Nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy vi khuẩn lactobacillus reuteri bằng phương pháp tối ưu bề mặt

Các phương pháp nghiên cứu truyền thống, độc lập các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật còn nhiều hạn chế khó tìm ra điều kiện tối ưu cho quá trình

HOÀNG VĂN TÀI

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VI KHUẨN

LACTOBACILLUS REUTERI BẰNG PHƯƠNG PHÁP

TỐI ƯU BỀ MẶT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa : CNSH & CNTP Lớp : 44 - CNSH Khóa học : 2012 – 2016

Thái Nguyên - 2016

HOÀNG VĂN TÀI

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VI KHUẨN

LACTOBACILLUS REUTERI BẰNG PHƯƠNG PHÁP

TỐI ƯU BỀ MẶT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa : CNSH & CNTP Lớp : 44 - CNSH Khóa học : 2012 – 2016 Giảng viên hướng dẫn: Th.S Bùi Tuấn Hà

Thái Nguyên - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của bản thân tôi, không sao chép của ai Nội dung khóa luận có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu tham khảo của khóa luận

Thái nguyên, ngày 19 tháng 5 năm 2016

Người viết cam đoan

Hoàng Văn Tài

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực tập tại phòng Công nghệ Lên men, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ Ban chủ nhiệm Khoa CNSH - CNTP, thầy cô hướng dẫn, bạn bè và gia đình

Trước hết, em xin chân thành cảm ơn Th.S Bùi Tuấn Hà, giảng viên Khoa CNSH - CNTP, đã tạo điều kiện, hướng dẫn và tận tình giúp đỡ em hoàn thành khoá luận này

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Dương Mạnh Cường, ThS Vi Đại Lâm giảng viên Khoa CNSH - CNTP, người đã hướng dẫn em các thao tác thực hành và chỉ ra cho em những sai lầm giúp em hoàn thành tốt khoá luận

Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa CNSH - CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành khoá luận này

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người

đã luôn ở bên cạnh động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khoá luận

Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không tránh khỏi những sai sót Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái nguyên, ngày 19 tháng 05 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Hoàng Văn Tài

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu 25

Bảng 3.2 Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 25

Bảng 3.3 Môi trường thạch MRS (de Man,Rogosa and Sharpes) (g/l) 26

Bảng 3.4 pH nuôi cấy 31

Bảng 3.5 Nhiệt độ nuôi cấy ( 0 C ) 32

Bảng 3.6 Tốc độ lắc ( vòng/phút) 32

Bảng 3.7 Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu 33

Bảng 3.8 Bảng thiết kế thí nghiệm tối ưu chất lượng sản phẩm 33

Bảng 4.1: Khả năng đồng hóa của vi khuẩn Lactobacillus reuteri trên các môi trường đường 36

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đên nuôi cấy vi khuẩn L reuteri 37

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của pH đến nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri 39

Bảng 4.4 : Ảnh hưởng của tốc độ lắc đên nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri 40

Bảng 4.5 Kết quả mật độ của vi khuẩn L reuteri trong sản phẩm 42

Bảng 4.6 Lack of Fit tests ( Kiểm tra tính phù hợp của mô hình) 43

Bảng 4.7 Tổng hợp phân tích mô hình ( model summary statistics) 43

Bảng 4.8 Kết quả phân tích ANOVA cho mô hình mật độ vi sinh vật trong quá trình nuôi cấy 44

Bảng 4.9 Các giá trị của biến độc lập để đạt được giá trị tối ưu của chỉ tiêu 45

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn L reuteri 7

Hình 2.2 Hình thái tế bào vi khuẩn L reuteri qua kính hiển vi 7

Hình 2.3 Bề mặt đáp ứng không có độ cong 19

Hình 2.4 Bề mặt đáp ứng có độ cong 19

Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc L reuteri 35

Hình 4.2 Hình thái tế bào vi khuẩn L reuteri 35

Hình 4.3 Biểu đồ mật độ tế bào vi khuẩn trên các môi trường đường 36

Hình 4.4 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật đố vi khuẩn L reuteri 38

Hình 4.5 Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến mật độ tế bào vi khuẩn L reuteri 39

Hình 4.6 Biểu đồ ảnh hưởng của tốc độ lắc đến mật độ vi khuẩn L reuteri 41

Hình 4.7 a và b : ảnh hưởng của nhiệt độ,pH và tốc độ lắc đến mật độ vi khuẩn Lactobaciluss reuteri 46

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

MRS : de Man, Rogosa and Sharpes

LAB : Lactic acid Bacteria

FAD : Flavin Adenin Dinuclecotit

EC : Ủy ban khoa học châu Âu

VSV : Vi sinh vật

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT v

MỤC LỤC vi

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.2 Mục đích nghiên cứu 3

1.3 Ý nghĩa của đề tài 3

1.3.1 Ý nghĩa trong khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn 3

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus reuteri 4

2.1.1 Lịch sử phát hiện 4

2.1.2 Đặc điểm phân loại và phân bố của vi khuẩn Lactobacillus reuteri 4

2.1.3 Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Lactobacillus reuteri 5

2.1.4 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Lactobacillus reuteri 7

2.1.5 Đặc điểm nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri 8

2.1.6 Tác đụng của Lactobacillus reuteri 10

2.2 Ứng dụng của vi khuẩn Lactobacillus reuteri - Probiotics 12

2.2.1 Lịch sử nghiên cứu Probiotics 12

2.2.2 Ứng dụng của probiotic 14

2.3 Khả năng tạo probiotic của vi khuẩn Lactobacillus reuteri 16

2.4 Phương pháp bề mặt chỉ tiêu 17

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 20

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 20

2.5.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 23

Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Đối tượng nghiên cứu 25

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành 25

3.3 Hóa chất và thiết bị sử dụng 25

3.3.1 Hóa chất 25

3.3.2 Thiết bị sử dụng 25

3.4 Môi trường sử dụng 26

3.5 Nội dung nghiên cứu 26

3.6 Phương pháp nghiên cứu 27

3.6.1 Thí nghiệm cho nội dung 1: Phương pháp nghên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn L.reuteri 27

3.6.2 Thí nghiệm cho nội dung 2: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus reuteri 31

3.6.3 Thí nghiệm cho nội dung 3: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus reuteri 32

3.6.4 Thí nghiệm cho nội dung 4: Phương pháp kiểm tra tốc độ lắc tới sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus reuteri 32

3.6.5 Thí nghiệm cho nội dung 5: Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri 32

3.7 Phương pháp xử lý số liệu 34

Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 Hình thái của vi khuẩn Lactobacillus reuteri 35

4.1.1 Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Lactobacillus reuteri 35

4.1.2 Hình thái tế bào vi khuẩn L reuteri 35

4 2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến nuôi cấy vi khuẩn L reuteri 37

4.3 Ảnh hưởng của pH đến nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri 38

4.4 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đên nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri 40

4.5 Kết quả tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri bằng phương pháp bề mặt chỉ tiêu 41

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Lactobacillus reuteri thuộc chi Lactobacillus là một vi khuẩn Gram

dương được tìm thấy chủ yếu trong ruột của động vật có vú và chim

L reuteri chứa Probiotics BioGaia Nó là một trong những chủng vi

khuẩn sản sinh ra probiotic tốt nhất, có khả năng sinh kháng sinh rất

mạnh, có thể kháng lại hoặc ức chế các loại sinh vật có hại trong hệ tiêu

hóa Một số chủng L reuteri được sử dụng như chế phẩm sinh học để tăng

lợi khuẩn, bảo vệ sức khỏe cho con người và cho vật nuôi

Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi tiêu thụ vào cơ thể một

lượng đầy đủ sẽ có lợi về mặt sức khỏe cho người sử dụng Probiotic có ích

hỗ trợ khôi phục lại sự cân bằng trong đường ruột Chính vì vậy, các chế

phẩm sinh học chứa lợi khuẩn probiotic có vai trò quan trọng đối với sức

khỏe Nó có thể duy trì trạng thái cân bằng vi khuẩn đường ruột, tăng cường

sức khỏe đường ruột, nhưng cũng có thể tăng cường hệ thống miễn dịch

Probiotic còn có khả năng cạnh tranh các chất dinh dưỡng cới các vi sinh vật

gây bệnh Sử dụng probiotic giúp tăng cường đáp ứng miễn dịch, nhất là

miễn dịch tự nhiên, làm tăng dung nạp của cơ thể với lactose, giúp trẻ tránh

khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu những loại thức ăn có chứa nhiều

lactose Ngoài ra tác dụng của probiotic là cung cấp các chất quan trọng cho

cơ thể như folic acid, niacin, riboflavin, vitamin B6 và B12

Ngày nay, nền kinh tế ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ

khoa học đã làm cho cuộc sống con người có nhiều thay đổi lớn Càng ngày

đời sống vật chất càng cao, do đó nhu cầu về chất lượng sản phẩm cũng tăng

cao đòi hỏi những nhà sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm của mình

để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng Với mục đích bảo vệ sức khỏe cho

người sử dụng sản phẩm, bảo vệ môi trường người ta hạn chế hoặc cấm sử dụng một số loại thuốc, đặc biệt là thuốc kháng sinh và thay thế thuốc kháng sinh bằng các chế phẩm sinh học Chế phẩm sinh học là một dạng thức ăn bổ sung vi sinh vật sống, tác động có lợi đến động vật thông qua việc cải tiến cân bằng vi sinh vật đường ruột Vì vậy việc nuôi cấy vi sinh vật để thu sinh khối

là rất quan trọng trong việc sản xuất các loại chế phẩm sinh học cũng như vi

khuẩn L reuteri

Các phương pháp nghiên cứu truyền thống, độc lập các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật còn nhiều hạn chế khó tìm ra điều kiện tối ưu cho quá trình nuôi cấy, rất tốn thời gian cũng như chi phí để nuôi cấy Ngày nay, thường sử dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu là quá trình đi tìm giá trị của các biến độc lập để đạt kết quả tối ưu của các tiêu chí cần tối ưu, kết hợp với các phần mềm máy tính để đạt hiệu quả cao trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật Trong thiết kế, xây dựng, sản xuất…các công nghệ và quản lý được tiến hành ở các bước khác nhau của quá trình nhằm giảm tối đa chi phí đầu vào và tối đa hoá sản phẩm và lợi ích đầu

ra Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri bằng phương pháp tối ưu

bề mặt ’’

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu của đề tài

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn Lactobacillus reuteri

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của vi khuẩn

- Tối ưu điều kiện nuôi cấy vi khuẩn L reuteri bằng phương pháp bề

mặt chỉ tiêu

1.2.2 Mục đích nghiên cứu

- Ngiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri

bằng phương pháp tối ưu bề mặt

1.3 Ý nghĩa của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa trong khoa học

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa kiến thức đã học vào nghiên cứu khoa học

- Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học

1.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn

- Tìm ra điều kiện tối ưu để nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri

bằng phương pháp tối ưu bề mặt

- Tạo tiền đề cho việc sản xuất các sản phẩm từ vi khuẩn Lactobacillus reuteri

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus reuteri

2.1.1 Lịch sử phát hiện

Lactobacillus reuteri được phát hiện lần đầu tiên trong ruột của lợn,

cừu, gà và các loại gặm nhấm.Vi sinh vật học người Đức Gerhard Reuter lần

đầu tiên phân lập L reuteri từ L fermentum trong các mẫu ruột và phân của

người trong những năm 1960 Walter Dobrogosz, Ivan Casas, và các đồng nghiệp của họ đã tiến hành nghiên cứu bổ sung vào đầu những năm 1980 Họ phát hiện ra rằng L reuteri có khả năng lên men glycerol vì vậy dẫn đến việc tìm ra một chất kháng sinh phổ rộng Dobrogosz và các đồng nghiệp của ông

đặt tên là “reuterin” L reuteri được tìm thấy tồn tại trong một số thực phẩm,

bao gồm cả các sản phẩm thịt và sữa

Năm 2008, L reuteri được xác đinh là có khả năng sản xuất reuterin ở

đường tiêu hóa, nó rất hiệu quả trong việc làm giảm sự tang trưởng của vi khuẩn E coli có hại Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, một số

chủng L reuteri được sử dụng như chế phẩm sinh học

2.1.2 Đặc điểm phân loại và phân bố của vi khuẩn Lactobacillus reuteri

* Đặc điểm phân loại

Bộ : Lactobacillales

Họ : Lactobacillaceae

Chi : Lactobacillus

Loài : L reuteri

* Đặc điểm phân bố: Vi khuẩn Lactobacillus reuteri có mặt trong các

sản phẩm bổ sung probiotics đường ruột, ở tự nhiên chúng phân bố chủ yếu trong hệ tiêu hóa mà chủ yếu là đường ruột và trong một số thực phẩm bao

gồm cả thịt và sữa https://en.wikipedia.org/wiki/Lactobacillus_reuteri

2.1.3 Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Lactobacillus reuteri

Lactobacillus reuteri là vi khuẩn Gram dương (+), không tạo bào tử,

hầu hết không di động, thu nhận năng lượng nhờ phân giải hydratcacbon và sinh axit lactic dưới dạng D (-), L (+) hoặc DL (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2009)[2]

Có khả năng lên men hiếu khí và kỵ khí, thường có mặt ở ruột non và giúp giữ cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, được xem như là một chất kháng sinh tự nhiên chống các vi sinh vật có hại

2.1.3.1 Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Vi khuẩn L reuteri có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các

monosaccarit (glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin) Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất

cho quá trình lên men tổng hợp các axit hữu cơ

2.1.3.2 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Phần lớn vi khuẩn L reuteri không tự tổng hợp được các hợp chất

chứa nitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử

dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Các nguồn nitơ vi khuẩn L

reuteri có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân

casein từ sữa, pepton

2.1.3.3 Nhu cầu về vitamin

Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của

tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loài vi

khuẩn L reuteri không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ

sung vào môi trường các loại vitamin

Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây,

ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men…

2.1.3.4 Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác

Ngoài các axit amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu

cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các axit hữu cơ Một số axit hữu

cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như axit xitric, axit oleic

Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của axit oleic, axit axetic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các

chủng vi khuẩn lactic

2.1.3.5 Nhu cầu các muối vô cơ khác

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn L reuteri

rất cần các muối vô cơ

Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magiê đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa

quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào

2.1.3.6 Nhu cầu dinh dưỡng oxi

Vi khuẩn L reuteri vừa có khả năng sống được trong môi trường có

oxy và vừa sống được trong môi trường không có oxy

+ Trong điều kiện hiếu khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn

so với điều kiện kỵ khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP

+ Trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn

2.1.4 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Lactobacillus reuteri

2.1.4.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Hình 2.1 Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn L reuteri

Sau khi phân lập và tuyển chọn giống thuần trên môi trường MRS –

agar, L reuteri có khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, nhô cao, đường kính khuẩn

lạc 0.9 – 1.2 mm rìa khuẩn lạc trơn và bề mặt khuẩn lạc khô (Huỳnh Ngọc Thạch và cs, 2002)[11]

2.1.4.2 Hình thái tế bào

Hình 2.2 Hình thái tế bào vi khuẩn L reuteri qua kính hiển vi

L reuteri là trực khuẩn, hai đầu tròn, Gram dương, kích thước 0.5 –

0.8 x 1.5 – 3 , đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn nằm giữa tế bào (Huỳnh Ngọc Thạch và cs, 2002)[11]

2.1.5 Đặc điểm nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri

- Môi trường nuôi cấy: khó nuôi cấy, cần những hợp chất phức tạp để phát triển như: pepton, cao thịt, cao nấm men Môi trường nuôi cấy thích hợp: MRS

- Các yếu tố ảnh hưởng đến vi khuẩn L reuteri

* Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ của môi trường cũng có ảnh hưởng rất lớn đối với vi sinh vật Trên thực tế, do vi sinh vật thường là các sinh vật đơn bào cho nên chúng rất mẫn cảm với sự biến hóa của nhiết độ, và thường bị biến hóa cùng với sự biến hóa về nhiết độ của môi trường xung quanh Trong phạm vi nhiệt độ thấp, khi nhiệt độ tăng lên sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật, vì phản ứng xúc tác của enzym cũng giống như các phản ứng hóa học nói chung, khi nhiết

độ tăng lên 10 o

C tốc độ phản ứng tăng gấp đôi Vì các phản ứng trong tế bào đều tăng cho nên toàn bộ hoạt động trao đổi chất sẽ tăng lên khi nhiệt độ cao hơn, và sinh vật sẽ sinh trưởng nhanh hơn Lúc nhiệt độ tăng đến một mức độ nhất định thì nhiệt độ càng tăng tốc độ sinh trưởng càng giảm Vi khuẩn

L reuteri trong cơ thể người phát triển tốt nhất ở 36 - 38 oC Nhiết độ tối

ưu cho sự phát triển của L reuteri từ 30 – 40 o

C Theo nghiên cứu của Toqeer Ahmed, Rashida và Najma Ayub nhiệt độ phát triển tốt nhất của

Khi pH môi trường thay đổi tương đối lớn, vi sinh vật vẫn có phương pháp thích nghi ở một giới hạn cho phép Phần lớn pH nội bào cảu vi sinh vật vẫn giữ trung tính, nguyên nhân là do tính thấm H+ qua màng sinh chất tương đối thấp Vi sinh vật trung tính thông qua hệ thống vận chuyển đã sử dụng K+thay cho H+ Vi sinh vật ưu kiềm cực đoan dùng Na+ thay cho H+ từ môi trường bên ngoài Ngoài ra hệ thống chất đệm nội bào cũng có tác dụng ổn định pH nội bào Trong quá trình trao đổi chất cảu vi sinh vật sinh ra các chất

có tính axit hoặc base gúp trung hòa pH môi trường Chẳng hạn, Thiobacillus

có thể oxy hóa các hợp chất chứa lưu huỳnh tạo acid sulfuric, một số vi khuẩn phân giải acid amin tạo NH3 làm kiềm hóa môi trường

Vi khuẩn L reuteri có thể phát triển được trong môi trường acid,

khoảng pH của chúng có thể từ 4.5 – 8.5, pH tối ưu là 6.5 Khi pH thấp hơn 4

sẽ ức chế các vi khuẩn tạp nhiễm, tuy nhiên nó cũng sẽ ức chế sự phát triển vi

khuẩn L reuteri Do đó cần phải theo dõi suốt quá trình nuôi cấy L reuteri

qua kết quả khảo sát pH = 6 là tối ưu nhất cho sự sinh trưởng và phát triển

* Ảnh hưởng của oxy

Oxy là chất có vai trò quan trọng trong sinh trưởng của vi sinh vật, tuy vậy oxy có thể rất cần cho nhóm vi sinh vật này nhưng lại gây độc với nhóm sinh vật khác Căn cứ vào sự thích ứng với oxy của vi sinh vật, người ta chia

vi sinh vật thàng 3 nhóm:

+ Vi sinh vật hiếu khí: có thể sinh trưởng trong khí quyển chứa 21% O2 Chúng cần nhiều năng lượng hơn từ sự oxy hóa chất dinh dưỡng so với các nhóm vi sinh vật khác, do đó khi oxy bị hạn chế thì sinh trưởng của nhóm này bị chậm lại Vi sinh vật hiếu khí sinh trưởng tốt ở nồng độ oxy 1- 15% Với nhóm vi sinh vật này cần cung cấp thường xuyên và đầy đủ O2, các bình chứa môi trường được lắc thường xuyên trong quá trình nuôi để cung cấp thêm oxi cho vi sinh vật, nếu nuôi cấy trong môi trường có khối lượng lớn phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kỳ

+ Vi sinh vật kỵ khí: không thể sinh trưởng trong môi trường có oxy,

thậm chí một số vi sinh vật bị chết khi tiếp xúc với oxy Hạn chế sự tiếp xúc

với oxi bằng cách; Đổ lên bềmặt môi trường parafin, dầu vazơlin; Cấy trích sâu vào môi trường đặc Nuôi cấy trong bình hút chân không Nuôi trong ống nghiệm đặc biệt sau khi rút hết không khí và hàn kín lại Đun sôi môi trường một thời gian để loại hết O2 Để nguội 45 o

C Dùng ống hút cấy vi sinh vật vào đáy ống nghiệm Làm nguội thật nhanh rồi đổ vazơlin lên bềmặt để hạn chế sự tiếp xúc với O2

+ Vi sinh vật tùy tiện: có thể sinh trưởng trong môi trường có đủ hoặc thiếu oxy, có hoặc không có oxy Trong điều kiện không có oxy chúng có năng lượng bằng sự lên men

Vi khuẩn Lactocillus reuteri thuộc nhóm vi khuẩn lactic, chúng hô hấp

tùy tiện, không có hệ enzyme hô hấp xitocrom cũng như hệ catalaza Tuy vậy,

chúng có khả năng oxy hóa rất nhiều hệ FAD (Flavin Adenin Dinuclecotit)

L reuteri phát triển tốt ở 37 oC trong điều kiện yếm khí

* Ảnh hưởng của nồng độ đường

Đường là nguồn cacbon chủ yếu cho vi khuẩn sinh tổng hợp, nồng độ đường càng cao thì axit sinh ra càng nhiều Tuy nhiên, nồng độ đường quá cao làm cho áp suất thẩm thấu môi trường cao dẫn đến hiện tượng co nguyên sinh ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào vi khuẩn Glucose là nguồn

cacbon ưa thích nhất của L reuteri, tuy nhiên nó vẫn có khả năng sử dụng

đường maltose, lactose, galactose, sucrose…

2.1.6 Tác đụng của Lactobacillus reuteri

- Lactobacillus reuteri được tìm thấy trong sữa người, nó đã được tìm

thấy trong sữa của các bà mẹ đang cho con bú Người ta thấy rằng nếu bổ

sung L reuteri cho các bà mẹ đang mang thai và cho con cái của họ trong

năm đầu tiên thì con cái của họ sẽ giảm thiểu các bệnh liên quan đến đường

ruột L reuteri cũng đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc làm giảm

cả viêm nứu và mảng bám răng ở bệnh nhân viêm lợi nặng, cho thấy cải thiện sức khỏe răng miệng ( Gabriela Sinkiewicz, 2010)[17]

- Việc sử dụng chế phẩm sinh học để phòng ngừa ung thư trực tràng

đang được sử dụng ngày càng rộng rãi Các chủng Lactobacillus reuteri với

hoạt động tăng sinh chống lại các tế bào ung thư đại trực tràng Các nhà khoa học đã nghiên cứu tác dụng của việc tăng sinh và hiệu quả của các chuỗi axit

béo chuỗi ngắn được tiết ra bởi các chủng L reuteri Năm chủng L reuteri đã

được sàng lọc và tiết ra axit béo chuỗi ngắn, tăng sinh trên Caco-2 colon

chống lại tế bào ung thư ruột kết (Kahouli và cs, 2015)[18]

- Reuterin là một hợp chất kháng sinh được tạo ra trong quá trình lên

men kỵ khí glycerol Reuterin được sản xuất bởi một số chủng Lactobacillus

reuteri, với hoạt tính kháng khuẩn, kháng nhiều loại mầm bệnh, bao gồm cả

nấm men, nấm mốc, vi khuẩn Gram dương ví dụ, Bacillus cereus,

Staphilococcus aureus, Listeria monocytogenes và vi khuẩn gram âm ví dụ, Escherichia coli, Yersinia enterocolitica và Pseudomonas fluorescens trong

môi trường (A Mohamadi Sani và cs,2005)[14]

- Việc bổ sung L.reuteri đã giúp cải thiện đáng kể các triệu chứng đau

bụng co thắt ở những trẻ được nuôi bằng sữa mẹ, so với phương pháp điều trị chuẩn bằng simethicone, trong vòng 7 ngày điều trị Tỷ lệ đáp ứng điều trị với

L.reuteri là 95%, trong khi chỉ có 7% trẻ đáp ứng với simethicone Lợi ích

của việc bổ sung probiotic trong nghiên cứu này có thể có liên quan đến việc cân bằng lại sự thay đổi của lactobacilli đường ruột ở trẻ sơ sinh bị đau bụng

co thắt Các nghiên cứu gần đây cho thấy, việc điều chỉnh lại hệ vi sinh vật

bằng probiotics, bao gồm cả L.reuteri, có thể chuyển hệ sinh thái đường ruột

từ hệ vi khuẩn có hại tiềm tàng sang hệ vi khuẩn có lợi là chủ yếu cho vật

chủ, giảm nguy cơ nhiễm trùng đường tiêu hóa và các bệnh dị ứng Việc bổ

sung probiotic trong giai đoạn đầu đời nhằm mục đích cung cấp sự kích thích

hệ miễn dịch còn non nớt của trẻ một cách an toàn và ức chế cơn đau nội tạng, điều chỉnh viêm liên quan đến phản ứng quá mẫn cảm nội tạng bằng cách tác động trực tiếp đến các dây thần kinh ruột (Francesco savino và cs, 2006)[19]

2.2 Ứng dụng của vi khuẩn Lactobacillus reuteri - Probiotics

2.2.1 Lịch sử nghiên cứu Probiotics

Khái niệm probiotic đầu tiên được mô tả như là hệ VSV trong thức ăn

bổ sung cho người và vật nuôi

Năm 1925, Beach là người đầu tiên có những nghiên cứu thực nghiệm

về thức ăn có chứa các VK "Lactobacillus acidophiỉus"

Năm 1965, thuật ngữ probiotic được đưa ra đầu tiên bởi Lilly và Stillwell, nhằm mô tả những VSV có khả năng kích thích sinh trưởng của một

số vật nuôi

Năm 1968, King đã nghiên cứu thành công trong việc kích thích sự

tăng trưởng của heo bằng thức ăn có bổ sung Lactobacillus acidophilus

Năm 1989, Fuller (Anh), cùng nhiều nhà khoa học khác như Lee (Singapore), Nomoto (Nhật), Salminen (Phần lan), Gorbach (Anh) (1999) đều

thống nhất trong định nghĩa : "Probiotic là chế phẩm sinh học hay là thức ăn

bổ sung có chứa VSV sống có ảnh hưởng tốt cho sức khỏe của vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh đường ruột"

2.2.2.1 Tác động kháng khuẩn

Giảm số lượng vi khuẩn để ngăn chặn các mầm bệnh cụ thể là: Tiết ra các chất kháng khuẩn: Vi khuẩn Probiotic tạo ra các chất đa dạng có thể ức chế cả khuẩn Gram (+) và Gram (-), gồm có các acid hữu cơ, hydrogen peroxide và chất diệt khuẩn Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những sinh vật mang mầm bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến sự

trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH khoang ruột thông qua sự tạo ra các acid beo chuỗi ngắn

dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, và butyrate, nhất là acid lactic Cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính vào đường ruột và cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh

2.2.2.2 Tác động trên mô biểu bì ruột

+ Đẩy mạnh sự liên kết chặt giữa những tế bào biểu mô

+ Giảm việc kích thích bài tiết và những hậu quả do bị viêm của sự lây nhiễm vi khuẩn

+ Đẩy mạnh sự tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy

+ Cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy và táo bón

2.2.2.4 Tác động đến vi khuẩn đường ruột

Điều chỉnh thành phần cấu tạo của vi khuẩn đường ruột: khi tập trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ sinh thái đường ruột

Chế phẩm probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường ruột Probiotic có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme của sinh vật đường ruột Đồng thời tăng sự dung nạp đường lactose: giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu những loại thức ăn có chứa nhiều đường lactose và làm tăng vi khuẩn có lợi và giảm vi khuẩn gây hại

Vi khuẩn probiotic như Lactobacillus reuteri điều hòa hoạt động trao

đổi chất của sinh vật đường ruột Probiotic có thể làm giảm pH của bộ phận

tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme của sinh vật đường ruột Đồng thời tăng sự dung nạp đường lactose: giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu những loại thức ăn có chứa nhiều lactose và làm tăng vi khuẩn có lợi và giảm vi khuẩn gây hại

Nghiên cứu cho thấy sử dụng Lactobacillus acidophilus và L reuteri sẽ

làm giảm ½ số trẻ bị tiêu chảy do Rotavirus và giúp tăng cường hệ thống

miễn dịch IgA của cơ thể Khi sử dụng Lactobacillus rhamnosus dưới dạng

sữa lên men hoặc dạng đông khô cho trẻ em thì khoảng 95% trẻ em sẽ giảm thời gian tiêu chảy ngay sau ngày đầu tiên và ít nôn mửa, không tiêu ra máu ngay sau ngày thứ hai chữa trị (J Walter và cs,1998)[28]

2.2.2 Ứng dụng của probiotic

2.2.2.1 Trong nông nghiệp

Việc sử dụng probiotic ở động vật và nuôi trồng thủy sản được đánh giá cao Probiotic giúp cải thiện sức khỏe của động vật, giúp tăng trọng, giảm tỉ lệ chết non và ngăn chặn tác nhân gây bệnh Sự lạm dụng kháng sinh trong ngành chăn nuôi và khả năng đề kháng kháng sinh đã làm tăng mối quan tâm đến probiotics

Việc sử dụng probiotics trong thực phẩm được để xuất rằng có thể làm giảm nguy cơ gây bệnh từ thực phẩm sang người Ủy ban khoa học châu Âu (EC) về dinh dưỡng động vật (2003) đã khuyến cáo rằng: những giống vi khuẩn trước đây có thể chấp nhận như một probiotic động vật thì bản chất của gen đề kháng kháng sinh phải được xác định và những chủng mang gen đề kháng kháng sinh được sử dụng trong y dược thì không nên bổ sung vào thức

ăn chăn nuôi trừ khi vi khuẩn đó có đột biến trên gen đề kháng kháng sinh Chính sách này sẽ ngăn chặn được việc sử dụng các vi khuẩn có khả năng truyền gen kháng kháng sinh sang các vi khuẩn khác làm probiotic bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Điều này cũng hạn chế ứng dụng của probiotic cho người

Thực tế thì probiotic cần thiết được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi trong nông nghiệp và nuôi trồng thủy sản và an toàn đối với con người Sự bám dính lên niêm mạc đường tiêu hóa của vi khuẩn probiotic được xem là cơ chế quan trọng để ngăn các tác nhân gây bệnh

+ Giảm mùi hôi chuồng nuôi

+ Giảm bệnh đường ruột gây ra bởi các sinh vật như E.coli, Salmonella

và Clostridium Đặc biệt có thể tiêu diệt mầm bệnh vi khuẩn sống ở ruột gia

cầm, do đó giúp loại bỏ mối đe dọa sự ngộ độc thực phẩm vi khuẩn từ chuỗi thức ăn

+ Phòng bệnh sưng phù đầu cho lợn

Về gia cầm:

Những nghiên cứu trên gia cầm tại tại các trường đại học của Maryland

và phía Bắc bang Carolina, sử dụng một sản phẩm có tên là Primalac cho thấy

là probiotic định cư ở ruột với những vi khuẩn có lợi và loại trừ bệnh gây ra bởi các sinh vật như E.coli, Salmonella và Clostridium ở những vị trí lông

nhung của ruột non, nơi mà vi khuẩn có hại sẽ phá hủy lông nhung

Probiotic gia tăng sự kháng bệnh bằng cách tăng độ cao của lông nhung và tăng độ sâu của các khe nằm giữa lông nhung, theo cách đó sẽ gia tăng được diện tích bề mặt hấp thu chất dinh dưỡng Vì vậy sẽ gia tăng hiệu quả hấp thụ thức ăn Nghiên cứu cũng cho thấy Primalac giúp động vật

chống lại sự lây nhiễm trùng cầu (Eimeria acervulina), chúng phá hủy

những đàn gà giống

Những nhà khoa học từ viện nghiên cứu thực phẩm ở Norwich, nước Anh báo cáo là những probiotic đặc biệt có thể tiêu diệt mầm bệnh vi khuẩn sống ở ruột gia cầm, do đó giúp loại bỏ mối đe dọa sự ngộ độc thực phẩm vi

khuẩn từ chuỗi thức ăn.Sử dụng chủng Lactic Pediococus pentosaceus HNO2

để sản xuất chế phẩm bảo quản cá

2.2.2.2 Trong thực phẩm và y học

Sử dụng vi khuẩn để muối chua rau quả, ủ chua thức ăn gia súc (làm chín sinh học các loại quả): Tạo được sinh khối vi khuẩn có ích, át cả sinh vật gây thối Gây chua, tạo hương vị thơm ngon cho sản phẩm Chuyển rau quả

về dạng "chín sinh học" do đó mà hiệu suất tiêu hóa tăng Một số chủng dùng

để sản xuất sữa chua đặc: Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus reuteri,Strepticoccus faecalist… Một số chủng được thêm vào sữa

bột: Lactobacillus,Bifidobacterium… Tại những nước phát triển, các nhà sản

xuất, chế biến đã ứng dụng bổ sung Probiotics vào nhiều loại thực phẩm như sữa chua ăn, phomat, kem

Chữa bệnh đường ruột: Pháp đã sản xuất và đưa ra thị trường từ hàng chục năm nay một sản phẩm mang tên Biolactyl chuyên trị tiêu chảy bằng nhiều khuẩn lactic https://vi.wikipedia.org/wiki/Probiotic

2.3 Khả năng tạo probiotic của vi khuẩn Lactobacillus reuteri

Lactobacillus reuteri là một loài trong chi Lactobacillus phân hóa

đường thành axít lactic L reuteri là một trực khuẩn thường cư trú ở đường

tiêu hóa của con người, có khả năng sinh ra acid lactic, acid hoá đường ruột

và ngăn ngừa được sự phát triển của các vi khuẩn có hại do đó L reuteri đã

được dùng trong nhiều năm để điều trị tiêu chảy

Con người đã khai thác quá trình lên men của vi khuẩn lactobacillus trong nhiều thế kỷ qua và trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống Một số loài vi khuẩn được sử dụng như probiotic (Probiotic là chế phẩm sinh học hay là

thức ăn bổ sung có chứa VSV sống có ảnh hưởng tốt cho sức khỏe của vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh đường ruột) Vi khuẩn được sử dụng nhiều nhất để tạo probiotic là vi khuẩn lactic(LAB) Một chi trong

nhóm LAB là lactobacillus, một loài lactobacillus là lactobacillus reuteri đã

được nghiên cứu rộng rãi và có tác dụng sinh probiotic ( Gabriela Sinkiewicz, 2010)[17]

2.4 Phương pháp bề mặt chỉ tiêu

Phương pháp bề mặt chỉ tiêu là tập hợp các quy trình toán học và thống

kê bao gồm thiết kế thí nghiệm, lựa chọn (xây dựng) mô hình, đánh giá mô hình và tối ưu hoá Phương pháp này thường được sử dụng để cải thiện và tối

ưu hoá các quá trình sản xuất Phương pháp bề mặt chỉ tiêu thường được áp dụng theo một quy trình: Ở giai đoạn đầu khi chúng chưa định vị chính xác vùng tối ưu, các mô hình đơn như mô hình bậc nhất sẽ được áp dụng nhiều lần để đưa các giá trị về gần khu vực tối ưu Khi vùng tối ưu được bắt đầu được xác định, các mô hình phức tạp (tỉ mỉ) hơn như mô hình bậc 2 sẽ được

áp dụng để xác định cụ thể điểm tối ưu Lý thuyết tối ưu bao gồm các phương pháp số học để tìm và xác định lựa chọn tốt nhất trong bộ các kết quả được tìm ra mà không phải đánh giá toàn bộ các lựa chọn Trong phương pháp bề mặt chỉ tiêu, các mô hình toán học được xây dựng dựa trên các phân tích hồi quy các kết quả thí nghiệm Một mô hình phù hợp sẽ cơ bản khái quát được các thí nghiệm với các nhân tố của thí nghiệm ở trong vùng thiết lập trước

Do đó, thông qua quá trình tối ưu hoá, mô hình tối ưu cùng với các thí nghiệm

sẽ giúp ta tìm ra các kết quả tốt nhất Bước cuối cùng của quá trình tối ưu sẽ

là xác nhận lại kết quả tối ưu bằng cách thực hiện lại các thí nghiệm ở điều kiện tối ưu vừa tìm được ( Nguyễn Hữu Nghị, 2011)[8]

Các phương pháp bề mặt chỉ tiêu (Response surface methods) được dùng để khảo sát mối quan hệ giữa một hay nhiều biến đáp ứng và một tập

hợp các biến thực nghiệm định lượng hay các yếu tố Các phương pháp này thường được áp dụng sau khi đã xác định một số yếu tố quan trọng có thể kiểm soát được và muốn tìm các giá trị của các yếu tố để có đáp ứng tối ưu (Andre I Khuri´ and cs, 2010)[16]

Phương pháp RSM sử dụng các phần mềm để hỗ trợ cho các phương pháp bề mặt việc tìm ra điều kiện tối ưu trong các phản ứng Chức năng của

nó để tạo ra các thiết kế trung tâm và Box-Behnken Đối với phân tích dữ liệu thu được, các phần mềm cung cấp cho việc ước lượng bề mặt đáp ứng, kiểm tra các phản ứng cho phù hợp, hiển thị toàn bộ các đường phản ứng và làm phân tích các phản ứng (Russell V Lenth, 2009)[29]

- Các bước bố trí cho một thí nghiệm bề mặt đáp ứng Tùy theo thí nghiệm, có thể thực hiện một số bước với một thứ tự khác

1 Chọn mẫu bề mặt đáp ứng cho thí nghiệm

2 Chọn Create Response Surface Design để thực hiện mẫu tổng hợp trung tâm (central composite design ) hay mẫu Box-Behnken ( Box-Behnken design)

Chọn Define Custom Response Surface Design để tạo một mẫu từ số liệu đã có ở bảng tính ( worksheet)

3 Chọn Modify Design để đặt tên lại các yếu tố, thay đổi các mức độ của yếu tố, lập lại mẫu, phân phối ngẩu nhiên mẫu

4 Chọn Display Design để thay đổi thứ tự các runs

5 Thực hiện thí nghiệm và thu thập số liệu đáp ứng Sau đó nhập số liệu vào bảng tính của Minitab

6 Chọn Analyze Response Surface Design để làm phù hợp mô hình với số liệu thực nghiệm

7 Chọn Contour/Surface Plots để vẽ các bề mặt đáp ứng Có thể trình bày các biểu đồ chu tuyến và bề mặt ( contour and surface plots)

8 Nếu muốn tối ưu hóa đáp ứng, chọn Response Optimizer hay Overlaid Contour Plot để có các phân tích số và đồ thị

Mẫu bề mặt đáp ứng (Response surface design)

Hình 2.3 Bề mặt đáp ứng không có độ cong

Hình 2.4 Bề mặt đáp ứng có độ cong

Sự khác biệt giữa phương trình bề mặt đáp ứng và phương trình của mẫu nhân tố là sự thêm các thành phần bình phương (hay bậc hai) cho phép

mô hình hóa độ cong trong đáp ứng, giúp cho :

- Hiểu biết và lập bản đồ vùng bề mặt của đáp ứng Các phương trình

bề mặt đáp ứng mô hình hóa những thay đổi trong biến đầu vào ảnh hưởng ra sao đến đáp ứng được quan tâm

- Tìm các mức độ của các biến đầu vào làm tối ưu đáp ứng

- Chọn lọc các điều kiện tiến hành để đáp ứng các đặc điểm của thí nghiệm

Tính ưu việt của phương pháp bề mặt chỉ tiêu

 Tìm các giá trị của yếu tố (các điều kiện tiến hành) cho đáp ứng tốt nhất

 Tìm các giá trị của yếu tố thỏa mản các đặc điểm của quá trình

 Xác định những điều kiện tiến hành mới giúp cải thiện chất lượng sản phẫm (đáp ứng) so với những điều kiện hiện tại

 Mô hình hóa mối quan hệ giữa các yếu tố định lượng với đáp ứng

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện nay trong nước ngày càng có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn lactobacillus, đặc biệt là những ứng dụng trong chăm sóc sức khoẻ và chăn nuôi Phân lập có ý nghĩa rất to lớn để lựa chọn những loài có tiềm năng cao trong lên men

Nhóm của Nguyễn Thu Hà và cs (2006), nghiên cứu sự biểu hiện của

enzyme lactase ở 2 chủng Lactobacillus reuteri L103 và L461 Đây là nghiên

cứu hoàn toàn cơ bản, cho thấy 2 enzyme biểu hiện 2 tiểu phần (2 chuỗi peptide có trọng lượng là 35kDa và 85kDa) Các enzyme nay có khoảng pH hoạt động khá hẹp, một enzyme từ pH 3.8 – 4.0 (chủng L461) và một pH 4.6 – 4.8 (chủng L103) Kết quả nghiên cứu này sau đó được trình bày tại Hội nghị lần thứ V, Trường Đại học Khoa học Hà Nội, (2006) và đã đăng trong tạp chí quốc tế Nhóm tác giả này về sau có một số nghiên cứu tinh sạch enzyme để sử dụng tổng hợp galactooligosaccharides mang hoạt tính sinh học ( Nguyễn Thu Hà và cs, 2006 )[4]

Nghiên cứu của Hoàng Quốc Khánh và cộng sự năm 2010 đã phân lập

và định danh được các chủng B6, B8a, B8b, B9a, B9b, B11, B12b, B15, B17,

M3, M5 và T16 Qua các thí nghiệm in vitro, 12 chủng Lactobacillus có đặc

tính probiotic thích hợp cho con người đã được chọn lọc Chúng có thể tồn tại trong đường dạ dày – ruột người vì kháng lại pH thấp trong dạ dày, kháng lại dịch mật trong ruột non và kết bám với biểu mô ruột Các chủng này được

định danh bằng phương pháp phân tích trình tự rDNA 16S gồm: L paracasei/

casei B5, L salivarius B6, L gasseri B8a, L fermentum B8b, L fermentum

B9a, L gasseri B9b, L rhamnosus B11, L paracasei/ casei B12b, L

paracasei/ casei B17, L rhamnosus M3, L salivarius M5 và L fermentum

T16 Ngoài ra, các chủng Lactobacillus có đặc tính probiotic ở trên cũng thể

hiện một số ích lợi đối với sức khỏe con người như: kháng với các vi khuẩn gây bệnh, tạo ra bacteriocin và các chất kháng khuẩn khác Đồng thời, chúng cũng kháng với một số loại kháng sinh Tùy theo khả năng kháng kháng sinh của mỗi chủng, chúng có thể được đưa vào cơ thể của các bệnh nhân sử dụng các loại kháng sinh (như: amikacin, kanamycin, gentamicin, streptomycin, vancomycin và co-trimoxazole) mà không bị tiêu diệt bởi các loại kháng sinh