Khảo sát đặc tính sinh học phân tử của một số chủng virus viêm gan vịt cường độc phân lập được trên đàn vịt ở một số địa phương và so sánh với chủng virus vaxin dh – eg – 2000

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - - LÊ VĂN BIÊN KHẢO SÁT ðẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VIRUS VIÊM GAN VỊT CƯỜNG ðỘC PHÂN LẬP ðƯỢC TRÊN ðÀN VỊT Ở MỘT SỐ ðỊA PHƯƠNG VÀ SO SÁNH VỚI CHỦNG VIRUS VACXIN DH – EG – 2000 LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học : TS NGUYỄN BÁ HIÊN HÀ NỘI – 2011 LỜI CAM ðOAN Tơi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu nêu luận văn trung thực, tơi thực chưa cơng bố hay bảo vệ học vị Tôi xin cam ñoan rằng, giúp ñỡ cho việc thực luận văn ñã ñược cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn ñược ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2011 Tác giả luận văn Lê Văn Biên Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập nghiên cứu, ñến tơi hồn thành khóa học Nhân dịp hồn thành luận văn thạc sỹ nông nghiệp chuyên ngành Thú y cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn chân thành, sâu sắc tới Thầy, Cô giáo Xin ñược gửi lời cảm ơn sâu sắc ñến Thầy TS Nguyễn Bá Hiên, Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm – Khoa Thú y – Trường ðH Nông Nghiệp Hà Nội, người thầy tận tình hướng dẫn trực tiếp tạo ñiều kiện thuận lợi cho tơi học tập, thực hành thí nghiệm giúp đỡ tơi hồn thành đề tài nghiên cứu ðồng thời tơi bày tỏ biết ơn đến Thầy, Cô môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Khoa Thú y – Trường ðH Nông Nghiệp Hà Nội anh chị phịng Thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y (B213 & B214) nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện giúp tơi hồn thành đề tài cách tốt Cuối tơi muốn bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến quan, người thân gia đình, bạn bè ln động viên, giúp đỡ tơi suốt thời gian học tập thực ñề tài nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn! Hà nội, ngày tháng 09 năm 2011 Học viên Lê Văn Biên Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………………… ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Các chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii MỞ ðẦU 49 1.1 ðặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ñề tài 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh viêm gan virus vịt 2.2 Một số đặc tính virus viêm gan vịt 12 2.3 Sinh học phân tử virus viêm gan vịt 14 2.4 Miễn dịch chống virus viêm gan vịt 19 2.5 Các kỹ thuật sinh học phân tử 20 2.6 Tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan vịt giới việt nam 24 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1 Nội dung nghiên cứu 28 3.2 Vật liệu nghiên cứu 28 3.3 Phương pháp nghiên cứu 31 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 4.1 Kết phân lập virus viêm gan vịt cường ñộc 46 4.1.1 Phân lập phơi vịt 46 4.1.2 Nghiên cứu biến đổi bệnh lý phôi vịt phân lập virus 50 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… iii 4.2 Kết tách chiết rna tổng số 52 4.3 Kết phản ứng rt-pcr 53 4.4 Kết dịng hóa tách dịng sản phẩm 56 4.4.1 Kết dịng hóa sản phẩm vào tế bào khả biến E.coli 56 4.4.2 Kết kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp 58 4.5 Kết giải trình tự nucleotide axit amin gen kháng nguyên vp1 chủng virus viêm gan vịt phân lập ñược chủng virus vacxin dh-eg-2000 4.6 59 So sánh ñồng nucleotide, tương ñồng amino acid vùng gen vp1 chủng virus viêm gan vịt cường ñộc nb, dn1, nc chủng virus vacxin dh-eg-2000 64 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 67 5.1 Kết luận 67 5.2 ðề nghị 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 69 iv CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT DHV Duck Hepartitis Virus DNA Acid Deoxyribonucleic RNA Acid Ribonucleic VP Viral Protein PCR Polymerase Chain Reaction RT-PCR Revese Transcription- Polymerase Chain Reaction EDTA Ethylen Dimine Tetra Acetic Acid dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate ddNTP Dideoxy Nucleotide Triphosphate X-gal 5-Bromo- 4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside Taq Polymerase Thermus aquaticus polymerase LB Luria Bertani-agar UTR Untranslated Region cs Cộng tr Trang Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… v DANH MỤC BẢNG STT 3.1 Tên hình Trang Danh sách mẫu bệnh phẩm viêm gan vịt sử dụng nghiên cứu 29 3.2 Các ñoạn mồi sử dụng phản ứng RT-PCR 29 3.3 Thành phần phản ứng RT-PCR 34 3.4 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 35 4.1 Kết phân lập virus gây bệnh viêm gan vịt phôi vịt 48 4.2 Kết kiểm tra bệnh tích đại thể phơi vịt phân lập virus 50 4.3 Tỷ lệ (%) ñồng nucleotide (trên ñường chéo) tương ñồng axit amin (dưới ñường chéo) chủng virus viêm gan vịt cường ñộc NB, DN1, NC chủng virus vacxin DH-EG2000 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 65 vi DANH MỤC HÌNH STT 2.1 Tên hình Trang Tư chết điển hình vịt bị nhiễm virus viêm gan vịt (a) Gan vịt xuất huyết (b) 2.2 Cấu trúc khơng gian picornavirus 15 2.3 Sơ đồ hệ gen chuỗi polypeptide virus viêm gan vịt 16 2.4 Mơ hình bước phản ứng PCR 21 2.5 Mơ hình ngun lý phản ứng RT-PCR 22 3.1 Sơ đồ vị trí bám mồi để thu nhận ñoạn DNA (~0,8kb) chứa gen VP1 (714bp) chiến lược giải mã gen VP1 virus viêm gan vịt cặp mồi DH3F-DH4R (ảnh minh hoạ) 3.2 30 Sơ ñồ qui trình nghiên cứu, lưu giữ giải mã vùng gen VP1 virus viêm gan vịt 44 4.1 Kiểm tra RNA tổng số tách chiết từ mẫu 53 4.2 Kết ñiện di sản phẩm RT-PCR (~ 800 bp) mẫu virus cường ñộc viêm gan vịt DN1, DN2 NB thạch agarose 1,2% 4.3 Kết ñiện di sản phẩm RT-PCR (~800 bp) mẫu HY, DHEG-2000 NC thạch agarose 1% 4.4 54 55 Kết nuôi cấy vi khuẩn tái tổ hợp ñĩa thạch (LB-agar 1,5%) có chứa kháng sinh Kanamycin X-gal, bao gồm khuẩn lạc xanh trắng cần chọn lọc 4.5 56 Kết tách dòng vùng gen VP1 virus viêm gan vịt ñược ñiện di kiểm tra thạch agarose 1,2%, sản phẩm DNA plasmid ñược kiểm tra cách cắt với enzyme EcoRI Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 58 vii 4.6 Giản ñồ giải trình tự (chromatogram) thành phần nucleotide vùng gen VP1 virus viêm gan vịt chủng DN2, DN1, NB, HY, DH-EG-2000 NC Các nucleotide tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye), ñọc tia laze cho hiển thị Adenine có màu ñỏ (red), Thymine có màu xanh nước biển (blue), Guanine có màu xanh (green) Cystosine có màu ñen (black) 4.7 60 Trình tự Nucleotit axit amin tương ứng vùng gen VP1 chủng virus viêm gan vịt DN2, DN1, NB, HY, DH-EG-2000 NC Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 64 viii MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề Việt Nam nước phát triển với ngành nơng nghiệp ln giữ vai trị then chốt nhằm cung cấp lương thực - thực phẩm cho người tiêu dùng nước bước xuất Trong ngành chăn ni gia cầm, đặc biệt ngành chăn ni vịt trở thành ngành sản xuất hàng hóa quan trọng góp phần vào chương trình xóa đói giảm nghèo cho bà nơng dân Xuất phát từ đặc điểm riêng biệt địa hình tập qn canh tác điều kiện thuận lợi cho việc chăn thả tự nhiên nên vịt lồi thủy cầm người nơng dân ưa chuộng chúng dễ ni, qui mơ đàn đa dạng phù hợp với tập quán chăn nuôi nhỏ lẻ Tuy nhiên song song với việc phát triển đàn vịt dịch bệnh xảy ngày nhiều diễn biến phức tạp Một bệnh thường gặp gây thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi phải kể ñến bệnh viêm gan vịt, bệnh xẩy vịt tuần tuổi thường thấy vịt từ – tuần tuổi mà nặng lại vịt từ – ngày tuổi với tỷ lệ ốm, chết lên tới 95 - 100% Tuy nghiên cứu bệnh viêm gan vịt virus nước ta chưa nhiều, ñặc biệt nghiên cứu hệ gen chủng virus thuộc vùng khác nước ta Các nghiên cứu hệ gen virus gây bệnh viêm gan vịt chứa axit ribonucleic (RNA), sợi ñơn dương có độ dài khoảng 7600 – 7700 Nucleotide Trong hệ gen virus viêm gan vịt vùng quan tâm nhiều vùng gen mã hóa cho protein cấu trúc VP1 Vùng gen ñã ñược chứng minh gen kháng nguyên thiết yếu, vừa ñịnh tính kháng nguyên, vừa ñịnh tính gây bệnh virus (Mulder cs 2000) Mặt khác, nghiên cứu gần ñây hệ gen sinh học phân tử phân loại virus ñều cho thấy virus viêm gan vịt thuộc nhóm họ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 1.DN2 30 60 90 120 GGTGATTCCAATCAGCTTGGTGATGATGAACCAGTGTGTTTTCTCAATTTTGAGACCGCAAACGTGCCAATACAAGGGGAGTCACACACCTTGGTGAAACATTTTTTTGGCCGTCAATGG G D S N Q L G D D E P V C F L N F E T A N V P I Q G E S H T L V K H F F G R Q W> _ VP1 - DN2 - DHAV3 _ _ _> 150 180 210 240 CTGGTTCGAACTGTTCAACACACTGGTGAAGTGCAAGAGTTAGATTTGCCAGTGCCTGACCGGGGTCATGCATCTCTTTTGCGCTTCTTTGCCTATTTTTCTGGAGAAGTGATTCTGACC L V R T V Q H T G E V Q E L D L P V P D R G H A S L L R F F A Y F S G E V I L T> VP1- DN2 - DHAV3 _ > 270 300 330 360 ATTGTCAATAATGGAACAACACCCTGCATGGTTGCACATTCTTACACAACAGACAATCTCACTTCTGAATATGCTGTCACTGCTATGGGGGGTATTCTCATCCCAGCAAACTCTGCTAAA I V N N G T T P C M V A H S Y T T D N L T VP1 390 S E Y A V T A M G G I L I P A N S A K> > - DN2 -DHAV3 _ 420 450 480 AATATTAGTATTCCATTTTATTCTGTCACACCTCTACGTCCCACACGACCCATGCCAGCATCTCAGGGGGGAGGTTTGACTTTTGGTAGGTTGTATATCTGGACACAATCTGGGAGTGTC N I S I P F Y S V T P L R P T R P M P A S Q G G G L T F G R L Y I W T Q S G S V> VP1 - DN2 -DHAV3 > _ 510 540 570 600 TCTGTTTTTATGGGTCTCCATAAGCCAGCTTTGTTTTTTCCACTGCCTGCATCAACCTACACAACACCCATGCGGTCGAATGAGCTTGAAACCATGAATCTGCATGATCAATCAGATCAT S V F M G L H K P A L F F P L P A S T Y T T P M R S N E L E T M N L H D Q S D H> VP1 - DN2 - DHAV3 _ _ _> 630 660 690 20 CCAGACTGTCATTTGTGTAATATTTGCAGGAAAATGAAGAGGTGGTCTCGCAACTATCGCCCATTCCGCTTCTGTTTGAGACTTAAAACACTTGCCTTTGAGCTTCATTTGGAAATTGAA P D C H L C N I C R K M K R W S R N Y R P F R F C L R L K T L A F E L H L E I E> _ VP1 - DN2 -DHAV3 > 2.DN1 30 60 90 120 GGTGATTCCAATCAGCTTGGTGATGATGAACCAGTGTGTTTTCTCAATTTTGAGACCGCAAACGTGCCAATACAAGGGGAGTCACACACCTTGGTGAAACATTTTTTTGGCCGTCAATGG G D S N Q L G D D E P V C F L N F E T A N V P I Q G E S H T L V K H F F G R Q W> VP1-DN1-DHAV3 > 150 180 210 240 CTGGTTCGAACTGTTCAACACACTGGTGAAGTGCAAGAGTTAGATTTGCCAGTGCCTGACCGGGGTCATGCATCTCTTTTGCGCTTCTTTGCCTATTTTTCTGGAGAAGTGATTCTGACC L V R T V Q H T G E V Q E L D L P V P D R G H A S L L R F F A Y F S G E V I L T> VP1-DN1-DHAV3 > 270 300 330 360 ATTGTCAATAATGGAACAACACCCTGCATGGTTGCACATTCTTACACAACAGACAATCTCACTTCTGAATATGCTGTCACTGCTATGGGGGGTATTCTCATCCCAGCAAACTCTGCTAAA I V N N G T T P C M V A H S Y T T D N L T S E Y A V T A M G G I L I P A N S A K> VP1-DN1-DHAV3 > 390 420 450 480 AATATTAGTATTCCATTTTATTCTGTCACACCTCTACGTCCCACACGACCCATGCCAGCATCTCAGGGGGGAGGTTTGACTTTTGGTAGGTTGTATATCTGGACACAATCTGGGAGTGTC N I S I P F Y S V T P L R P T R P M P A S Q G G G L T F G R L Y I W T Q S G S V> VP1-DN1-DHAV3 > 510 540 570 600 TCTGTTTTTATGGGTCTCCATAAGCCAGCTTTGTTTTTTCCACTGCCTGCATCAACCTACACAACACCCATGCGGTCGAATGAGCTTGAAACCATGAATCTGCATGATCAATCAGATCAT S V F M G L H K P A L F F P L P A S T Y T T P M R S N E L E T M N L H D Q S D H> VP1-DN1-DHAV3 > 630 660 690 720 CCAGACTGTCATTTGTGTAATATTTGCAGGAAAATGAAGAGGTGGTCTCGCAACTATCGCCCATTCCGCTTCTGTTTGAGACTTAAAACACTTGCCTTTGAGCTTCATTTGGAAATTGAA P D C H L C N I C R K M K R W S R N Y R P F R F C L R L K T L A F E L H L E I E> VP1-DN1-DHAV3 > Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 61 3.NB 30 60 90 120 GGTGATTCCAATCAGCTTGGTGATGATGAACCAGTGTGTTTTCTCAATTTTGAGACCGCAAACGTGCCAATACAAGGGGAGTCACACACCTTGGTGAAACATTTTTTTGGCCGTCAATGG G D S N Q L G D D E P V C F L N F E T A N V P I Q G E S H T L V K H F F G R Q W> VP1 - NB - DHAV3 _> 150 180 210 240 CTGGTTCGAACTGTTCAACACACTGGTGAAGTGCAAGAGTTAGATTTGCCAGTGCCTGACCGGGGTCATGCATCTCTTTTGCGCTTCTTTGCCTATTTTTCTGGAGAAGTGATTCTGACC L V R T V Q H T G E V Q E L D L P V P D R G H A S L L R F F A Y F S G E V I L T> VP1 - NB - DHAV3 _ > 270 300 330 360 ATTGTCAATAATGGAACAACACCCTGCATGGTTGCACATTCTTACACAACAGACAATCTCACTTCTGAATATGCTGTCACTGCTATGGGGGGTATTCTCATCCCAGCAAACTCTGCTAAA I V N N G T T P C M V A H S Y T T D N L T S E Y A V T A M G G I L I P A N S A K> VP1 - NB - DHAV3 _> 390 420 450 480 AATATTAGTATTCCATTTTATTCTGTCACACCTCTACGTCCCACACGACCCATGCCAGCATCTCAGGGGGGAGGTTTGACTTTTGGTAGGTTGTATATCTGGACACAATCTGGGAGTGTC N I S I P F Y S V T P L R P T R P M P A S Q G G G L T F G R L Y I W T Q S G S V> VP1 - NB - DHAV3 > 510 540 570 600 TCTGTTTTTATGGGTCTCCATAAGCCAGCTTTGTTTTTTCCACTGCCTGCATCAACCTACACAACACCCATGCGGTCGAATGAGCTTGAAACCATGAATCTGCATGATCAATCAGATCAT S V F M G L H K P A L F F P L P A S T Y T T P M R S N E L E T M N L H D Q S D H> VP1 - NB - DHAV3 _> 630 660 690 720 CCAGACTGTCATTTGTGTAATATTTGCAGGAAAATGAAGAGGTGGTCTCGCAACTATCGCCCATTCCGCTTCTGTTTGAGACTTAAAACACTTGCCTTTGAGCTTCATTTGGAAATTGAA P D C H L C N I C R K M K R W S R N Y R P F R F C L R L K T L A F E L H L E I E> VP1 - NB - DHAV3 _> HY 30 60 90 120 GGTGATTCCAACCAGTTGGGGGATGATGAGCCGGTTTGCTTTCTGAATTTTGAGACAGCTAATGTCCCAATACAAGGTGAATCTCACACTCTTGTCAAACACCTGTTTGGGAGGCAATGG G D S N Q L G D D E P V C F L N F E T A N V P I Q G E S H T L V K H L F G R Q W> _ _VP1 - HY - DHAV1 _ _> 150 180 210 240 TTAGTTAGGACTGTGCAACACGCCTCAACTGTGCAAGAGCTCGACCTCCAAGTTCCAGACAGAGGACATGCCTCTCTCATCCGGCTCTTTGCCTATTTCTCTGGAGAGATCATTCTTACC L V R T V Q H A S T V Q E L D L Q V P D R G H A S _ _VP1 - HY - DHAV1 270 300 L I R L F A Y F S G E I I L T> _ _> 330 360 ATTGTCAACAATGGCACTACACCAGCAATGGTAGCACACTCTTATTCTATGGATGACCTCACTTCAGAGTATGCTGTTACAGCAATGGGAGGTGTGATGATTCCTGCTAACAGTGCCAAA I V N N G T T P A M V A H S Y S M D D L T S E Y A _ _ _ _VP1 - HY - DHAV1 390 V T A M G G V M I P A N S A K> > 420 450 480 AATATTTCTGTGCCATTCTACTCTGTGACACCACTCAGGCCAACTCGACCAATTCCTGGCACATCAGAGGCAACTTTTGGCAGACTGTTTATGTGGACTCAATCAGGAAGTCTTTCAGTT N I S V P F Y S V T P L R P T R P I P G T S E A T _ _VP1 - HY - DHAV1 510 F G R L F M W T Q S G S L S V> _ _> 540 570 600 TTTATGGGTCTCAAAAAGCCAGCTCTCTTCTTTCCACTCCCTGCTCCTACCTCCACAACATCATCACGGAGATCCAATGATGCTATTCCCACATTGAATCAGTCTGGGGATGAAGTAGAT F M G L K K P A L F F P L P A P T S T T S S R R S N D A I P T L N Q S G D E V D> _ _VP1 - HY - DHAV1 _ _> 630 660 690 TGTCACTTCTGCGAAATTTGTTCTAAAATGAAGAGGAGGTGGAAGCCAAGAGGGCACTTCAGATTTTGCTTTAGACTCAAAACACTAGCATTTGAACTCAATCTGGAAATTGAA C H F C E I C S K M K R R W K P R G H _ _VP1 - HY F R F C F R L K T L A F E L N L E I E> > - DHAV1 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 62 DH-EG-2000 30 60 90 120 GGTGATTCCAACCAGTTGGGGGATGATGAGCCGGTTTGCTTTCTGAATTTTGAGACAGCTAATGTCCCAATACAAGGTGAATCTCACACTCTTGTCAAACACCTGTTTGGGAGGCAATGG G D S N Q L G D D E P V C F L N F E T A N V P I Q G E S VP1 - DH-EG-2000 - DHAV1 150 H T L V N H L F G S Q W> _ _> 180 210 240 TTAGTTAGGACTGTGCAACACGCCTCAACTGTGCAAGAGCTCGACCTCCAAGTTCCAGACAGAGGACATGCCTCTCTCATCCGGCTCTTTGCCTATTTCTCTGGAGAGATCATTCTTACC L V S T V Q H A S T V Q E L D L Q V P D S G H A S L I R L F A Y F S G E I I L T> _ _VP1 - DH-EG-2000 - DHAV1 _ _> 270 300 330 360 ATTGTCAACAATGGCACTACACCAGCAATGGTAGCACACTCTTATTCTATGGATGACCTCACTTCAGAGTATGCTGTTACAGCAATGGGAGGTGTGATGATTCCTGCTAACAGTGCCAAA _ _VP1 - 390 _> DH-EG-2000 - DHAV1 _ 420 450 480 AATATTTCTGTGCCATTCTACTCTGTGACACCACTCAGGCCAACTCGACCA ATTCCTGGCACATCAGAGGCAACTTTTGGCAGACTGTTTATGTGGACTCAATCAGGAAGTCTTTCAGTT N I S V P F Y S V T P L S P T R P I P G T S E A T VP1 - 510 F G S L F M W T Q S G S L S V> _ _> - DHAV1 540 570 600 TTTATGGGTCTCAAAAAGCCAGCTCTCTTCTTTCCACTCCCTGCTCCTACCTCCACAACATCATCACGGAGATCCAATGATGCTATTCCCACATTGAATCAGTCTGGGGATGAAGTAGAT F M G L N K P A L F F P L P A P T S T T S S R S S N D A I VP1 - DH-EG-2000 - DHAV1 630 P T L N Q S G D E V D> _> 660 690 TGTCACTTCTGCGAAATTTGTTCTAAAATGAAGAGGAGGTGGAAGCCAAGAGGGCACTTCAGATTTTGCTTTAGGCTCAAAACACTAGCATTTGAACTCAATCTGGAAATTGAA C H F C E I C S N M K S S W K P S G H F S F C F S L _ _ VP1 - DH-EG-2000 - DHAV1 N T L A F E L N L E I E> _ _> NC 30 60 90 120 GGTGATTCCAACCAGTTGGGGGATGATGAGCCGGTTTGCTTTCTGAATTTTGAGACAGCTAATGTCCCAATACAAGGTGAATCTCACACTCTTGTCAAACACCTGTTTGGGAGGCAATGG G D S N Q L G D D E P V C F L N F E T A N V P I Q G E S H T L V K H L F G R Q W> _ _VP1 - NC - DHAV1 > 150 180 210 240 TTAGTTAGGACTGTGCAACACGCCTCAACTGTGCAAGAGCTCGACCTCCAAGTTCCAGACAGAGGACATGCCTCTCTCATCCGGCTCTTTGCCTATTTCTCTGGAGAGATCATTCTTACC L V R T V Q H A S T V Q E L D L Q V P D R G H _ _VP1 - NC 270 A S L I R L F A Y F S G E I I L T > DHAV1 > 300 330 360 ATTGTCAACAATGGCACTACACCAGCAATGGTAGCACACTCTTATTCTATGGATGACCTCACTTCAGAGTATGCTGTTACAGCAATGGGAGGTGTGATGATTCCTGCTAACAGTGCCAAA I V N N G T T P A M V A H S Y S M D D L T S E _ _ VP1 - NC 390 Y A V T A M G G V M I P A N S A K> - DHAV1 > 420 450 480 AATATTTCTGTGCCATTCTACTCTGTGACACCACTCAGGCCAACTCGACCAATTCCTGGCACATCAGAGGCAACTTTTGGCAGACTGTTTATGTGGACTCAATCAGGAAGTCTTTCAGTT N I S V P F Y S V T P L R P T R P I P G T S E A T F G R L F M W T Q S G S L S V > _ _VP1 - NC - DHAV1 > 510 540 570 600 TTTATGGGTCTCAAAAAGCCAGCTCTCTTCTTTCCACTCCCTGCTCCTACCTCCACAACATCATCACGGAGATCCAATGATGCTATTCCCACATTGAATCAGTCTGGGGATGAAGTAGAT F M G L K K P A L F F P L P A P T S T T S _ _ VP1 630 S R R S NC - DHAV1 N D A I P T L N Q S G D E V D > _ _> 660 690 TGTCACTTCTGCGAAATTTGTTCTAAAATGAAGAGGAGGTGGAAGCCAAGAGGGCACTTCAGATTTTGCTTTAGACTCAAAACACTAGCATTTGAACTCAATCTGGAAATTGAA C H F C E I C S K M K R R W K P R G H F VP1 - NC R - F C F R L K T L A F E L N L E I E> DHAV1 _ _> Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 63 Hình 4.7 Trình tự Nucleotit axit amin tương ứng vùng gen VP1 chủng virus viêm gan vịt là: DN2, DN1, NB, HY, DHEG-2000 NC Ghi chú: - Dịng trên: Trình tự xắp xếp Nucleotit gen VP1 - Dòng dưới: Trình tự xắp xếp axit amin tương ứng ñược hiển thị chữ qui ñịnh axit amin Sau giải trình tự DNA plasmid tái tổ hợp tách dịng, chúng tơi thu gen kháng nguyên VP1 chủng DN1, DN2 NB có độ dài 720 bp, xác định thuộc genotype III (DHAV-3); gen VP1 chủng HY, DH-EG-2000 NC có độ dài 714 bp xác ñịnh thuộc genotype I (DHAV-1) Sau truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi nucleotide thu nhận, nhận thấy tất chủng cung cấp gen VP1 thuộc virus viêm gan vịt nhóm A (duck hepatitis A), bao gồm hai loại genotype: genotype III (DHAV-3) genotype I (DHAV-1) Bằng phương pháp giám ñịnh phân tử sử dụng gen VP1, ñã xác ñịnh ñược số chủng virus viêm gan cường ñộc chủng virus vacxin DH-EG-2000 có Việt Nam Như có xuất loại genotype: genotype III (DHAV-3) genotype I (DHAV-1) miền Nam miền Bắc Việt Nam 4.6 So sánh ñồng nucleotide, tương ñồng amino acid vùng gen vp1 chủng virus viêm gan vịt cường ñộc nb, dn1, nc chủng virus vacxin dh-eg-2000 Sau giải trình tự vùng gen mã hóa cho protein VP1 chủng virus viêm gan vịt cường ñộc DN1, NB, NC chủng virus vacxin viêm gan vịt nhược độc DH-EG-2000 chúng tơi đưa vào chương trình GeneDoc 2.5 để phân tích đồng thành phần nucleotide tương ñồng amino acid Kết so sánh trình bày Bảng 4.3 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 64 Bảng 4.3 Tỷ lệ (%) ñồng nucleotide (trên ñường chéo) tương ñồng axit amin (dưới ñường chéo) chủng virus viêm gan vịt cường ñộc NB, DN1, NC chủng virus vacxin DH-EG-2000 DHAV-3 Chủng DN1 DN1 DHAV-1 NB 99 NB 99 DH-EG-2000 89 87 NC 89 87 DH-EG- NC 2000 92 92 91 91 99 99 Kết so sánh cho thấy: - Tỷ lệ ñồng nucleotide tương ñồng amino acid chủng genotype cao, cụ thể là: 99% nucleotide 99% amino acid chủng DHAV-3, DN1 NB; 99% nucleotide amino acid chủng DHAV-1 NC DH-EG-2000 - Từng cặp chủng thuộc genotype biểu thống so sánh tỷ lệ ñồng nucleotide tương ñồng amino acid với cặp chủng thuộc genotype khác Cụ thể: 91-92% (nucleotide) 87-89% (amino acid) cặp chủng DN1/NB (DHAV-3) DH-EG-2000/NC (DHAV-1) Hiện nay, genotype II phát có chủng (40G 90D) ðài Loan nên vấn ñề quan tâm dịch tễ học, kháng nguyên vaccine ñối với genotype chưa lớn Ngược lại, xuất DHAV-3 ngày nhiều Trung Quốc, Hàn Quốc, Việt Nam bên cạnh phân bố rộng nhiều quốc gia DHAV-1 ñã làm tăng mối quan tâm vấn ñề phòng chống bệnh viêm gan vịt (ðoàn Thị Thanh Hương, 2010) Sai khác 9% amino acid vùng gen VP1 genotype I III chênh lệch lớn sử dụng vaccine hay chế phẩm chẩn đốn huyết học thuộc DHAV- Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 65 để phịng bệnh chẩn đốn trường hợp DHAV-3 gây ðiều có ý nghĩa chúng tơi so sánh chủng virus cường độc ñang lưu hành với chủng virus nhược ñộc vacxin ñang sử dụng Việt Nam tương quan nucleotide amino acid Sự chênh lệch thành phần amino acid chủng vacxin genotype I với chủng cường ñộc thuộc genotype III khơng cho miễn dịch tốt vịt tiêm phịng loại vacxin có Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 66 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết đạt được, chúng tơi đưa số kết luận sau: ðã phân lập giám ñịnh ñược virus viêm gan vịt cường ñộc mẫu bệnh phẩm thu thập ñược ñàn vịt số địa phương Việt Nam thơng qua kết phân lập phôi vịt kĩ thuật RT-PCR Với hai cặp mồi DHAV3F – DHAV3R DH3F – DH4R, vùng gen VP1 chủng virus viêm gan vịt thu nhận thành cơng phản ứng RT-PCR, cung cấp nguồn gen cho việc nghiên cứu vacxin viêm gan vịt Việt Nam Chuỗi nucleotide gen kháng nguyên VP1 từ virus viêm gan vịt thu nhận vùng ñịa lý khác Việt Nam gen kháng nguyên VP1 từ chủng vacxin nhược ñộc ñang sử dụng Việt Nam có kích thước 720 bp (DHAV-3) 714 bp (DHAV-1) ñã ñược thu nhận lưu giữ plasmid Vùng gen VP1 chủng virus nghiên cứu giải trình trình tự thành cơng chuỗi nucleotide trình tự chuỗi axit amin tương ứng Tại tỉnh phía Nam phía Bắc Việt Nam có lưu hành serotypye virus viêm gan vịt genotype I (DHAV-1) genotype III (DHAV-3) Có khác đồng nucleotide tương ñồng amino acid gen kháng nguyên VP1 chủng virus vaccine DH-EG-2000 thuộc genotype I chủng virus viêm gan vịt cường ñộc phân lập ñược thuộc genotype III 5.2 ðề nghị Cần giám ñịnh sàng lọc thêm nhiều chủng virus viêm gan vịt phân lập Việt Nam, ñặc biệt chủng ñương nhiễm để tìm hiểu có mặt hay khơng DHAV-2 Việt Nam, phát thêm DHAV-3, nhằm bổ sung liệu virus viêm gan vịt Việt Nam Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 67 Cần nghiên cứu giải mã toàn hệ gen số chủng virus viêm gan vịt cường độc phân lập Việt Nam Từ lập phả hệ xem xét mối quan hệ chủng virus cường độc virus vacxin có mặt Việt Nam Việc sản xuất vacxin DHAV-3 phòng bệnh cho vịt Việt Nam giới vấn ñề cấp bách Các nguồn nguyên liệu gen kháng nguyên VP1 mà thu nhận ñược tạo sở liệu sinh học phân tử cho nghiên cứu vacxin hệ Thực tốt khâu vệ sinh phòng bệnh tạo miễn dịch cho ñàn vịt với bệnh viêm gan vịt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO A TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Khánh Ly (2001), Nghiên cứu biến ñổi bệnh lý bệnh viêm gan virus vịt Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 4: tr 48-51 Trần Minh Châu, Lê Thu Hồng (1985), Thăm dị tạo chủng vaccine nhược độc viêm gan vịt chủng phân lập ñịa phương Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 4: tr 3-8 Lê Minh Chí, Hồ ðình Chúc, Bùi Quý Huy (1999), Kết ñiều tra dịch bệnh gia súc, gia cầm tỉnh phía Bắc (1995 - 1997) Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 6(3): tr 75-78 Bùi Thị Cúc (2002), Nghiên cứu biến ñổi bệnh lý ñại thể, vi thể siêu vi thể bệnh viêm gan siêu vi trùng vịt Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Nguyễn ðường, Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Khắc Tuấn, Nguyễn Thị Bích Lộc, Nguyễn Bá Hiên (1990) Vi sinh vật học ñại cương Nhà Xuất Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (2004), Một số vấn ñề miễn dịch thụ ñộng gia súc, gia cầm non, NXB Nơng nghiệp Hà Nội Lê Thanh Hồ (2002), Sinh học phân tử: nguyên lý ứng dụng, Viện công nghệ sinh học, Viện Khoa học công nghệ Việt Nam, (104 trang) Lê Thanh Hoà (2006), Y-Sinh học phân tử, Nhà Xuất Y học, Hà Nội Nguyễn Phục Hưng (2004), Tình hình mắc bệnh viêm gan vịt virus số tỉnh ñồng Bắc bộ, phân lập virus gây bệnh, Nghiên cứu ñặc tính sinh học chủng virus nhược độc viêm gan vịt DH-EG-2000 qui trình sản xuất vaccine Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 69 10 Trần Thị Lan Hương (2007), Phân lập virus gây bệnh viêm gan vịt đàn vịt ni số vùng phụ cận Hà Nội Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 5: tr.13-16 11 ðoàn Thị Thanh Hương (2010), Nghiên cứu giải mã gen hệ gen virus viêm gan vịt phân lập Việt Nam xác định vị trí phân loại Luận văn tiến sỹ hoá sinh học tr 45-65 12 Bùi Thanh Khiết (2007), Nghiên cứu quy trình sản xuất vaccine viêm gan vịt từ chủng virus vaccine nhược ñộc DH-EG-2000 ứng dụng phòng, can thiệp dịch vào thực tế sản xuất, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội 13 Nguyễn ðức Lưu, Vũ Như Quán (2002) Bệnh viêm gan virus vịt Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 9(1): tr 87-90 14 Nguyễn Vĩnh Phước, Hồ ðình Chúc, Nguyễn Văn Hanh, ðặng Thế Huynh (1978), Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc, gia cầm, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 15 Phạm Văn Ty (2007), Virus học Nhà xuất giáo dục B TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 16 Asplin FD (1958), An attenuated strain of duck hepatitis virus Vet Rec 70: 1226-1230 17 Asplin FD (1961), Notes on epidemiology and vaccination for virus hepatitis of ducks Off Int Epizoot Bull 56: 793-800 18 Davis D, Hannant D (1987), Fractionation of neutralizing antibodies in serum of ducklings vaccinated with live duck hepatitis virus vaccine Res Vet Sci 43: 276-277 19 Ding C, Zhang D ( 2007), Molecular analysis of duck hepatitis virus type Virol 361: 9-17 20 Gough RE, Spackman D (1981), Studies with inactivated duck virus hepatitis vaccines in breeder ducks Avian Pathol 10: 471-479 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 70 21 Gough RE, Borland ED, Keymer IF, Stuart JC (1985), An outbreak of duck hepatitis type II in commercial ducks Avian Pathol 14: 227-236 22 Haider SA, Calnek BW (1979), In vitro isolation, propagation, and characterization of duck hepatitis virus typee III Avian Dis 23: 715-729 23 Hwang J (1965), A chicken embryo-lethal-strain of duck hepatitis virus Avian Dis 6: 435-440 24 Feigelstock D, Mateu MG, Valero ML, Andreu D, Domigo E, Palma EL (1996), Emerging foot-and-mouth disease virus variants Antigenic heterogeneity of a foot-and mouth disease virus serotype in the field is mediated by very limited sequence variation at several antigenic sites J Virol 68: 1407-1417 25 Jin X, Zhang W, Zhang W, Gu C, Cheng G, Hu X (2008), Identification and molecular analysis of the highly pathogenic duck hepatitis virus type in Hubei province of China Res Vet Sci 85(3): 595-598 26 Johansson ES, Niklasson B, Tesh R B, Shafren DR, da Rosa APAT, Lindberg A.M (2003), Molecular characterization of M1146, an American isolate of Ljungan virus (LV) reveals the presence of a new LV genotype J Gen Virol 84: 837–844 27 Kim MC, Kwon YK, Joh SJ, Kwon JH, Kim JH, Kim SJ (2007), Development of one-step reverse transcriptase-polymerase chain reaction to detect duck hepatitis virus type Avian Dis 51: 540-545 28 Levine PP, Hofstad MS (1945), Duck disease investigation Annu Rep New York State Vet Coll, Ithaca Vet 40: 71-86 29 Levine P, Fabricant J (1950), A hitherto-undescribed virus disease of ducks in North America Cornell Vet 40: 71-86 30 Reuss RC, Landmann L, Gosert R, Tang BL, Hong W, H.P H, Egger D, Bienz K (1959), Cellular COPII proteins are involved in production of the vesicles that form the poliovirus replication complex J Virol 75: 9808-9818 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 71 31 Stanway G, Brown F, Christian P, Hovi T, Hyypiä T, King AMQ, Knowles NJ, Lemon SM, Minor PD, Pallansch MA, Palmenberg AC, Skern T (2005) Family Picornaviridae, In: Fauquet C.M., Mayo M.A., Maniloff J., Desselberger U., Ball L.A (Eds), Virus Taxonomy Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Elsevier/Academic Press, London 757-778 32 Tseng CH, Knowles NJ, Tsai HJ (2007), Molecular analysis of duck hepatitis virus type indicates that it should be assigned to a new genus Virus Res 123: 190-203 33 Tseng CH, Tsai HJ (2007a), Molecular characterization of a new serotype of duck hep-atitis virus Virus Res 126: 19-31 34 Tseng CH, Tsai HJ (2007b), Sequence analysis of a duck picornavirus isolate indicates that it together with porcine enterovirus type and simian picornavirus type should be assigned to a new picornavirus genus Virus Res 129 1-104 35 Woolcock PR (1998), Duck hepatitis, In: Swayne, D.E., Glisson, J.R., Jackwood, M.W., Pearson, J.E., Reed, W.M (Eds.), A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens, 4th ed American Association of Avian Pathologists, Kennett Square, PA 200-204 36 Woolcock PR (2003), Duck hepatitis, Diseases of Poultry, 11th Ed, Iowa State Press, Ames, IA 343-354 Trang Web tham khảo 37 http://expasy.org/viralzone/all_by_species/33.html 38 http://www.Picornaviridae.com/avihepatovirus/dhav.com 39 http://www.picornastudygroup.com 40 http://www.ncbi.nlm.nih.gov Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 72 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bảng mã di truyền sử dụng cho virus TTT F Phe TCT S Ser TAT Y Tyr TGT C Cys TTC F Phe TCC S Ser TAC Y Tyr TGC C Cys TTA L Leu TCA S Ser TAA * STOP TGA * STOP L Leu TCG S Ser TAG * STOP TGG W Trp CTT L Leu CCT P Pro CAT H His CGT R Arg CTC L Leu CCC P Pro CAC H His CGC R Arg CTA L Leu CCA P Pro CAA Q Gln CGA R Arg CTG L Leu CCG P Pro CAG Q Gln CGG R Arg TTG ATT I Ile ACT T Thr AAT N Asn AGT S Ser ATC I Ile ACC T Thr AAC N Asn AGC S Ser ATA I Ile ACA T Thr AAA K Lys AGA R Arg ATG M Met ACG T Thr AAG K Lys AGG R Arg GTT V Val GCT A Ala GAT D Asp GGT G Gly GTC V Val GCC A Ala GAC D Asp GGC G Gly GTA V Val GCA A Ala GAA E Glu GGA G Gly GTG V Val GCG A Ala GAG E Glu GGG G Gly XXX: Poteltial initiation codon (always encodes fMet) TAA, TAG, TGA: Termination codon Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 73 Phụ lục 2: Bảng kí hiệu 20 axit amin thơng thường Glycin G Gly Asparagin N Asn Alanin A Ala Glutamin Q Glu Valin V Val Phenylalanin F Phe Leucin L Leu Tyrosin Y Tyr Isoleucin I Ileu Tryptophan W Trp Prolin P Pro Aspartat D Asp Serin S Ser Glutamat E Glu Threonin T Thr Lysin K Lys Cystein C Cys Arginin R Arg Methionin M Met Histidin H His Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 74 ... ? ?Khảo sát đặc tính sinh học phân tử số chủng virus viêm gan vịt cường ñộc phân lập ñược ñàn vịt số ñịa phương so sánh với chủng virus vacxin DH – EG – 2000? ?? 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ñề tài - Phân. .. bệnh viêm gan vịt đặc tính sinh học virus viêm gan vịt chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus viêm gan vịt Bệnh viêm gan vịt ñược phát lần ñầu tiên vào năm 1978 mà số. .. lập ñược - So sánh ñặc tính sinh học phân tử số chủng virus viêm gan vịt cường ñộc với chủng virus vacxin DH – EG – 2000 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp