là 440C ở pH = 5,5 Sản lượng đạt 1,77g/l.h với năng suất 55g/l và hiệu suất sử dụng cơ chất là 98% [33]
Aeschlimann và Von Stockar (1990) nghiên cứu mô hình lên men liên tục 2 cấp trên môi trường nước sữa chế biến từ phomat qua tinh lọc có hàm
lượng chất thô 60g/l, cao mấm men 10g/l nhờ chủng L helveticus Ở giai
đoạn 1 sử dụng thùng có dung tích 1 – 1,5 lít và ở giai đoạn 2 sử dụng thùng 2 – 2,5 lít, nhiệt độ lên men là 420C ở pH = 5,5 trong 28 ngày, tốc độ tạo sản phẩm tối đa trong pha sản xuất là 6,36g/l.h và hiệu suất tiêu thụ cơ chất là 98% [33]
Theo công bố của Sancher – Podlech (1990) và Stein (1991) áp dụng phương pháp lên men bán liên tục trên môi trường nước sữa có chứa 43 – 50g/l lactose tiến hành trong thùng 15 lít ở nhiệt độ 450C, pH = 5,6 nhờ
chủng L delbrueckii subsp bulgaricus đạt sản lượng 3,69 – 5,26 g/l.h Hiệu
suất tiêu thụ cơ chất là 93% [33]
Yekta Goksungus Ulgar Giivene thực hiện lên men acid lactic nhờ chủng
phẩm cực đại trong pha sản xuất là 11,2g/l.h ở tốc độ pha loãng D = 0,5l/h, nhiệt độ khoảng 450C ± 1, thể tích làm việc là 340cm3 Nồng độ đường trong môi trường là 52,1 g/l có sử dụng CaCO3 3% điều chỉnh pH = 6,0 Quá trình bắt đầu là lên men gián đoạn sau 15 giờ mới tiến hành lên men liên tục [25] Cao Văn Thu và cộng sự (1998) xây dựng mô hình quy hoạch thực
nghiệm phi tuyến tính lên men sinh tổng hợp calci lactate nhờ chủng L
Trang 23acidophilus trên môi trường nuôi cấy chứa cao ngô, sữa bột và các muối MgSO4, K2HPO4 Tiến hành lên men tĩnh ở 450C với thời gian 96h Thực nghiệm khảo sát nồng độ cao ngô – sữa bột là 1,8% - 2,5% đạt 99,6g/l calci lactate, lượng glucose dư là 19,2g/l, đạt hiệu suất biến đổi là 72% [14], [15]
Trên thế giới đã tiến hành cố định tế bào vi khuẩn L acidophilus trên
calci – alginate và k – carrageenen bằng phương pháp bẫy, sử dụng chuối chín hoặc một số miếng cắt của các loại hoa quả làm vật liệu trung gian đã được ứng dụng làm tăng hiệu suất lên men [12], [40], [41]
1.2.3 Calci lactate
• Công thức cấu tạo
Hydrat calci 2 – hydroxyl propionate
Calci lactate là muối kết tinh của acid lactic với ion Ca2+, tồn tại trong tự nhiên dưới 2 dạng: pentahydrat (C6H10CaO6.5H2O) và trihydrat (C6H10CaO6.3H2O)
• Đặc điểm
Calci lactate tồn tại dạng kết tinh màu trắng, không mùi, khó tan trong nước lạnh (9g/100ml ở 250C), tan tốt trong nước nóng và không tan trong dung môi hữu cơ Ở 1200C dạng ngậm nước chuyển thành dạng khan do mất
đi 3 phân tử nước và nóng chảy ở 2000C
• Công dụng
Trong lĩnh vực y dược: calci lactate được sử dụng chủ yếu trong các trường hợp thiếu calci với các triệu chứng như tăng kích động cơ dẫn đến cơn tentany, co giật, rối loạn tâm thần, viêm da, chảy máu… Calci lactate thường
Trang 24được dùng một mình hay kết hợp với calci gluconat, calci carbonat dùng cho các trường hợp trẻ em còi xương chậm lớn, phụ nữ mang thai và phụ nữ đang cho con bú
Trong các lĩnh vực khác: calci lactate là tiền sản phẩm trong công nghệ sản xuất acid lactic Acid lactic và các dẫn chất của nó được dùng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như ngành công nghệ dược phẩm, công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp hóa học tổng hợp vecni, các chất dẻo và nhựa gia công bằng nhiệt
• Các phương thức tổng hợp
- Phương pháp hóa học: Bằng các phương pháp tổng hợp hữu cơ các nhà nghiên cứu đã tổng hợp được calci lactate từ các nguồn nguyên liệu khác nhau như trong sản xuất acid lactic [3], [6], [11]
Với phương pháp tổng hợp hóa học dù đi từ nguồn nguyên liệu nào cũng cho sản phẩm dạng racemic với tỷ lệ 2 đồng phân D – lactate : L – lactate = 1:1
- Phương pháp vi sinh vật: cơ sở của phương pháp vi sinh vật là tiến hành lên men trong điều kiện kị khí hoặc vi hiếu khí với các chủng vi sinh vật sinh acid lactic Trong quá trình chuyển hóa các vi sinh vật nhờ có hệ enzym lactat dehydrogenase chuyển pyruvate thành acid lactic Việc bổ sung các hợp chất calci trung tính vào môi trường lên men dần dần hoặc ngay từ ban đầu sẽ tạo ra muối calci lactate tan trong môi trường lên men Sau khoảng thời gian thích hợp tiến hành thu dịch lên men, xử lý dịch lên men, sau đó kết tinh và tinh chế để thu sản phẩm Như vậy thực chất của phương pháp lên men vi sinh vật tạo calci lactate là quá trình lên men tạo acid lactic
Phương pháp sinh tổng hợp calci lactate từ vi sinh vật cho thấy có nhiều
ưu điểm hơn phương pháp tổng hợp hóa học như: an toàn cho môi trường do các dư phẩm của quá trình ít độc hại, dễ dàng phân hủy, nhiệt độ sản xuất
Trang 25thấp, năng lượng sản xuất thấp, tận dụng được các sản phẩm thừa của các ngành thực phẩm do đó giá thành sản phẩm sẽ rẻ hơn nhiều, tạo được sản
phẩm tinh khiết hơn so với các phương pháp khác
Phương pháp liên kết với chất mang
Bản chất của phương pháp liên kết với chất mang là phương pháp liên kết giữa chất xúc tác sinh học với chất mang không tan trong nước thông qua liên kết đồng hóa trị, liên kết ion, hấp phụ vật lý hoặc liên kết sinh học đặc biệt Đặc tính của vật liệu làm chất mang là có độ cứng cơ học, ổn định về mặt sinh học và không gây độc với tế bào Chất mang thường dùng các polysaccharid không tan trong nước (cellulose, dextran…), các protein (gelatin, albumin…), các polymer nhân tạo (polystyrene, polyurethane…) và các vật liệu vô cơ (thủy tinh, ceramic…)
Phương pháp đồng hóa trị được sử dụng thường xuyên để bất động các enzyme, tuy nhiên ít dùng trong cố định tế bào vì tác nhân cần cho sự hình thành liên kết đồng hóa trị thường là các chất độc với tế bào [16]
Phương pháp tạo liên kết ngang
Phương pháp này không sử dụng chất mang để cố định tế bào mà các
tế bào được liên kết với nhau bằng các liên kết ngang tạo thành dạng pellet,
Trang 26tác nhân tạo liên kết ngang như glutaraldehyd, các diisocyanat…Các nhóm amino của glutaraldehyd tạo các liên kết ngang liên kết các tế bào với nhau, các tác nhân nhóm diisocyanat (toluen diisocyanat…) tạo liên kết ngang bằng cách liên kết nhóm urea với các nhóm amino Trong các chủng vi sinh vật thì
Phương pháp bẫy
Dựa vào tính chất vật liệu dùng để bẫy các tế bào vi khuẩn mà phương pháp này được phân chia thành bốn dạng, đó là: dạng lưới, dạng nang nhỏ (microcapsule), dạng liposome và dạng màng
Với dạng lưới các chất xúc tác sinh học được bẫy trong các khuôn gel của nhiều loại polymer khác nhau Ở dạng microcapsule tế bào được gói trong các màng polymer thẩm thấu nhân tạo tạo thành các nang nhỏ và dạng liposom các tế bào vi sinh vật được bẫy trong các màng chất lỏng tạo ra từ hợp chất amphiphtatic Với dạng màng chất xúc tác sinh học tách riêng khỏi môi trường bằng các màng siêu lọc, màng lọc hoặc bằng các sợi rỗng [16] Nguồn vật liệu tự nhiên là các polysaccharide như: alginate, k-carrageenane, agar… trong đó alginate được sử dụng phổ biến
1.3.3. Ứng dụng của phương pháp bất động tế bào
Sản xuất kháng sinh
Kháng sinh là nhóm thuốc rất cần thiết cho cuộc sống con người và hầu hết các kháng sinh thu được bằng con đường lên men vi sinh vật Theo các phương pháp truyền thống, các kháng sinh thường được sản xuất bằng phương pháp lên men mẻ trong các bình lên men Tuy nhiên, để nâng cao hiệu suất sản xuất kháng sinh người ta đã tìm cách chuyển từ lên men mẻ sang lên men liên tục Điều này khó có thể thực hiện được với các tế bào tự do, khi
đó bất động tế bào trở thành giải pháp hiệu quả nhất Nhiều kháng sinh đã được sản xuất trên quy mô công nghiệp từ các nguyên liệu ban đầu được tạo
Trang 27ra từ phương pháp bất động tế bào như: oxytetracylin, neomycin, cephalosporin, pencicillin…
Ví dụ: Để tổng hợp ampicilin và amoxicillin người ta tiến hành như sau:
cho penicillin G chảy qua các tế bào E coli hoặc B megatherium (có hoạt
tính enzyme penicillinamidase cao) cố định trên các chất mang khác nhau, các
vi sinh vật này sẽ thủy phân penicillin G tạo hợp chất 6 – APA và từ 6 – APA tổng hợp nên amoxicilin và ampicilin
Hình 1.3 : Các phương pháp bất động tế bào cơ bản [29]
Tổng hợp các acid hữu cơ
Bên cạnh phương pháp tổng hợp hóa học, thì hiện nay một số acid hữu
cơ được sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào như: acid citric, acid lactic, acid acetic…
Ví dụ, để sản xuất acid citric hiện nay chủ yếu sử dụng các tế bào
nhau như alginate, agarose, polyacryamid hay cho hấp phụ lên cột bọt polyurethane hoặc bẫy vào các sợi rỗng với chất mang sử dụng là cellulose xốp.… Tiến hành theo phương pháp lên men gián đoạn
Trang 28Để sản xuất acid lactic, hiện nay các nhà khoa học hay sủ dụng các
chủng Lactobacilus như: L helveticus [18], L casei [19], [27], L delbrueckii
k-carrageenane và tiến hành theo phương pháp lên men mẻ, lên men liên tục Như theo nghiên cứu của Gunduz để sản xuất acid lactic sử dụng chủng giống
trộn với chitosan, sau 72h lên men đạt sản lượng 125,6g/l, khi bất động trên alginate không có chitosan sản lượng đạt 116,2g/l Mật độ tế bào trong 1g hạt chứa chitosan là 2,32 × 108 tế bào, không chứa chitosan là 2,08 × 108 tế bào [36]
Lên men bất động tế bào còn được ứng dụng để sản xuất một số acid hữu cơ khác như: acid propionic, acid gluconic, acid fumaric, acid succinic
Sản xuất enzyme
Vi sinh vật là nguồn tốt nhất để sản xuất enzyme, đặc biệt phương pháp bất động tế bào là kỹ thuật thích hợp nhất để sản xuất các enzyme ngoại bào Trong số các enzyme thì enzyme thủy phân tinh bột là α-amylase và glucoamylase được quan tâm nghiên cứu nhiều Chất mang hay sử dụng là polyacrylamid, alginate, agar và các polymer khác Ví dụ, để sản xuất α–
amylase sử dụng tế bào B cereus được bất động vào chất mang alginate, sau
đó các hạt được nhồi vào thiết bị phản ứng tầng sôi để sản xuất liên tục amylase, với cách làm này hiệu suất phản ứng tăng gấp 24 lần so với lên men
α-mẻ bằng tế bào tự do Ngoài ra, có thể sản xuất α-amylase từ các tế bào biến đổi của E coli bất động trong k-carrageenane có bổ sung thêm glycin Ngoài
ra nhiều enzyme quan trọng khác cũng được nghiên cứu sản xuất bằng phương pháp bất động như: invertase, lipase, protease, cellulose, β- galactadase, xylanase, L - aminoacyllase [17]…
Trang 29Tổng hợp các alcol
Vi sinh vật được sử dụng phổ biến để sản xuất alcol bằng phương pháp
bất động tế bào là nấm men S cerevisiae và Z mobilis
Phương pháp sử dụng là phương pháp bẫy, các tế bào nấm men S
để không bị khuếch tán vào môi trường, trong khi đó glucose vẫn xâm nhập được vào trong gel để biến đổi thành ethanol và CO2 đi ra ngoài Ưu điểm của phương pháp này là: hiệu suất lên men đạt được cao hơn do duy trì được xúc tác tự nhiên của các enzyme trong tế bào, tế bào ít bị ảnh hưởng có hại của môi trường và quá trình lên men diễn ra nhanh với dung dịch đường ở nồng
độ cao [8], [9], [16]
1.4 Alginate
Nguồn cung cấp alginate chủ yếu là các loại tảo nâu, rong mơ như S
1.4.1 Cấu trúc của alginate [4]
Acid alginic là một heteropolyme saccharid mạch thẳng cấu tạo từ hai gốc uronic là acid α- L- guluronic (G) và acid β- D- mannuronic (M)
Hình 1.4: Cấu trúc của β – D – Mannuronic acid và α – L – Guluronic acid
Hai gốc uronic này có cấu tạo dạng ghế nhưng cấu hình khác nhau, acid mannuronic có cấu hình C41, còn acid guluronic có cấu hình C14
Trang 30H ình 1.5: Cấu dạng của β – D – Mannuronic acid và α – L – Guluronic acid
Hai monome gắn với nhau bằng liên kết 1 – 4 glycosid nhưng các liên kết này không phải ngẫu nhiêu mà thành block:
Block homopolyguluronic: GGGG
Block homopolymannuronic: MMMM
Block liên hợp: MGMG
Hình 1.6: Hình thể của block GGGG, MMMM, MGMG
Tùy theo nguồn gốc của alginate mà độ dài trung bình của mạch phân
tử, độ dài của mỗi block và trình tự kết hợp của chúng với nhau có sự khác nhau, điều này làm cho tính chất của alginate biến đổi trong một dải rộng [22]
1.4.2 Tính chất của alginate
Độ hòa tan
Các muối kim loại hóa trị I (Na+, K+…), muối amoni, muối của các amin phân tử lượng thấp của acid alginic tan được trong nước Các muối của
Trang 31acid alginic với các kim loại đa hóa trị (Ca2+, Ba2+,… trừ Mg2+) không tan được trong nước Các muối alginate hòa tan được trong các dung môi thân
nước như alcol, ceton…và dễ hòa tan hơn khi đun nóng
Độ nhớt
Natri alginate khi tan trong nước sẽ tạo dung dịch có độ nhớt trong khoảng từ 10 – 3500 cps, độ nhớt tỷ lệ thuận với khối lượng phân tử trung bình của alginate và nồng độ alginate Độ nhớt giảm khi tăng nhiệt độ và khi duy trì nhiệt độ 900C trong nhiều giờ alginate bị cắt mạch và giảm độ nhớt mạnh, nhưng khi hạ nhiệt độ đến điểm đông đặc sau đó rã băng sẽ không làm giảm độ nhớt của alginate Liên kết glucosid rất nhạy cảm với acid và kiềm, khi thủy phân alginate bị cắt mạch rất nhanh chóng Độ nhớt của dung dịch alginate không bị ảnh hưởng trong khoảng pH 5 – 11
Quá trình tạo gel của alginate
Khi phản ứng với các ion kim loại hóa trị II và III dung dịch alginate sẽ tạo gel, các gel được hình thành ở các mức nhiệt độ dưới 1000C, chúng không tan chảy khi đun nóng Do có cấu hình dặc biệt nên đoạn mạch GGGG tạo thành dạng gấp nếp như một cái vỉ trứng, khoảng không gian giữa các vỉ khi xếp lên nhau tương tự như chỗ đặt quả trứng Các ion Ca2+ khớp vào khoảng trống này liên kết với các nhóm chức carboxyl và các nguyên tử oxy để hình thành gel Calci alginate
Hình 1.7: Liên kết của ion Ca 2+ với alginate
Trang 32CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị máy móc
Chủng giống: Lactobacillus acidophilus ATCC 4356dạng đông khô
Nguyên liệu, hóa chất
Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất sử dụng
Hóa chất (xuất sứ)
Alginate (Trung Quốc) Sữa béo (Việt Nam)
Glucose (Trung Quốc) Natri clorid (Việt Nam)
Pepton (Trung Quốc) K2HPO4 (Trung Quốc)
Cao thịt (Trung Quốc) MgSO4.7H2O (Trung Quốc)
Cao nấm men (Trung Quốc) MnSO4.4H2O (Trung Quốc)
Amoni sulfat (Trung Quốc) CH3COONa (Trung Quốc)
CaCO3 (Việt Nam) Calci clorid (Việt Nam)
KI (Chi lê) Natri thiosulfate (TQ)
Máy móc thiết bị
Bảng 2.2: Máy móc và thiết bị sử dụng Thiết bị Hãng sản xuất
Trang 33Cân phân tích Satorius, Đức
Đĩa petri, buret, bình định mức, pipet, pipetman, ống nghiệm,
đầu côn, dụng cụ pha chế…
Bảng 2.4: Môi trường lên men Hóa chất Lượng dùng
Glucose 7g Sữa bột 2,6g Cao nấm men 1,3g
K2HPO4 0,25g (NH4)2SO4 0,2g MgSO4.7H2O 0,03g MnSO4.4 H2O 0,001g FeSO4.7 H2O 0,001g CaCO3 5g Nước máy vđ 100ml
(pH = 6,8 – 7)
Trang 34Các dung dịch sử dụng
Các dung dịch được pha theo hướng dẫn của Dược điển Việt Nam IV:
• Dung dịch NaCl 0,9%: cân 0,9g NaCl hòa tan vào bình nón 250ml đựng 100ml nước cất, đem hấp tiệt trùng ở 0,6 atm trong 20 phút
• Dung dịch CaCl2 2%: cân 2g Calci clorid hòa tan vào bình nón 250ml đựng 100ml nước cất, đem hấp tiệt trùng ở 0,6 atm trong 20 phút
• Dung dịch H2SO4 25%: đong 71ml dung dịch acid sulfuric 98%, nhỏ
từ từ vào cốc cỏ mỏ đựng 400ml nước cất, thêm vừa đủ 500ml
• Dung dịch HCl 3N: đong 25ml dung dịch HCl 36,5% nhỏ vào cốc có
mỏ dựng 50ml nước cất, thêm nước vừa đủ 100ml
• Dung dịch natri alginate 3%: cân 3g natri alginate, rắc từ từ vào bình nón 250ml chứa 100ml nước cất Để yên lặng 1 thời gian cho alginate trương
nở, đem hấp tiệt trùng ở 0,6 atm trong 20 phút
• Dung dịch natri alginate 6%: cân 6g natri alginate, rắc từ từ vào bình nón 250ml chứa 100ml nước cất Để yên lặng 1 thời gian cho alginate trương
nở, đem hấp tiệt trùng ở 0,6 atm trong 20 phút
• Dung dịch natri citrate 2%: cân 2g natri citrate hòa tan hoàn toàn trong bình nón 250ml chứa 100ml nước cất, đem hấp tiệt trùng ở 0,6 atm trong 20 phút
• Dung dịch natri thiosulfate 0,1N: cân chính xác 25,0g natri thiosulfate
và 0,2g natri carbonat hòa tan trong bình định mức1000ml chứa nước cất không có carbonic, thêm nước vừa đủ 1000ml
• Dung dịch Fehling A: cân 34,66g CuSO4.5H2O hòa tan trong nước cất
đã được acid hóa bằng 2 – 3 giọt acid sulfuric loãng vào bình định mức vừa
đủ 500ml
• Dung dịch Fehling B: cân 173g natri, kali tartrat và 50g NaOH hòa tan trong 400ml nước cất làm nguội và định mức đủ 500ml
Trang 352.2 Phương pháp nghiên cứu
Các phương pháp sử dụng
2.2.1 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào [6]
Ho ạt hoá chủng giống: Chủng giống được hoạt hóa từ giống L
nghiệm (mỗi ống 10ml), nút kín, đem hấp tiệt trùng ở 0,6 atm trong 20 phút,
để nguội Tiến hành cấy giống vào các ống nghiệm trên, nuôi cấy 24h – 48h trong tủ CO2 5% ở nhiệt độ 37 ± 10C
Nhân gi ống: Chuẩn bị môi trường MRS lỏng, cho vào mỗi bình nón
250ml khoảng 90ml môi trường MRS lỏng, nút kín, đem hấp tiệt trùng ở 0,6 atm trong 20 phút, để nguội Cấy mỗi ống giống đã hoạt hóa vào mỗi bình nón trên, đem ủ 24h trong tủ CO2 5% ở nhiệt độ 37 ± 10C
2.2.2 Phương pháp bất động tế bào vào các cơ chất [6]
Nếu sử dụng hỗn dịch tế bào (dịch nhân giống) tiến hành trộn 50ml dịch
tế bào nhân giống với 50ml dung dịch alginate 6% bằng máy khuấy từ ở nhiệt
Trang 362.2.3 Phương pháp pha loãng liên tục - tính số lượng vi khuẩn cố định trong hạt và bị rửa trôi trong quá trình lên men [6]
Ph ương pháp pha loãng liên tục: Chuẩn bị các ống nghiệm tương ứng
với nồng độ cần pha loãng Cho vào mỗi ống nghiệm 9ml nước cất, đem hấp tiệt trùng ở 0,6atm trong 20 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng Hút chính xác 1,0 ml dung dịch cần pha loãng cho vào ống nghiệm thứ nhất thu được 10ml dung dịch có nồng độ pha loãng 10-1, tiếp tục hút 1,0ml trong ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm thứ 2 thu được dung dịch có nồng độ pha loãng 10-2, tiếp tục pha loãng như vậy cho đến ống nghiệm thứ n thu được nồng độ pha loãng 10-n
V ới tế bào bất động trong gel Calci alginate: Cân chính xác 1,0g hạt cố
định cho vào bình nón có chứa 50ml dung dịch natri citrate 2% đã được hấp tiệt trùng, để nguội Hòa tan hạt bằng máy khuấy từ liên tục ở 370C với tốc độ
500 vòng/phút Hút chính xác 1,0ml dung dịch trên pha loãng tới nồng độ
10-8 Sau đó lấy 1,0ml dung dịch ở các nồng độ 10-6, 10-7, 10-8 cấy trên các đĩa petri có chứa môi trường MRS thạch đã hấp tiệt trùng, đem ủ trong tủ CO2
5%, sau 48 – 72h tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa
V ới dịch lên men: Hút chính xác 1,0ml dịch từ môi trường lên men đem
pha loãng liên tục đến nồng độ 10-6 Lấy chính xác 1,0ml dung dịch ở các nồng độ 10-6, 10-5, 10-4 cấy lên đĩa petri chứa môi trường MRS thạch đã hấp tiệt trùng, đem ủ trong tủ CO2 5%, sau 48 – 72h tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa
Tính toán kết quả: ở mỗi nồng độ ta thử trên 3 đĩa petri, sau thời gian nuôi cấy mỗi tế bào sẽ mọc lên một khuẩn lạc, đếm số lượng khuẩn lạc, lấy giá trị trung bình trên 3 đĩa Sau đó lấy giá trị trung bình nhân với nồng độ pha loãng ta được số lượng tế bào có trong 1g hạt gel alginate và lượng tế bào
bị rủa trôi sau một khoảng thời gian lên men
Trang 372.2.4 Phương pháp lên men và thu sản phẩm calci lactate [6]
Lên men: Chuẩn bị các bình nón 250ml chứa 100ml môi trường lên men đem hấp tiệt trùng ở 0,6atm trong 20 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng Cho
các hạt cố định chứa tế bào vi khuẩn L acidophilus vào các bình lên men,
đem ủ trong tủ ấm CO2 trong 96h, thỉnh thoảng lắc bình
Thu s ản phẩm calci lactat: Sau 96h lên men, dịch lên men thu được
đem đun cách thủy ở 800C trong vòng 20 phút để diệt tế bào vi khuẩn đồng thời làm đông vón protein, sau đó điều chỉnh pH về khoảng 9 - 10 bằng dung dịch Ca(OH)2 10% Đem lọc nóng để loại tủa protein và các thành phần không tan khác, chỉnh pH dịch thu được về 6 - 7 bằng dung dịch HCl 3N Đem cô cách thủy dung dịch còn 1/3 – 1/2 thể tích ban đầu, dùng 2% than hoạt để tẩy màu ở 800C trong vòng 20 phút Lọc hút chân không bằng phễu Buchner để loại than hoạt thu lấy dịch lọc, đem dịch lọc kết tinh lạnh ở 40C qua đêm Sản phẩm kết tinh được lọc qua phễu Buchner, rửa tinh thể bằng nước cất lạnh từ 2 –3 lần, rồi đem sản phẩm thô sấy ở 600C trong 24h, cân sản phẩm thu được
M = m x C x 50
Trang 38Sơ đồ thu sản phẩm calci lactate:
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình kết tinh calci lactate
Trang 392.2.5 Phương pháp tính hiệu suất quá trình tạo calci lactate thông qua phương pháp định lượng glucose
Lượng đường khởi điểm và lượng đường dư sau khi lên men được định lượng theo phương pháp Schoorl – Regenbogen
• Nguyên tắc
Thuốc thử Fehling A và thuốc thử Fehling B cho phức hợp màu xanh của Cu2+ khi bị nhóm chức aldehyde hay ceton khử thành Cu+ trong môi trường kiềm, lượng Cu2+ dư trong dung dịch sẽ tác dụng với KI dư trong môi trường acid và giải phóng I2, I2 được định lượng bằng Na2S2O3
Tiến hành làm song song mẫu trắng
Hiệu số ml dung dịch Na2S2O3 0,1N tiêu thụ trong mẫu trắng (V0) và mẫu thử (Vt) cho ta số ml dung dịch Na2S2O3 0,1N Tra bảng tính được lượng đường dư trong dịch lên men
• Cách tiến hành
Lấy chính xác 1,0ml dịch mẫu, thêm 0,5ml acid oxalic 0,5% Lọc qua phễu sứ xốp để loại tủa, rửa phễu bằng 5 – 10 ml nước cất, dịch lọc được chứa trong bình nón 250ml Hút chính xác vào bình nón 10ml Schoorl A và 10ml Schoorl B, thêm nước cất đủ 50ml rồi đun sôi trong lò vi sóng khoảng 2 phút Làm nguội về nhiệt độ phòng, sau đó thêm 3g KI và 10ml dung dịch acid sulfuric 25%, lắc tan hoàn toàn Định lượng I2 giải phóng bằng Na2S2O3 0,1N với chỉ thị hồ tinh bột
Làm song song định lượng một mẫu trắng bao gồm 30ml nước cất, 10ml thuốc thử Schoorl A và 10ml thuốc thử Schoorl B
Kết quả thu được tính theo công thức:
Thể tích Na2S2O3 cần thiết để định lượng mẫu trắng là Vt ml
Thể tích Na2S2O3 cần thiết để định lượng mẫu khởi điểm là Vkd ml Thể tích Na2S2O3 cần thiết để định lượng mẫu kết thúc là Vkt ml