Khảo sát đặc tính và điều kiện nuôi cấy vi khuẩn lactobacillus reuteri

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HENG SOKIM KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH VÀ ĐIỀU KIỆN NI CẤY VI KHUẨN Lactobacillus reuteri KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI 2020 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HENG SOKIM MÃ SINH VIÊN: 1501428 KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH VÀ ĐIỀU KIỆN NI CẤY VI KHUẨN Lactobacillus reuteri KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: Ths Tạ Thu Lan Nơi thực Bộ môn Vi sinh – Sinh học Bộ môn Công nghiệp dƣợc HÀ NỘI 2020 LỜI CẢM ƠN Với kính trọng lịng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn đến cô giáo ThS Tạ Thu Lan PGS TS Đàm Thanh Xuân, giáo viên Bộ môn Vi sinh – sinh học Bộ môn Công nghiệp Dược, người thầy tận tình hướng dẫn bảo em suốt q trình làm khóa luận Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn tới thầy Ths Lê Ngọc Khánh cho em nhiều ý kiến đóng góp quý báu giúp đỡ em suốt q trình thực khóa luận Tơi xin trân thành cảm ơn thầy cô, anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược tạo điều kiện giúp đỡ thực khóa luận Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến Ban giám hiệu tồn thể thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội dìu dắt, dậy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập trường Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình tất người thân, bạn bè động viên, khích lệ, ủng hộ nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian học tập nghiên cứu vừa qua Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2020 Sinh viên HENG SOKIM MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cƣơng probiotic .2 1.1.1 Định nghĩa probiotic 1.1.2 Cơ chế hoạt động probiotic 1.1.3 Vai trò probiotic 1.2 Lactobacillus reuteri 1.2.1 Giới thiệu Lactobacillus reuteri 1.2.2 Đặc điểm sinh lý L reuteri nơi phân bố 1.2.3 Vai trò L reuteri 1.2.5 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn L reuteri nước .11 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .12 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 12 2.1.1 Chủng vi khuẩn 12 2.1.2 Hóa chất 12 2.1.3 Môi trường 12 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.2.1 Lựa chọn điều kiện cấp khí thời gian nuôi cấy vi khuẩn L reuteri để thu sinh khối tạo chế phẩm probiotic 14 2.2.2 Khảo sát số đặc tính probiotic vi khuẩn L reuteri 14 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 14 2.3.2 Phương pháp nhân giống L reuteri 16 2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính bacteriocin vi khuẩn L reuteri 17 2.3.4 Phương pháp lựa chọn thời gian nuôi cấy để thu sinh khối vi khuẩn L reuteri 16 2.3.5 Phương pháp thử hoạt tính bacteriocin vi khuẩn L reuteri 17 2.3.6 Phương pháp định tính acid lactic số acid khác dịch nuôi cấy vi khuẩn L reuteri .18 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BẢN LUẬN .20 3.1 Lựa chọn điều kiện cấp khí thời gian ni cấy vi khuẩn L reuteri để thu thu sinh khối tạo chế phẩm probiotic .20 3.1.1 Lựa chọn điều kiện cấp khí để thu sinh khối vi khuẩn L reuteri 20 3.1.2 Lựa chọn thời gian nuôi cấy để thu sinh khối vi khuẩn L reuteri 21 3.2 Khảo sát số đặc tính probiotic vi khuẩn L reuteri 25 3.2.1 Khảo sát khả sinh bacteriocin vi khuẩn L reuteri dịch nuôi cấy 25 3.2.2 Khảo sát khả sinh acid lactic số acid khác vi khuẩn L reuteri 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 4.1 Kết luận .32 4.2 Kiến nghị .32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACTT: Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ (American Type Culture Collection) B cereus: Bacillus cereus B subtilis: Bacillus subtilis CFU: Số đơn vị khuẩn lạc (Colony - forming unit) E coli: Escherichia coli EMP: Con đường Embden Meyerhof (Embden Meyerhof pathway) FAO: Tổ chức thực phẩm nông nghiệp (Food and Agriculture Organization) GI: Đường tiêu hóa (Gastrointestinal) LAB: Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria) L casei: Lactobacillus casei L gasseri: Lactobacillus gasseri L reuteri: Lactobacillus reuteri L rhamnosus: Lactobacillus rhamnosus MRS: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (de Mon, Rogosa, Sharpe) PKP: Con đường phosphoketolase (Phosphoketolase pathway) UV: Tia cực tím (Ultra Violette) VSV: Vi sinh vật WHO: Tổ chức Y tế giới (World Health Organization) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 hóa chất sử dụng đề tài 12 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng đề tài 13 Bảng 3.1 Lượng sinh khối theo điều kiện nuôi cấy 20 Bảng 3.1 Sinh khối L reuteri thu theo thời gian nuôi cấy 22 Bảng 3.3 Kết xác định bacteriocin dịch nuôi cấy L reuteri vi khuẩn kiểm định 26 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Lactobacillus reuteri kính hiển vi Hình 3.1: Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến lượng sinh khối 21 Hình 3.2: Đồ thị biểu lượng sinh khối L reuteri tăng theo thời gian .23 Hình 3.3 Vịng ức chế tạo dịch nuôi cấy vi khuẩn L reuteri vi khuẩn kiểm định B subtilis .26 Hình 3.5 Vịng ức chế tạo dịch ni cấy vi khuẩn L reuteri vi khuẩn kiểm định B cereus 26 Hình 3.4 Vịng ức chế tạo dịch nuôi cấy vi khuẩn L reuteri vi khuẩn kiểm định E Coli 27 Hình 3.6: Kết định tính acid lactic dịch ni cấy L reuteri 29 Hình 3.7: Kết định tính acid acetic dịch ni cấy L reuteri 29 Hình 3.8: Kết định tính acid citric dịch ni cấy L reuteri 30 ĐẶT VẤN ĐỀ Việc nghiên cứu probiotic có từ kỳ 19, năm 1900 Henry Tisser, bác sĩ người Pháp quan sát thấy phân đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có vi khuẩn lạ hình trứng hình chữ Y đứa trẻ khỏe mạnh Sau năm 1907 Elie Metchnikoff – người Nga, đoạt giải Nobel cho "Sự phụ thuộc vi khuẩn đường ruột vào thực phẩm giúp áp dụng biện pháp để thay đổi hệ thực vật thể thay vi khuẩn gây hại vi khuẩn có ích" Ngày nay, sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria Lactobacillus tiêu thụ rộng rãi phổ biến khắp giới nguồn thực phẩm giúp tăng cường sức khỏe cho người vật ni Tác dụng có lợi thực phẩm có thêm vi khuẩn sống (men vi sinh) sức khỏe người, đặc biệt sản phẩm sữa trẻ em nhóm người có nguy cao khác, ngày chuyên gia y tế khuyến khích Nó báo cáo chế phẩm sinh học đóng vai trò quan trọng việc tăng cường chức miễn dịch, tiêu hóa, hơ hấp có tác dụng việc làm giảm bệnh truyền nhiễm trẻ em Tổ chức thực phẩm nông nghiệp (FAO), Tổ chức Y tế giới (WHO) tổ chức chuyên ngành ghi nhận bổ sung probiotic có hiệu tích cực điều trị tiêu chảy liên quan đến sử dụng kháng sinh, điều trị bệnh lý nhiễm trùng, viêm ruột hoại tử, cải thiện tình trạng dinh dưỡng tăng cường khả miễn dịch Probiotic ngày trở nên phổ biến bác sĩ lâm sàng cộng đồng nhận quan tâm mạnh mẽ Nhiều nghiên cứu khác tập trung vào chế nhằm giải thích lợi ích lâm sàng số vi khuẩn sử dụng nhi khoa Với mong muốn góp phần nhỏ vào nghiên cứu chủng vi sinh vật sử dụng làm chế phẩm probiotic Việt Nam, đề tài “Khảo sát đặc tính điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri” thực với mục tiêu cụ thể sau: Lựa chọn điều kiện cấp khí thời gian ni cấy để thu sinh khối vi khuẩn L reuteri Khảo sát số đặc tính probiotic vi khuẩn L reuteri CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cƣơng probiotic 1.1.1 Định nghĩa probiotic Probiotic định nghĩa vi sinh vật sống cung cấp đủ lượng, mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ [27] Trong số nhiều vi khuẩn đường ruột, vi khuẩn dự kiến có lợi cho vật chủ cách cải thiện cân vi khuẩn đường ruột, chọn làm men vi sinh, bao gồm loài thuộc chi Lactobacillus, Bifidobacteria số chủng chi có tác dụng chống viêm mạnh mẽ [20] Ban đầu probiotics lựa chọn với tiêu chí để tạo mơi trường tốt cho lên men thực phẩm, ngày với hiểu biết khoa học tại, tiêu chí lựa chọn probiotics có nhiều thay đổi Các probiotics sử dụng lâm sàng phải đạt đủ tiêu chuẩn sau:  Có khả tồn vật chủ: Probiotics phải bền vững với dịch dày mật  Có khả khu trú: Probiotics phải bám chặt vào niêm mạc sống đường tiêu hố  Có tính bền vững: Probiotics phải có đặc tính chủng tồn suốt chu kỳ sống  Liều lượng khuyến cáo sử dụng phải dựa chứng khoa học Liều hàng ngày dao động từ 108-1010 CFU/ngày Phần lớn sản phẩm có chứa vi khuẩn sống nghiên cứu chứa từ 108- 1010 CFU cho lần dùng, kiểm soát tốt khả sống vi khuẩn thời hạn sử dụng sản phẩm [2] 1.1.2 Cơ chế hoạt động probiotic Sau thời gian dài sử dụng men vi sinh sản phẩm sữa lên men, an tồn tác dụng có lợi sức khỏe người ngày người công nhận Ngành công nghiệp thực phẩm ngày quan tâm đến loại vi sinh vật Kết phân tích dựa chứng từ nghiên cứu động vật thử nghiệm lâm sàng người cho thấy men vi sinh có khả chống lại nhiều bệnh *Từ kết ta có đồ thị sau: Giá trị OD (600nm) 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Thời gian (h) Hình 3.2: Đồ thị biểu lƣợng sinh khối L reuteri tăng theo thời gian Nhận xét bàn luận: - Nhận xét: Lượng sinh khối L reuteri tăng nhanh chóng khoảng thời gian từ 022 giờ, sau từ 22 đến 28 khảo sát lượng sinh khối không tăng lên - Bàn luận: + Về quy trình ni cấy L reuteri Quy trình ni cấy chúng tơi đưa dựa kết nhiều thí nghiệm tiến hành Mơi trường lựa chọn đề tài MRS Đây mơi trường thích hợp vi khuẩn L reuteri sinh trưởng phát triển; nhiên có nhược điểm tương đối đắt tiền Môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng khoáng chất đảm bảo cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho tăng sinh theo quy luật hàm số mũ vi khuẩn Do lượng sinh khối thu tăng dần theo thời gian nuôi cấy đến hết pha logarit, hiệu suất nuôi cấy tăng lên đáng kể + Về phương pháp định lượng vi khuẩn L reuteri Trong đề tài sử dụng phương pháp gián tiếp định lượng vi khuẩn phương pháp đo độ đục để xác định nồng độ vi khuẩn Phương pháp có ưu điểm là: đơn giản, nhanh chóng thuận tiện Phương pháp dùng để so sánh mức độ tăng trưởng hai hay nhiều chủng vi sinh vật môi trường lỏng, 23 thường dùng để theo dõi nghiên cứu đặc trưng tăng trưởng chủng vi sinh vật phịng thí nghiệm sản xuất, nhiên khơng thích hợp cho ứng dụng kiểm nghiệm vi sinh vật [1] Cần phải nói thêm giá trị mật độ quang thu chưa phải số có ý nghĩa thống kê phản ánh xác lượng tế bào Tuy mẫu thu ni cấy đo độ đục điều kiện kết nói lên mối quan hệ sinh khối tế bào thu sau khoảng thời gian nuôi cấy khác +Về kết khảo sát thời gian ni cấy thu sinh khối L reuteri sống nhiều khỏe Thời gian nuôi cấy vi sinh vật với mục đích thu lượng sinh khối nhiều khỏe thông số quan trọng cần khảo sát để tạo quy trình ni cấy có hiệu suất cao tối ưu hóa thời gian tiết kiệm suất lao động thời gian để sản xuất chế phẩm probiotic Kết cho thấy khoảng 20-22 đầu lượng sinh khối tăng lên nhanh chóng tế bào giai đoạn trẻ mặt sinh lý khả sinh học cao Sau (22-28 giờ) lượng sinh khối không tăng lên nữa, quần thể vi khuẩn trạng thái cân động Nguyên nhân cạn kiệt chất dinh dưỡng tích lũy sản phẩm độc hại trình trao đổi chất (acid lactic, bacteriocin ) Thời gian chọn để thu sinh khối vi khuẩn L reuteri tạo chế phẩm probiotic 20 Chúng lựa chọn thời điểm do: thời điểm đầu pha cần bằng, tế bào trạng thái khỏe mạnh nên sấy làm chế phẩm probiotic gây tổn thương đến tế bào vi sinh vật tỷ lệ sống sót cao Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu Relationships between the use of Embden Meyerhof pathway (EMP) or Phosphoketolase pathway (PKP) and lactate production capabilities of diverse Lactobacillus reuteri strains tiến hành chủng L reuteri DSM 20016 DSM 17938 va ATCC 53608 lượng sinh khối vi khuẩn phát triển môi trường MRS theo quy luật hàm số mũ: Tốc độ tăng trưởng tối đa L.reuteri DSM 20016 tương đương với chủng L.reuteri DSM 17938 0,82h-1 thời gian 0,85h 0,80h-1 với thời gian 0,87h thời gian đạt tới pha cân hai chủng 12h cịn chủng L reuteri ATCC 53608 tốc độ tăng trưởng chậm so với hai chủng 0,50h-1 tương ứng với thời gian 1,39h thời gian đạt tới pha cân 24 21h Và sau 24h lượng sinh khối tối đa chủng L reuteri DSM 20016 DSM 17938 ATCC 53608 định lượng phương pháp đo quang bước sóng 600nm 4,42±0,09, 4,31±0.11 3,04±0,06 [7] Tóm lại kết mục 3.1 cho thấy, điều kiện thực nghiệm đề tài, điều kiện hô hấp thời gian nuôi cấy vi khuẩn L reuteri để thu sinh khối tạo chế phẩm probiotic lựa chọn là: điều kiện kỵ khí (tủ ấm CO2 5%, nhiệt độ 37 oC), thời gian 20-22h cho lượng sinh khối cao khỏe 3.2 Khảo sát số đặc tính probiotic vi khuẩn L reuteri 3.2.1 Khảo sát khả sinh bacteriocin vi khuẩn L reuteri dịch nuôi cấy Trong trình lên men vi khuẩn acid lactic sản phẩm chuyển hóa tổng hợp rượu, acid hữu cơ, carbon dioxide, diacetyl, hydro peroxide chất khác có khả ức chế phát triển vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa [16] Có nhiều nghiên cứu khảo sát khả sinh bacteriocin vi khuẩn L reuteri có khả tổng hợp reuterin (3 hydroxypropionaldehyd), chất có khả ức chế vi khuẩn phổ rộng tạo trình chuyển hóa kỵ khí glycerol [33] Tần suất báo cáo khoa học việc vi khuẩn sinh học sản xuất chất kháng khuẩn điều trình bày cho người đọc nhìn tổng quan khía cạnh định nghiên cứu lĩnh vực Vì vậy, cần thiết tiến hành xác định sơ bacteriocin dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn L reuteri *Mục đích: - Xác định khả sinh bacteriocin dịch nuôi cấy dịch phá tế bào chủng vi khuẩn L reuteri - Nhận xét sơ hoạt tính bacteriocin sinh L reuteri vi khuẩn kiểm định Tiến hành xác định bacteriocin mẫu trắng đối chiếu acid lactic có pH (tương đương với pH dịch ni cấy) Các vi khuẩn đại diện lựa chọn B subtilis B cereus đại diện cho vi khuẩn Gram (+) E coli đại diện cho vi khuẩn Gram (-) Thí nghiệm lặp lại lần mẻ nuôi cấy độc lập L reuteri 25 *Kết xác định bacteriocin dịch nuôi cấy L reuteri thể sau: Bảng 3.3: Kết xác định bacteriocin dịch nuôi cấy L reuteri vi khuẩn kiểm định Xuất vòng ức chế vi khuẩn B subtilis E coli B cereus Lần thí Dịch Mẫu trắng Dịch Mẫu trắng Dịch Mẫu trắng nghiệm nuôi cấy (acid nuôi cấy (acid nuôi cấy (acid lactic) lactic) lactic) Lần (+) (-) (+) (-) (+) (-) Lần (+) (-) (+) (-) (+) (-) Lần (+) (-) (+) (-) (+) (-) Ghi chú: (+): Xuất vịng ức chế (-): Khơng xuất vịng ức chế Trong lần thí nghiệm, mẫu trắng dịch ni cấy (dung dịch acid lactic có pH=4) Hình 3.3 Vịng ức chế tạo dịch Hình 3.5 Vịng ức chế tạo dịch ni cấy vi khuẩn L reuteri vi nuôi cấy vi khuẩn L reuteri vi khuẩn kiểm định B subtilis khuẩn kiểm định B cereus 26 Hình 3.4 Vịng ức chế tạo dịch nuôi cấy vi khuẩn L reuteri vi khuẩn kiểm định E Coli *Nhật xét bàn luận: Cả lần thử nghiệm thể vòng ức chế chủng vi khuẩn kiểm định chọn Chứng tỏ vi khuẩn L reuteri có khả sinh bacteriocin bacteriocin vi khuẩn có khả ức chế tăng trưởng vi khuẩn kiểm định B subtilis B cereus đại diện cho vi khuẩn gram (+), E coli đại diện cho vi khuẩn gram (-) Mẫu trắng dung dịch acid lactic có pH=4 (tương đương với pH dung dịch nuôi cấy) không tạo vịng ức chế tất thí nghiệm tương ứng, điều cho phép loại trừ tác dụng acid hữu có dịch ni cấy Từ rút kết luận sau: Trong q trình ni cấy vi khuẩn L reuteri mơi trường MRS có khả sản xuất chất kháng khuẩn gọi bacteriocin Kết phù hợp với nhiều nghiên cứu khảo sát khả sản xuất chất kháng khuẩn vi khuẩn L reuteri Trong nhiều nghiên cứu công bố tác giả sử dụng dịch nuôi cấy vi khuẩn L reuteri để thu lấy bacteriocin Trong nghiên cứu Antimicrobial Activity and Characterization of Lactobacillus Reuteri Isolated From Human Milk năm 2010 thực khảo sát đặc tính hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn Lactobacillus reuteri phân lập từ sữa mẹ Kết nghiên cứu Bacteriocin có dịch ni cấy tế bào Lactobacillus reuteri thể hoạt tính ức chế sinh trưởng vi sinh vật Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa Vibrio cholerae phương pháp khuếch tán giếng thạch [19] 27 Bacteriocin L reuteri sản xuất có hoạt tính ức chế vi khuẩn kiểm định B subtilis B cereus đại diện cho vi khuẩn gram (+), E coli đại diện cho vi khuẩn gram (-) Đây đặc điểm không thường gặp vi khuẩn acid lactic Do đó, vi khuẩn chủng Lactobacillus reuteri phân lập từ sữa mẹ biểu hoạt tính kháng khuẩn chống lại mầm bệnh lâm sàng phổ biến Nó thể tính chất loại Probiotic tốt Tiến hành so sánh vòng ức chế tạo reuterin dịch nuôi cấy L reuteri B subtilis, B cereus E coli Kết cho thấy mặt định tính, vịng ức chế L reuteri B subtilis B cereus trong, to, rõ so với E coli Lactobacillus reuteri coi tác nhân trị liệu sinh học ức chế mầm bệnh đường ruột Điều chỉnh vi sinh vật probiotic chứng minh điều chỉnh chức miễn dịch tăng cường đa dạng lợi khuẩn chống lại mầm bệnh Do đó, việc bổ sung men vi sinh sữa mẹ phù hợp vào sữa bột biện pháp thay để bắt chước số tác dụng chức sữa mẹ trẻ em không bú sữa mẹ Vì yếu tố góp phần khác quan tâm phát triển ứng dụng có can thiệp vi khuẩn chiến lược để ngăn ngừa số bệnh truyền nhiễm Tóm lại, L reuteri sản xuất có hoạt tính ức chế vi khuẩn kiểm định B subtilis B cereus đại diện cho vi khuẩn gram (+), E coli đại diện cho vi khuẩn gram (-) Vòng ức chế tạo reuterin dịch nuôi cấy L reuteri B subtilis B cereus trong, to rõ so với E coli 3.2.2 Khảo sát khả sinh acid lactic số acid khác vi khuẩn L reuteri L reuteri thuộc nhóm vi khuẩn acid lactic acid lactic sản phẩm chuyển hóa cuối trình lên men trao đổi chất Các acid lactic sản xuất L reuteri thông qua trình lên men glucose quan trọng acid lactic đóng vai trị quan trọng việc kiểm sốt pH đường ruột, từ hạn chế phát triển nhiều vi khuẩn gây bệnh Giúp trì cân hệ vi sinh đường ruột, bảo vệ thể khỏi tác nhân xâm nhập bảo vệ đường ruột, tăng cường chức miễn dịch … Do việc xác định khả sinh acid lactic số acid khác vi khuẩn L reuteri là tiêu chí quan trọng đề tài 28 Mục đích: Xác định khả sinh acid lactic số acid khác: acid acetic, acid citric dịch nuôi cấy vi khuẩn L reuteri 3.2.2.1 Định tính acid lactic Quan sát tượng dung dịch chuyển từ màu xanh tím sang màu vàng chứng tỏ dung dịch có chứa acid lactic Kết quả: Hình 3.6: Kết định tính acid lactic dịch nuôi cấy L reuteri Ống làm đổi màu thuốc thử Ufermann từ xanh tím sang vàng rơm  chứng tỏ dịch nuôi cấy vi khuẩn L reuteri có chứa acid lactic 3.2.2.2 Định tính acid acetic Quan sát tượng, ống nghiệm xuất màu đỏ hồng chứng tỏ có chứa acid acetic Kết quả: Hình 3.7: Kết định tính acid acetic dịch nuôi cấy L reuteri 29 Sau nhỏ thuốc thử FeCl3 vào dịch lọc: Ống có xuất màu đỏ hồng cịn ống khơng đổi màu chứng tỏ dịch ni cấy có chứa acid acetic 3.2.2.3 Định tính acid citric Quan sát tượng, ống nghiệm xuất kết tủa màu trắng chứng tỏ dịch ni cấy có chứa acid citric Kết quả: Hình 3.8: Kết định tính acid citric dịch nuôi cấy L reuteri -Ống 1: xuất kết tủa trắng -Ống 2: không xuất kết tủa trắng Chứng tỏ dịch nuôi cấy không chứa acid citric *Nhận xét bàn luận: Từ kết tìm thấy trên, kết luận sơ dịch ni cấy vi khuẩn L reuteri có chứa acid lactic, acid acetic không chứa acid citric Kết thực nghiệm xác định có mặt acid lactic acid acetic phù hợp với nghiên cứu có khả sản xuất acid lactic số acid hữu khác cụ thể acid acetic vi khuẩn L reuteri Trong nghiên cứu tác giả ghi nhận có mặt acid lactic acid acetic dịch nuôi cấy vi khuẩn L reuteri Vi khuẩn L reuteri vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn lactic, sản xuất đa sản phẩm cuối (heterofermentic) acid lactic sản phẩm cuối trình lên men trao đổi chất [17] [26] 30 Tuy nhiên, kết định tính acid lactic có dịch ni cấy vi khuẩn L reuteri đề tài ghi nhận có mặt acid lactic acid acetic, khơng có mặt acid citric Điều giải thích sau: Khơng ngoại trừ khả acid citric có mặt dịch ni cấy sản phẩm phụ với lượng nhỏ mà phản ứng định tính khơng nhận được, acid phản ứng với acid lactic ethanol có dịch ni cấy để tạo thành ester, mà kết định tính âm tính Mặt khác lượng sản phẩm tạo phụ thuộc nhiều vào chủng giống, điều kiện ni cấy: mơi trường, pH… Tóm lại, phạm vi đề tài này, chưa có đủ điều kiện để thử nghiệm phương pháp định tính khác điều kiện nuôi cấy khác, việc xác định có mặt acid dịch ni cấy vi khuẩn L reuteri tạm dừng lại việc kết luận: dịch ni cấy vi khuẩn L reuteri có chứa acid lactic, acid acetic không chứa acid citric Kết luận kết mục 3.2 (khảo sát số đặc tính probiotic vi khuẩn L reuteri) dịch ni cấy vi khuẩn có sản xuất chất kháng khuẩn có tác dụng ức chế vi khuẩn B subtilis, B cereus E coli có chứa acid lactic acid acetic khơng có acid citric 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đề tài hoàn thành mục tiêu đề suất thu số kết sau: 4.1.1 Với mục tiêu lựa chọn điều kiện cấp khí thời gian ni cấy để thu sinh khối vi khuẩn L reuteri, kết thu là: Ở điều kiện cấp khí điều kiện kỵ khí (tủ ấm 370C, CO2 5%), thời gian nuôi cấy 20 môi trường MRS thu lượng sinh khối L reuteri lớn 4.1.2 Với mục tiêu khảo sát số đặc tính probiotic vi khuẩn L reuteri, kết thu là: - L reuteri có khả sinh bacteriocin (reuterin) dịch nuôi cấy Bacteriocin vi khuẩn L reuteri thể tác dụng ức chế vi khuẩn Gram (+) (B subtilis B cereus) vi khuẩn Gram (-) (E coli) - Dịch nuôi cấy vi khuẩn L reuteri chứa acid lactic, acid acetic không chứa acid citric 4.2 Kiến nghị Đề tài tiếp tục phát triển theo số hướng sau: - Khảo sát tiếp ảnh hưởng thông số điều kiện nuôi cấy nhiệt độ pH, thành phần môi trường… lên khả tạo sinh khối từ lựa chọn điều kiện tối ưu cho thu nhiều sinh khối - Khảo sát tiếp ảnh hưởng pH, nhiệt độ, lên hoạt tính kháng khuẩn bacteriocin - Nghiên cứu tạo vi nang L reuteri ứng dụng sản xuất chế phẩm probiotic 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thúy Hương, (2009) “Bài giảng phân tích vi sinh thực phẩm” Khoa cơng nghệ thực phẩm, Đại học công nghệ TP HCM, tr.29 Nguyễn Lân (2012), “Ảnh hưởng sữa mẹ bổ sung Pre-Probiotic lên tình trạng dinh dưỡng, nhiễm khuẩn hệ vi khuẩn chí đường ruột trẻ 6-12 tuổi huyện Phổ Yên, tỉnh Thái Nguyên” Luận án tiến sĩ dinh dưỡng tr.17-20 Tiếng Anh Abrahamsson T R., Sinkiewicz G., Jakobsson T., Fredrikson M., Bjorksten B (2009), "Probiotic lactobacilli in breast milk and infant stool in relation to oral intake during the first year of life", Journal of pediatric gastroenterology and nutrition, 49(3), pp 349-54 Akbari V., Hendijani F (2016), "Effects of probiotic supplementation in patients with type diabetes: systematic review and meta-analysis", Nutrition reviews, 74(12), pp 774-784 Almeida C C., Lorena S L., Pavan C R., Akasaka H M., Mesquita M A (2012), "Beneficial effects of long-term consumption of a probiotic combination of Lactobacillus casei Shirota and Bifidobacterium breve Yakult may persist after suspension of therapy in lactose-intolerant patients", Nutrition in clinical practice: official publication of the American Society for Parenteral and Enteral Nutrition, 27(2), pp 247-51 Bermudez-Brito Miriam, Plaza-Díaz Julio, Munoz-Quezada Sergio, Gomez- Llorente Carolina, Gil Angel (2012), "Probiotic mechanisms of action", Annals of Nutrition and Metabolism, 61(2), pp 160-174 Burge G., Saulou-Berion C., Moussa M., Allais F., Athes V., Spinnler H E (2015), "Relationships between the use of Embden Meyerhof pathway (EMP) or Phosphoketolase pathway (PKP) and lactate production capabilities of diverse Lactobacillus reuteri strains", Journal of microbiology (Seoul, Korea), 53(10), pp 702-10 Cavaillon J M (2011), "The historical milestones in the understanding of leukocyte biology initiated by Elie Metchnikoff", Journal of leukocyte biology, 90(3), pp 413-24 Chew S Y., Cheah Y K., Seow H F., Sandai D., Than L T (2015), "Probiotic Lactobacillus rhamnosus GR-1 and Lactobacillus reuteri RC-14 exhibit strong antifungal effects against vulvovaginal candidiasis-causing Candida glabrata isolates", Journal of applied microbiology, 118(5), pp 80-90 10 Coeuret Valérie, Dubernet Ségolène, Bernardeau Marion, Gueguen Micheline, Vernoux Jean Paul (2003), "Isolation, characterisation and identification of lactobacilli focusing mainly on cheeses and other dairy products", Le Lait, 83(4), pp 269-306 11 Dinleyici E C., Dalgic N., Guven S., Metin O., Yasa O., Kurugol Z., Turel O., Tanir G., Yazar A S., Arica V., Sancar M., Karbuz A., Eren M., Ozen M., Kara A., Vandenplas Y (2015), "Lactobacillus reuteri DSM 17938 shortens acute infectious diarrhea in a pediatric outpatient setting", Jornal de pediatria, 91(4), pp 392-6 12 El-Ziney Mohamed Gamal (2018), "Molecular and Probiotic Characterizations of Lactobacillus reuteri DSM 12246 and Impact of pH on Biomass and Metabolic Profile in Batch-Culture", Advances in Microbiology, 8(01), pp 18 13 Gawronska A., Dziechciarz P., Horvath A., Szajewska H (2007), "A randomized doubleblind placebo-controlled trial of Lactobacillus GG for abdominal pain disorders in children", Alimentary pharmacology & therapeutics, 25(2), pp 17784 14 Gendrel D., Dupont C., Richard-Lenoble D., Gendrel C., Chaussain M (1990), "Feeding lactose-intolerant children with a powdered fermented milk", Journal of pediatric gastroenterology and nutrition, 10(1), pp 44-6 15 Goldenberg J Z., Yap C., Lytvyn L., Lo C K., Beardsley J., Mertz D., Johnston B C (2017), "Probiotics for the prevention of Clostridium difficileassociated diarrhea in adults and children", The Cochrane database of systematic reviews, 12, pp Cd006095 16 Gutierrez-Castrellon P., Indrio F., Bolio-Galvis A., Jimenez-Gutierrez C., Jimenez-Escobar I., Lopez-Velazquez G (2017), "Efficacy of Lactobacillus reuteri DSM 17938 for infantile colic: Systematic review with network meta-analysis", Medicine, 96(51), pp e9375 17 Helander I_M, von Wright Atte, Mattila-Sandholm TM (1997), "Potential of lactic acid bacteria and novel antimicrobials against Gram-negative bacteria", Trends in Food Science & Technology, 8(5), pp 146-150 18 Hsieh M C., Tsai W H., Jheng Y P., Su S L., Wang S Y., Lin C C., Chen Y H., Chang W W (2018), "The beneficial effects of Lactobacillus reuteri ADR-1 or ADR-3 consumption on type diabetes mellitus: a randomized, double-blinded, placebo-controlled trial", Scientific reports, 8(1), pp 16-791 19 Ilayaraja R (2010), "Antimicrobial activity and characterization of Lactobacillus reuteri isolated from human milk", International Journal of Medical Sciences (India), 3(1/2), pp 27-33 20 Isolauri Erika, Salminen Seppo, Ouwehand Arthur C (2004), "Probiotics", Best practice & research Clinical gastroenterology, 18(2), pp 299-313 21 Joanna Scott-Lutyens BA (hons) DipION, Nutritional Therapist; and Kerry Beeson, BSc (Nut.Med) (2019), "Lactobacillus reuteri Protectis®", Retrieved, probiotic database, 1(3) pp 22 Kandler Otto, Stetter Karl-Otto, Köhl Ruth (1980), "Lactobacillus reuteri sp nov., a new species of heterofermentative lactobacilli", Zentralblatt für Bakteriologie: I Abt Originale C: Allgemeine, angewandte und ökologische Mikrobiologie, 1(3), pp 264-269 23 Kohler G A., Assefa S., Reid G (2012), "Probiotic interference of Lactobacillus rhamnosus GR-1 and Lactobacillus reuteri RC-14 with the opportunistic fungal pathogen Candida albicans", Infectious diseases in obstetrics and gynecology, 2012, pp 63,64,74 24 Lau C S., Chamberlain R S (2016), "Probiotics are effective at preventing Clostridium difficile-associated diarrhea: a systematic review and meta-analysis", International journal of general medicine, 9, pp 27-37 25 Mobini R., Tremaroli V., Stahlman M., Karlsson F., Levin M., Ljungberg M., Sohlin M., Berteus Forslund H., Perkins R., Backhed F., Jansson P A (2017), "Metabolic effects of Lactobacillus reuteri DSM 17938 in people with type diabetes: A randomized controlled trial", Diabetes, obesity & metabolism, 19(4), pp 579-589 26 Morita H., Toh H., Fukuda S., Horikawa H., Oshima K., Suzuki T., Murakami M., Hisamatsu S., Kato Y., Takizawa T., Fukuoka H., Yoshimura T., Itoh K., O'Sullivan D J., McKay L L., Ohno H., Kikuchi J., Masaoka T., Hattori M (2008), "Comparative genome analysis of Lactobacillus reuteri and Lactobacillus fermentum reveal a genomic island for reuterin and cobalamin production", DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes, 15(3), pp 151-61 27 Organization World Health (2001), "Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation of Evaluations of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk and Live Lactic Acid Bacteria", Cordoba, Argentina, pp 28 Pedersen N., Andersen N N., Vegh Z., Jensen L., Ankersen D V., Felding M., Simonsen M H., Burisch J., Munkholm P (2014), "Ehealth: low FODMAP diet vs Lactobacillus rhamnosus GG in irritable bowel syndrome", World journal of gastroenterology, 20(43), pp 16-26 29 Reid G., Bocking A (2003), "The potential for probiotics to prevent bacterial vaginosis and preterm labor", American journal of obstetrics and gynecology, 189(4), pp 02-8 30 Sarasu J M., Narang M., Shah D (2018), "Infantile Colic: An Update", Indian pediatrics, 55(11), pp 979-987 31 Simon M C., Strassburger K., Nowotny B., Kolb H., Nowotny P., Burkart V., Zivehe F., Hwang J H., Stehle P., Pacini G., Hartmann B., Holst J J., MacKenzie C., Bindels L B., Martinez I., Walter J., Henrich B., Schloot N C., Roden M (2015), "Intake of Lactobacillus reuteri improves incretin and insulin secretion in glucosetolerant humans: a proof of concept", Diabetes care, 38(10), pp 1827-34 32 Singh T P., Kaur G., Malik R K., Schillinger U., Guigas C., Kapila S (2012), "Characterization of Intestinal Lactobacillus reuteri Strains as Potential Probiotics", Probiotics and antimicrobial proteins, 4(1), pp 47-58 33 Sung V., Cabana M D., D'Amico F., Deshpande G., Dupont C., Indrio F., Mentula S., Partty A., Savino F., Szajewska H., Tancredi D (2014), "Lactobacillus reuteri DSM 17938 for managing infant colic: protocol for an individual participant data meta-analysis", BMJ open, 4(12), pp e006475 34 Talarico T L., Casas I A., Chung T C., Dobrogosz W J (1988), "Production and isolation of reuterin, a growth inhibitor produced by Lactobacillus reuteri", Antimicrob Agents Chemother, 32(12), pp 1854-8 35 Talarico T L., Dobrogosz W J (1989), "Chemical characterization of an antimicrobial substance produced by Lactobacillus reuteri", Antimicrob Agents Chemother, 33(5), pp 674-9 36 Weizman Z., Abu-Abed J., Binsztok M (2016), "Lactobacillus reuteri DSM 17938 for the Management of Functional Abdominal Pain in Childhood: A Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Trial", The Journal of pediatrics, 174, pp 160-164.e1 37 Wolf BW, Garleb KA, Ataya DG, Casas IA (1995), "Safety and tolerance of Lactobacillus reuteri in healthy adult male subjects", Microbial ecology in health and disease, 8(2), pp 41-50 38 Zhao X., Ganzle M G (2018), "Genetic and phenotypic analysis of carbohydrate metabolism and transport in Lactobacillus reuteri", International journal of food microbiology, 272, pp 12-21 ... thời gian nuôi cấy để thu sinh khối vi khuẩn L reuteri 21 3.2 Khảo sát số đặc tính probiotic vi khuẩn L reuteri 25 3.2.1 Khảo sát khả sinh bacteriocin vi khuẩn L reuteri dịch nuôi cấy ... sát đặc tính điều kiện ni cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri? ?? thực với mục tiêu cụ thể sau: Lựa chọn điều kiện cấp khí thời gian ni cấy để thu sinh khối vi khuẩn L reuteri Khảo sát số đặc tính probiotic... chọn điều kiện cấp khí để thu sinh khối vi khuẩn L reuteri - Lựa chọn thời gian nuôi cấy để thu sinh khối vi khuẩn L reuteri 2.2.2 Khảo sát số đặc tính probiotic vi khuẩn L reuteri - Khảo sát khả