Khảo sát đặc tính và điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus casei

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHAN THỊ HƯỜNG KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH VÀ ĐIỀU KIỆN NI CẤY VI KHUẨN Lactobacillus casei KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHAN THỊ HƯỜNG MÃ SINH VIÊN : 1401315 KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH VÀ ĐIỀU KIỆN NI CẤY VI KHUẨN Lactobacillus casei KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Kiều Thị Hồng Nơi thực hiện: Bộ môn Công Nghiệp Dược HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Với kính trọng lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn đến cô giáo ThS Kiều Thị Hồng PGS TS Đàm Thanh Xuân, người thầy tận tình hướng dẫn bảo em suốt thời gian làm khóa luận Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo, anh chị kĩ thuật viên môn Công Nghiệp Dược tạo điều kiện giúp đỡ em thời gian nghiên cứu để hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu tồn thể thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian em học tập trường Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè thân thiết ln ln động viên, khích lệ em học tập, sống hết lòng giúp đỡ em thực khóa luận Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Phan Thị Hường MỤC LỤC Danh mục kí hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………… CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU ………………………………………2 1.1 Đại cương probiotic ……………………………………………………2 1.1.1 Định nghĩa probiotic ……………………………………………………2 1.1.2 Vai trò probiotic ……………………………………………………2 1.2 Lactobacillus casei …………………………………………………………6 1.2.1 Giới thiệu Lactobacillus casei ……………………………………6 1.2.2 Đặc điểm sinh lý L casei nơi phân bố ………………………….6 1.2.3 Vai trò L casei hệ tiêu hóa ……………………………… 1.2.4 Phương pháp định lượng vi khuẩn …………………………………… 1.2.5 Ứng dụng L casei ………………………………………………10 1.2.6 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn L casei nước…… 12 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………………………………………………………… 14 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị ………………………………………………….14 2.1.1 Chủng vi khuẩn ……………………………………………………… 14 2.1.2 Hóa chất ……………………………………………………………….14 2.1.3 Môi trường …………………………………………………………….14 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ ………………………………………………………15 2.2 Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………16 2.2.1 Lựa chọn điều kiện cấp khí thời gian ni cấy vi khuẩn L casei để thu sinh khối tạo chế phẩm probiotic ……………………………………….16 2.2.2 Khảo sát số đặc tính probiotic vi khuẩn L casei …………….16 2.3 Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………… 16 2.3.1 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật …………………………… 16 2.3.2 Phương pháp nhân giống L casei …………………………………….18 2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính bacteriocin vi khuẩn L casei ……… 18 2.3.4 Phương pháp định tính acid lactic số acid khác dịch nuôi cấy vi khuẩn L casei …………………………………………………….19 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN …………………21 3.1 Lựa chọn điều kiện cấp khí thời gian ni cấy vi khuẩn L casei để thu sinh khối tạo chế phẩm probiotic ……………………………………………21 3.1.1 Lựa chọn điều kiện cấp khí để thu sinh khối vi khuẩn L casei ………21 3.1.2 Lựa chọn thời gian nuôi cấy để thu sinh khối vi khuẩn L casei …… 23 3.2 Khảo sát số đặc tính probiotic vi khuẩn L casei …………… 27 3.2.1 Khảo sát khả sinh bacteriocin vi khuẩn L casei dịch nuôi cấy dịch phá tế bào ………………………………………………… 27 3.2.2 Khảo sát khả sinh acid lactic số acid khác vi khuẩn L casei …………………………………………………………………… 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 Tài liệu tham khảo DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATCC : Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ (American Type Culture Collection) B subtilis : Bacillus subtilis BV : Bacterial Vaginosis CFU : Số đơn vị khuẩn lạc (Colony - Forming Units) E.coli : Escherichia coli L acidophilus : Lactobacillus acidophilus L casei : Lactobacillus casei L.casei shirota : Lactobacillus casei shirota L gasseri : Lactobacillus gasseri L johsonnii : Lactobacillus johsonii L reuteri : Lactobacillus reuteri L rhamnosus : Lactobacillus rhamnosus L salivarius : Lactobacillus salivarius LAB : Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacterium) MRS : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (de Man, Rogosa, Sharpe) UV (Ultraviolet) : Tia cực tím VK : Vi khuẩn VSV : Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng đề tài 14 2.2 Các thiết bị sử dụng đề tài 15 3.1 Sinh khối thu theo thời gian nuôi cấy 24 3.2 Kết xác định bacteriocin dịch nuôi cấy dịch phá 28 tế bào L casei Trang DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình Trang 1.1 L casei 1.2 Sữa uống lên men chứa L casei 11 1.3 Một số chế phẩm viên uống điều trị viêm âm đạo chứa L casei 12 3.1 Đồ thị tương quan sinh khối thu điều kiện 22 nuôi cấy khác 3.2 Đường cong sinh trưởng phát triển vi khuẩn L casei nuôi 25 cấy môi trường MRS lỏng, tủ ấm 37℃, CO2 5% 3.3 Vòng ức chế tạo dịch nuôi cấy L casei vi khuẩn kiểm 30 định B subtilis 3.4 Vòng ức chế tạo dịch nuôi cấy L casei vi khuẩn kiểm 30 định E coli 3.5 Định tính acid lactic 32 3.6 Định tính acid acetic 33 3.7 Định tính acid citric 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Hàng nghìn năm trước, người biết tiêu thụ sản phẩm sữa lên men chứa vi sinh vật sống có lợi Năm 1930, nhà khoa học Nhật Minoru Shirota phân lập vi khuẩn lactic, năm nhà nghiên cứu Hoa Kỳ chứng minh Lactobacillus acidophilus có khả làm giảm bệnh táo bón Các nhà khoa học đại học Havard phát vi khuẩn đường ruột đóng vai trò định q trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp số vitamin chất dinh dưỡng khác mà thể vật chủ không tự sản xuất Các sản phẩm probiotic mang tính thương mại xuất từ 1935 tăng mạnh từ thập niên 80 kỷ trước Hiện Tổ chức Thực phẩm Nông nghiệp Liên hợp quốc (FAO), Tổ chức Y tế giới (WHO) tổ chức chuyên ngành ghi nhận bổ sung probiotic có hiệu tích cực điều trị tiêu chảy liên quan đến việc sử dụng kháng sinh, điều trị bệnh lý dị ứng, viêm ruột hoại tử, cải thiện tình trạng dinh dưỡng tăng cường khả miễn dịch Cho tới hiệu probiotic lên sức khỏe người ngày nhận quan tâm đặc biệt nhà khoa học chuyên gia sức khỏe giới Với mong muốn góp phần nhỏ vào nghiên cứu chủng vi sinh vật sử dụng làm chế phẩm probiotic Việt Nam, đề tài “Khảo sát đặc tính điều kiện ni cấy vi khuẩn Lactobacillus casei” thực với mục tiêu cụ thể sau: Lựa chọn điều kiện cấp khí thời gian nuôi cấy để thu sinh khối vi khuẩn L casei tạo chế phẩm probiotic Khảo sát số đặc tính probiotic có lợi vi khuẩn L casei dịch (dịch nuôi cấy) sinh khối Xử lý sinh khối thu theo phương pháp nêu mục 2.3.3 a để thu dịch phá tế bào Tiến hành xác định bacteriocin dịch nuôi cấy dịch phá tế bào theo phương pháp nêu mục 2.3.3 b; mẫu trắng dịch ni cấy dung dịch acid lactic có pH (tương đương pH dịch nuôi cấy), dịch phá tế bào dung dịch Triton 0.1% Các vi khuẩn kiểm định lựa chọn B subtilis, đại diện cho vi khuẩn Gram (+) E coli, đại diện cho vi khuẩn Gram (-) [38] Thí nghiệm lặp lại lần mẻ nuôi cấy độc lập L casei * Kết quả: Kết xác định bacteriocin dịch nuôi cấy dịch phá tế bào L casei thể bảng 3.2 Bảng 3.2: Kết xác định bacteriocin dịch nuôi cấy dịch phá tế bào L casei Vòng ức chế Lần thí nghiệm Trên B subtilis Trên E coli Lần Dịch nuôi cấy (+) Dịch phá tế bào (-) Dịch nuôi cấy (+) Dịch phá tế bào (-) Lần (+) (-) (+) (-) Lần (+) (-) (+) (-) Ghi chú: (+): Xuất vòng ức chế (-): Khơng xuất vòng ức chế Trong lần thí nghiệm, mẫu trắng dịch ni cấy (dung dịch aicd lactic có pH 4) mẫu trắng dịch phá tế bào (dung dịch Triton 0.1%) vi khuẩn L casei khơng tạo vòng ức chế chủng vi khuẩn kiểm định B subtilis E coli * Nhận xét bàn luận: - Về khả sinh bacteriocin L casei dịch nuôi cấy: Kết bảng 3.2 cho thấy: lần thí nghiệm, dịch ni cấy L casei tạo vòng ức chế chủng vi khuẩn kiểm định B subtilis E coli Mẫu 28 trắng dung dịch acid lactic có pH (tương đương pH dịch ni cấy) khơng tạo vòng ức chế tất thí nghiệm tương ứng, điều cho phép loại trừ tác dụng acid hữu có dịch ni cấy Từ rút kết luận sau: Một là, bacteriocin có dịch nuôi cấy L casei môi trường MRS Kết phù hợp với nhiều nghiên cứu bacteriocin L casei [2], [41] Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng dịch nuôi cấy vi khuẩn để thu nhận bacteriocin Theo Mishra c.s., (2005), dịch nuôi cấy chủng L casei sau trung hòa tính acid có khả ngăn cản phát triển Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae Staphylococcus aureus [41] Theo Đào Thị Minh Châu, cho thấy dịch nuôi cấy vi khuẩn L casei VTCC 186 có chứa chất kháng khuẩn bacteriocin chất tương tự bacteriocin [2] Hai là, bacteriocin dịch ni cấy L casei có tác dụng ức chế B subtilis E coli, tức thể hoạt tính vi khuẩn Gram (+) Gram (-) Đây đặc điểm không thường gặp bacteriocin LAB Theo Parada cộng sự, bacteriocin LAB thường có tác dụng vi khuẩn Gram (+) tác dụng vi khuẩn Gram (-) [44] Tiến hành so sánh vòng ức chế tạo bacteriocin dịch nuôi cấy L casei B subtilis E coli cho thấy mặt định tính, vòng ức chế bacteriocin B subtilis trong, to rõ so với E coli (Hình 3.3 & 3.4) Kết phù hợp với kết nghiên cứu nhóm tác giả hoạt tính kháng khuẩn [11] Các tác giả tiến hành nghiên cứu sản phẩm Kefir (sản phẩm lên men từ hệ vi sinh vật phong phú bao gồm nhóm vi khuẩn lactic, nấm men số nhóm khác) sản phẩm Kefir chanh dây giàu probiotic bổ sung vi khuẩn probiotic (Lactobacillus casei VTCC186) Theo kết cơng bố sản phẩm có khả kháng khuẩn, khả kháng vi khuẩn Gram (+) B subtilis sản phẩm tốt khả kháng vi khuẩn Gram (-) Salmonella sp 29 Hình 3.3 : (1), (3) Vòng ức chế tạo Hình 3.4: (1), (3) Vòng ức chế tạo dịch nuôi cấy L casei vi dịch nuôi cấy L casei vi khuẩn kiểm định B subtilis khuẩn kiểm định E coli - Về khả sinh bacteriocin dịch phá tế bào L casei: Theo kết trên, dịch phá tế bào L casei không tạo vòng ức chế chủng vi khuẩn kiểm định B subtilis E coli Mặt khác, bacteriocin L casei có hoạt tính chủng vi khuẩn kiểm định Vì sơ kết luận bacteriocin khơng có dịch phá tế bào L casei Theo Tagg cộng sự, đặc điểm môi trường nuôi cấy yếu tố định đến tỉ lệ dạng tồn bacteriocin vi khuẩn Gram (+) [52] Trong đề tài này, L casei nuôi cấy môi trường MRS lỏng 37℃ 24 khơng kiểm sốt pH mơi trường q trình ni cấy Khơng loại trừ khả bacteriocin tồn dạng nội bào thay đổi điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Phương pháp xử lí sinh khối thực đề tài phương pháp hóa học sử dụng chất tẩy rửa Triton X100 (mục 2.3.3 a) Đây chất tẩy rửa không ion thường sử dụng phá tế bào Nồng độ Triton 0,1% nồng độ thường dùng đủ để phá vỡ tế bào [64] Cơ chế hoạt động hòa tan protein màng (Harrison 2011) [28] Nhược điểm phương pháp sử dụng chất tẩy rửa để phá vỡ tế bào nhiều protein bị biến tính q trình ly giải tế bào 30 Ngồi ra, diện chất tẩy ảnh hưởng đến bước tinh tiếp theo, đặc biệt kết tủa muối [8] Trong phạm vi đề tài này, chưa có đủ điều kiện để thử nghiệm điều kiện nuôi cấy phương pháp xử lý sinh khối khác, việc xác định bacteriocin sinh khối L casei tạm dừng lại việc kết luận bacteriocin khơng có dịch phá tế bào vi khuẩn Tóm lại, kết mục 3.2.1 cho thấy, điều kiện thực nghiệm đề tài, L casei có khả sinh bacteriocin bacteriocin L casei không tồn nội bào mà chủ yếu nằm dịch nuôi cấy Bacteriocin có hoạt tính vi khuẩn Gram (+) (B subtilis) vi khuẩn Gram (-) (E coli), khả ức chế B subtilis bacteriocin biểu rõ rệt với E coli 3.2.2 Khảo sát khả sinh acid lactic số acid khác vi khuẩn L casei L casei thuộc giống Lactibacillus, acid lactic sản phẩm cuối trình lên men trao đổi chất [17] Các acid lactic sản xuất L casei thơng qua q trình lên men glucose quan trọng acid lactic có chức giảm cholesterol, tăng cường đáp ứng miễn dịch, chống bệnh tiêu chảy, tăng khả dung nạp lactose, ức chế tác nhân gây bệnh đường ruột sử dụng chế phẩm sinh học [41] Do đó, việc xác định khả sinh acid lactic số acid khác vi khuẩn L casei tiêu quan trọng đề tài * Mục đích: Xác định khả sinh acid lactic số acid khác: acid acetic, acid citric dịch nuôi cấy vi khuẩn L casei 3.2.2.1 Định tính acid lactic * Cách tiến hành: Ni cấy vi khuẩn L casei theo mục 2.3.2 Sau 24 giờ, tiến hành ly tâm thu dịch ngoại bào Chuẩn bị ống nghiệm đánh số từ đến 3, ống nghiệm có chứa thành phần sau đây: 31 + Ống 1: ml thuốc thử Uferman + ml dung dịch acid lactic (ống chứng để nhận biết đổi màu thuốc thử) + Ống 2: ml thuốc thử Uferman + ml dịch môi trường + Ống 3: ml thuốc thử Uferman + ml dịch ngoại bào Quan sát đổi màu thuốc thử từ kết luận xem vi khuẩn L casei có khả sinh acid lactic hay khơng * Kết quả: Hình 3.5: Định tính acid lactic Qua hình 3.5 cho thấy: ống không làm đổi màu thuốc thử, ống làm đổi màu thuốc thử Uferman từ xanh tím sang vàng rơm chứng tỏ dịch ni cấy vi khuẩn L casei có chứa acid lactic 3.2.2.2 Định tính acid acetic * Cách tiến hành: - Chuẩn bị ống nghiệm đánh số thứ tự 1, 2, Mỗi ống chứa ml dung dịch acid acetic chứng, dịch trước nuôi cấy, dịch sau nuôi cấy - Thêm thừa bột CaCO3 vào ống nghiệm, lắc kỹ cho hết sủi bọt, lọc - Thêm vào ống nghiệm chứa dịch lọc 4-5 giọt dung dịch FeCl3 5% Quan sát tượng, ống nghiệm xuất màu đỏ hồng chứng tỏ có chứa acid acetic * Kết quả: 32 Hình 3.6: Định tính acid acetic Qua hình 3.6 cho thấy: sau nhỏ thuốc thử FeCl3 vào dịch lọc ống xuất màu đỏ hồng ống ống khơng  Kết luận sơ dịch nuôi cấy vi khuẩn L.casei không chứa acid acetic 3.2.2.3 Định tính acid citric * Cách tiến hành: - Chuẩn bị ống nghiệm, cho vào ống nghiệm thành phần sau: - Ống (ống chứng): g Natricitrat + ml dung dịch CaCl2 tiến hành đun nóng lửa đèn cồn - Ống 2: ml dịch sau ni cấy, sau trung hòa NaOH, cho thêm ml CaCl2, sau tiến hành đun nóng lửa đèn cồn Quan sát tượng, ống nghiệm xuất kết tủa màu trắng chứng tỏ dịch ni cấy có chứa aicd citric * Kết quả: Hình 3.7: Định tính acid citric 33 - Ống 1: xuất kết tủa màu trắng - Ống 2: không xuất kết tủa màu trắng  Kết luận sơ dịch nuôi cấy vi khuẩn L casei không chứa acid citric * Nhận xét bàn luận: Từ kết nêu trên, kết luận sơ dịch ni cấy vi khuẩn L casei có chứa acid lactic, khơng chứa acid acetic acid citric Kết thực nghiệm xác định có mặt acid lactic phù hợp với nghiên cứu có khả sinh acid lactic vi khuẩn L casei [2], [9] Trong nghiên cứu tác giả ghi nhận có mặt acid lactic dịch ni cấy vi khuẩn L casei Vi khuẩn L casei vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn lactic, acid lactic sản phẩm cuối trình lên men trao đổi chất L casei lên men theo đường dị hình [17]; q trình sinh trưởng L casei ức chế phát triển vi khuẩn gây bệnh cách giảm độ pH thông qua việc sản xuất acid hữu acetic, propionic, acid lactic cách sản xuất hydrogen peroxide [40] Tuy nhiên, kết định tính acid có dịch ni cấy vi khuẩn L casei đề tài ghi nhận có mặt acid lactic, khơng có acid acetic, acid citric Điều giải thích sau: không ngoại trừ khả acid acetic acid citric có mặt dịch ni cấy sản phẩm phụ với lượng nhỏ mà phản ứng định tính khơng nhận được, acid phản ứng với acid lactic ethanol có dịch ni cấy để tạo thành ester, mà kết định tính cho âm tính Mặt khác lượng sản phẩm tạo phụ thuộc nhiều vào chủng giống, điều kiện nuôi cấy: môi trường, nhiệt độ, pH… Không ngoại trừ khả thay đổi điều kiện nuôi cấy ghi nhận có mặt acid acetic acid citric Tóm lại, phạm vi đề tài này, chưa có đủ điều kiện để thử nghiệm phương pháp định tính khác điều kiện nuôi cấy khác, việc xác định có mặt acid dịch ni cấy vi khuẩn L casei tạm dừng lại việc kết luận: dịch ni cấy vi khuẩn L casei có chứa acid lactic, không chứa acid acetic acid citric 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đề tài hoàn thành mục tiêu đề thu số kết sau: 4.1.1 Mục tiêu lựa chọn điều kiện cấp khí thời gian nuôi cấy để thu sinh khối vi khuẩn L casei tạo chế phẩm probiotic kết thu được: - Điều kiện cấp khí điều kiện kỵ khí (tủ ấm 37℃, CO2 5%), thời gian nuôi cấy 18 4.1.2 Mục tiêu khảo sát số đặc tính probiotic có lợi vi khuẩn L casei, kết thu được: - L casei có khả sinh bacteriocin bacteriocin vi khuẩn L casei không tồn nội bào mà chủ yếu nằm dịch nuôi cấy Bacteriocin thể tác dụng ức chế vi khuẩn Gram (+) (B subtilis) vi khuẩn Gram (-) (E coli) Dịch nuôi cấy vi khuẩn L casei chứa acid lactic, không chứa acid acetic acid citric 4.2 Kiến nghị: Đề tài tiếp tục phát triển theo số hướng sau: - Khảo sát tiếp ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy thông số nhiệt độ, pH, thành phần môi trường,… lên khả tạo sinh khối từ lựa chọn điều kiện tối ưu cho thu nhiều sinh khối nhất; - Khảo sát thêm số đặc tính probiotic vi khuẩn L casei như: khả chịu pH thấp dịch dày, khả chịu muối mật, khả khử cholesterol - Tạo vi nang chứa L casei ứng dụng chế phẩm probiotic 35 Tài liệu tham khảo TIẾNG VIỆT Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học Đào Thị Minh Châu (2012), Khảo sát ảnh hưởng phương pháp vi gói natri alginate lên số lượng hoạt tính probiotic Lactobacillus casei trình tạo bột sữa chua, Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia TP HCM Đào Thị Mỹ Linh, Nguyễn Hải Nam, Nguyễn Thị Quỳnh Mai (2015), " Tối ưu q trình ni cấy thu sinh khối Lactobacillus casei mơi trường MRS cải biên", Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 5(24), tr.24-33 Lê Quang Anh Tuấn (2006), Bài giảng môn thực hành vi sinh, Trường cao đẳng cơng nghiệp thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh, tr.8-9 Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi (2006), Các phương pháp phân tích ngành cơng nghệ lên men, NXB KHKT, tr.220-221 Lê Văn Việt Mẫn (2004), Công nghệ sản xuất sản phẩm từ sữa, NXB Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học tập - Thí nghiệm vi sinh vật học, NBX ĐH Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, tr.55-62 Nguyễn Hồng Lộc (2007), Giáo trình Nhập môn Công nghệ sinh học, Nhà xuất Đại học Huế, tr.212 Nguyễn Thị Út Lợi (2012), Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra thành nguyên liệu thực phẩm giàu calcium protein, Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh, tr.56-58 10 Nguyễn Thúy Hương, Bài giảng phân tích vi sinh thực phẩm, Khoa cơng nghệ thực phẩm, Đại học công nghệ TP HCM, tr.29 11 Quách Đức Tính, Tống Thành Trung, Nguyễn Ngọc Duy, Nguyễn Thúy Hương (2013), Khảo sát số hoạt tính probiotic Kefir chanh dây truyền thống Kefir chanh dây bổ sung Lactobacillus casei VTCC186, Tạp chí phát triển khoa học công nghệ, tập 16 số tháng 3, tr.44 12 Thái Duy Thìn, Võ Thị Nhị Hà, Nguyễn Hải Nam, Đào Thị Kim Oanh, Nguyễn Tường Vy (2008), Thực tập Hóa Dược, Bộ mơn Hóa Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.15 13 Trương Thị Thanh Lê (2008), Chọn mơi trường điều kiện ni cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn lactic, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Bách Khoa HN TIẾNG ANH 14 Alex van Belkum, Edward Nieuwenhuis E (2007), "Life in commercial probiotics", FEMS Immunol Med Microbiol, 50, pp.281-283 15 Amara A.A., Shibl A (2015), "Role of Probiotics in health improvement, infection control and disease treatment and management", Saudi Pharmaceutical Journal, 23(2), pp.107-114 16 Aroutcheva A., Gariti D., Simon M, et al (2001), "Defense factors of vaginal lactobacilli", Am J Obstet Gynecol, 185(2), pp.375–379 17 Axelsson L (1998), Lactic acid bacteria: classification and physiology in Lactic Acid Bacteria, Microbiology and Functional Aspects, 2nd edited by Marcel Dekker, Inc, New York, pp.1-72 18 Barberis IL., Pajaro MC., et al (1997), "[In vitro inhibition of the growth of Gardnerella vaginalis by bacteriocins produced by strains of Pseudomonas aeruginosa]", Enferm Infecc Microbiol Clin, 15(9), pp.473476 19 Cai H., Rodriguez B.T., et al (2007), "Genotypic and phenotypic characterization of Lactobacillus casei strains isolated from different ecological niches suggests frequent recombination and niche specificity", Microbiology, 153, pp.2655-2665 20 Chan-Blanco Y., Bonilla-Leiva A.R., et al (2003), "Using banana to generate lactic acid through batch process fermentation", Applied Microbiology Biotechnology, 63, pp 47-152 21 Delattre N., Saad C., et al (2013), "An overview of the last advances in probiotic and prebiotic field", An overview of the last advances in probiotic and prebiotic field, 50(1), pp.1-16 22 Falagas M., Betsi G.I., et al (2007), "Probiotics for the treatment of women with bacterial vaginosis", Clin Microbiol Infect, 13(7), pp.657–664 23 FAO/WHO (2006), "Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the evaluation of probiotics in food" 24 FAO/WHO (2001), "Health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria [Report of a joint FAO/WHO expert consultation]'' 25 Godiosa O., Consignado M.D., et al (1993), "In Vitro Study on the Antibacterial Activity of Lactobacillus casei (Commercial Yakult Drink) against Four Diarrhea- Causing Organisms", Phil J Microbiol Infect, 22(2), pp 50-55 26 Ha M.Y., Kim S.W., et al (2003), "Kinetics analysis of growth and lactic acid production in pH-controlled batch cultures of Lactobacillus casei KH1 using yeast extract/corn steep liquor/glucose medium", Journal of Bioscience and Bioengineering, 196, pp.134-140 27 Hacini-Rachinel F., Nancey S., et al (2009), "CD4+ T Cells and Lactobacillus casei Control Relapsing Colitis Mediated by CD8+ T Cells", The Journal of Immunology, 183, pp.5477–5486 28 Harrison S.T L (2011), Cell distruption In: M Moo-Young (Ed in chief), Comprehensive Biotechnology, Volume 2, (2nd ed.), pp.619–639 29 Heyman M , Ménard S (2002), " Probiotic microorganisms: how they affect intestinal pathophysiology", Cell Mol Life Sci., 59, pp.1-15 30 Holzapfel W.H., Haberer P., et al (2001), "Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition", The American Journal of Clinical Nutrition, 73, pp.365S-373S 31 Holzapfel W.H., Haberer P., et al (1998), " Overview of gut flora and probiotics", Int J Food Microbiol, 41, pp.85– 101 32 Ianniello R G., Zotta T (2016), "Investigation of Factors Affecting Aerobic and Respiratory Growth in the Oxygen-Tolerant Strain Lactobacillus casei N87", 11(11), pp.e0164065 33 Ishikawa H., Akedo I., et al (2005), "Randomized trial of dietary fiber and Lactobacillus casei administration for prevention of colorectal tumors", Int J Cancer,116(5), pp.762–767 34 Jacobsen C.N., Rosenfeldt Nielsen V., et al (1999), "Screening of probiotic activities of forty-seven strains of Lactobacillus spp by In vitro techniques and evaluation of the colonization ability of five selected strains in humans", Appl Environ Microbiol, 65, pp.4949-4956 35 Kailasapathy K., James Chin (2000), "Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp.", Immunology and Cell Biology, 78(1), pp.70-88 36 Kandler O and Weiss N (1986), Genus Lactobacillus, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 9th edited by Williams and Wilkins, Baltimore,Vol.2, pp.1063-1065 37 Karimi G., Sabran M R., et al (2015), "The anti-obesity effects of Lactobacillus casei strain Shirota versus Orlistat on high fat diet-induced obese rats", Food Nutr Res, 59, pp.29273 38 Mahrous H., Mohamed A., et al (2013), "Study bacteriocin production and optimization using new isolates of Lactobacillus spp isolated from some dairy products under different culture conditions", Food and Nutrition Sciences, 4, pp.342-356 39 Marcos A., Warnberg J., et al (2004), "The effect of milk fermented by yogurt cultures plus Lactobacillus casei DN-114001 on the immune response of subjects under academic examination stress", European Journal of Nutrition, 43, pp.381- 389 40 Millette M., Luquet F.M., et al (2007), "In vitro growth of selected pathogens by Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei fermented milk", Letters in Applied Microbiology, 44, pp.314-319 41 Mishra V and Prasad D.N (2005), "Application of in vitro methods for selection of Lactobacillus casei strains as potential probiotics", International Journal of Food Microbiology, 103, pp.109-115 42 Naidu A.S , Bidlack W.R., et al (1999), "Probiotic Spectra of Lactic Acid Bacteria (LAB), " Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 38(1), pp 113-126 43 Nebesny E., Zyzelewicz D., Motyl I., et al (2007), "Dark chocolates supplemented with Lactobacillus strains", European Food Resource Technology, 225, pp.33-42 44 Parada J.L., Caron C.R., et al (2007), "Bacteriocins from lactic acid bacteria: purification, properties and use as biopreservatives", Brazilian Archives of Biology and Technology, 50(3), pp.521-542 45 Perigon G., De Macias M E N., et al.(1988), "Systemic augmentation of the immune response in mice by feeding fermented milks with Lactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus", Immunology and Cell Biology, 63, pp 17-23 46 Prakash S and Jones, M.L (2005), "Artificial cell therapy: New strategies for the therapeutic delivery of live bacteria", Journal of Biomedicine and Biotechnology, 1, pp.44-56 47 Rolfe R.D (2000), "The Role of Probiotic Cultures in the Control of Gastrointestinal Health", Health J Nutr, 130(suppl), pp.396S-402S 48 Salminen S., Gorbach S., et al (2004), Human studies on probiotics: What is scientifically proven today? Lactic Acid Bacteria Microbiological and Functional Aspects, New York: Marcel Dekker Inc, 3th Edition 49 Simoes J.A., Aroutcheva A., et al.(2001), "Bacteriocin susceptibility of Gardnerella vaginalis and its relationship to biotype, genotype, and metronidazole susceptibility", Am J Obstet Gynecol, 185(5), pp.1186– 1190 50 St John E., Mares D., et al (2007), "Bacterial vaginosis and host immunity", Current HIV/AIDS Rep, 4(1), pp.22-28 51 Tagg J.R., and McGiven A.R (1971), "Assay system for bacteriocins", Applied microbiology , 21(5), pp.943 52 Tagg J.R., Dajani AS., et al (1976), "Bacteriocins of gram-positive bacteria", Bacteriological reviews, 40(3), pp.722-756 53 Taranto M.P., Medici M., et al (1998), "Evidence for hypocholesterolemic effect of Lactobacillus reuteri in hypercholesterolemic mice", J Dairy Sci., 81(9), pp.2336-2340 54 Ted R Johnson, Christine L Case (2006), Laboratory experiments in microbiology, Benjamin Cummings, pp.120 55 Tiptiri-Kourpeti A., Spyridopoulou K., et al (2016), "Lactobacillus casei Exerts Anti-Proliferative Effects Accompanied by Apoptotic Cell Death and Up-Regulation of TRAIL in Colon Carcinoma Cells", PLoS One, 11(2), pp.e0147960 56 Vignolo G and Castellano P (2004), "Meat-model system development for antibacterial activity determination", Methods Mol Biol, 268, pp.367-370 57 FAO and WHO (2001), Health and Nutrient Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live lactic Acid Bacteria, Report of a joint FAO/WHO expert consultation on evaluation of health and nutrient properties of probiotics including powder milk with live lactic acid bacteria, Cordoba, Argentina 58 Yang E., Fan L., et al (2018), "Influence of culture media, pH and temperature on growth and bacteriocin production of bacteriocinogenic lactic acid bacteria", AMB Express, 8(1), pp.10 INTERNET 59 http://enfo.agt.bme.hu/drupal/node/4330 60 http://vietherbal.com/men-vi-sinh/men-vi-sinh-lactobacillus-caseic1p64.html?fbclid=IwAR38AP71q3fB1UBrVRwBxqih3ruL3b3UegPjD7 0dqd01JSnN5rUk76WpjgQ 61 http://www.probiotics-help.com/yakult.html 62 https://www.adayroi.com/sua-chua-uong-co-duong-probi-vinamilk-loc-4chai-x-130ml-p-PRI608534 63 https://www.iherb.com/pr/now-foods-probiotic-10-50-billion-50-veggie- caps/21131 64 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en® ion=VN&gclid=Cj0KCQiAtbnjBRDBARIsAO3zDl_z12gfT7bwgFwmbbTHCd gJAUWX86r0iGMWfezrWWTE17XuKV6Nal8aAmWpEALw_wcB ... khối vi khuẩn L casei - Lựa chọn thời gian nuôi cấy để thu sinh khối vi khuẩn L casei 2.2.2 Khảo sát số đặc tính probiotic có lợi vi khuẩn L casei - Khảo sát khả sinh bacteriocin dịch nuôi cấy. .. Lựa chọn điều kiện cấp khí để thu sinh khối vi khuẩn L casei ………21 3.1.2 Lựa chọn thời gian nuôi cấy để thu sinh khối vi khuẩn L casei …… 23 3.2 Khảo sát số đặc tính probiotic vi khuẩn L casei ……………... nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus casei thực với mục tiêu cụ thể sau: Lựa chọn điều kiện cấp khí thời gian nuôi cấy để thu sinh khối vi khuẩn L casei tạo chế phẩm probiotic Khảo sát số đặc tính probiotic