Nghiên cứu so sánh khả năng tạo vi bọt giữa hai phương pháp siêu âm và khuấy cơ

ĐẶT VẤN ĐỀ Vi bọt đã và đang được các nhà bào chế hiện đại đi sâu nghiên cứu và phát triển bởi những ứng dụng rất thiết thực mà nó đem lại, nổi bật trong đó chính là: làm tác nhân tương phản trong siêu âm, hỗ trợ cho các kỹ thuật hình ảnh y tế và sử dụng tác nhân phân phối thuốc tới đích phục vụ cho chẩn đoán, hỗ trợ điều trị và điều trị bệnh trong Y khoa. Trên thế giới, vi bọt được bào chế bằng rất nhiều phương pháp đa dạng như: bay hơi, trùng hợp, phun sấy, siêu âm…và đã cho ra đời rất nhiều chế phẩm tiêm phục vụ trong chẩn đoán và điều trị. Ở nước ta hiện nay, vi bọt còn ít được biết đến, chưa có nghiên cứu về phương pháp bào chế hay ứng dụng của nó trong y học. Từ những vấn đề trên cho thấy yêu cầu cần đặt ra đó là cần nghiên cứu và tìm được những phương pháp bào chế thích hợp để tạo vi bọt. Do vậy, đề tài “Nghiên cứu so sánh khả năng tạo vi bọt giữa hai phương pháp siêu âm và khuấy cơ” được tiến hành với mục đích: 1. Sơ bộ thiết lập được các thông số kỹ thuật tối ưu cho hai phương pháp tạo bọt. 2. So sánh được khả năng tạo vi bọt của hai phương pháp bằng cách đánh giá một số đặc tính của vi bọt.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG TẠO VI BỌT GIỮA

HAI PHƯƠNG PHÁP SIÊU ÂM VÀ KHUẤY CƠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG TẠO VI BỌT GIỮA

HAI PHƯƠNG PHÁP SIÊU ÂM VÀ KHUẤY CƠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Các cán bộ thuộc Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia

Các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên của bộ môn Tổng hợp Hoá Dược, bộ môn Vật lý - Hoá lý, bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội

Và toàn thể các thầy cô giáo trong trường, các phòng ban, thư viện - Trường Đại học Dược Hà Nội

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình vừa qua

Hà Nội ngày 12 tháng 5 năm 2015

Sinh viên Trịnh Phương Thảo

MỤC LỤC MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về vi bọt 2

1.1.1 Những ứng dụng độc đáo của vi bọt 2

1.1.2 Cấu tạo vi bọt 5

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến vi bọt trong quá trình tồn tại 7

1.1.4 Phương pháp bào chế 9

1.2 Một số nghiên cứu về vi bọt trên thế giới 12

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng, nguyên vật liệu và thiết bị 14

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.1.2 Nguyên vật liệu 14

2.1.3 Thiết bị 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.2.1 Khảo sát thông số kỹ thuật tối ưu cho hai phương pháp 14

2.2.2 So sánh khả năng tạo vi bọt của hai phương pháp 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Phương pháp bào chế vi bọt 15

2.3.2 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của hệ vi bọt 16

2.3.3 Phương pháp xử lý hình ảnh bằng phần mềm Image J 18

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 Kết quả khảo sát thông số kỹ thuật tối ưu cho hai phương pháp 19

3.1.1 Kết quả khảo sát thông số kỹ thuật tối ưu cho phương pháp khuấy cơ 19

3.1.2 Kết quả khảo sát thông số kỹ thuật tối ưu cho phương pháp siêu âm 25

3.2 Kết quả so sánh khả năng tạo vi bọt của hai phương pháp 31

3.2.1 Hình thức vi bọt 32

3.2.2 Kích thước và phân bố kích thước vi bọt 32

3.2.3 Thể tích cột bọt 33

3.2.4 Thời gian phân lớp của hệ bọt 34

3.2.5 Độ bền của vi bọt 34

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

PFC: Perflouorocarbon

PVA: Polyvinylalcol

PLGA: Poly (D, L-lactid-co-glycolid)

CEHDA: Phun điện đồng trục

Bảng 3.6: Kết quả về sự thay đổi của vi bọt được tạo bằng hai

9

Bảng 3.7: Kết quả về sự thay đổi của vi bọt được tạo bằng hai

Hình 3.7 Sự thay đổi số lượng vi bọt có đường kính nằm trong

khoảng 1-10μm trên 1 vi trường cố định theo thời gian ở hai phương

8

Hình 3.8 Sự thay đổi đường kính của một vi bọt nhất định theo thời

9

Hình 3.9 Sự thay đổi số lượng vi bọt có đường kính nằm trong

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi bọt đã và đang được các nhà bào chế hiện đại đi sâu nghiên cứu và phát triển bởi những ứng dụng rất thiết thực mà nó đem lại, nổi bật trong đó chính là: làm tác nhân tương phản trong siêu âm, hỗ trợ cho các kỹ thuật hình ảnh y tế và sử dụng tác nhân phân phối thuốc tới đích phục vụ cho chẩn đoán, hỗ trợ điều trị và điều trị bệnh trong Y khoa

Trên thế giới, vi bọt được bào chế bằng rất nhiều phương pháp đa dạng như: bay hơi, trùng hợp, phun sấy, siêu âm…và đã cho ra đời rất nhiều chế phẩm tiêm phục vụ trong chẩn đoán và điều trị Ở nước ta hiện nay, vi bọt còn ít được biết đến, chưa có nghiên cứu về phương pháp bào chế hay ứng dụng của nó trong y học

Từ những vấn đề trên cho thấy yêu cầu cần đặt ra đó là cần nghiên cứu và tìm

được những phương pháp bào chế thích hợp để tạo vi bọt Do vậy, đề tài “Nghiên cứu so sánh khả năng tạo vi bọt giữa hai phương pháp siêu âm và khuấy cơ”

được tiến hành với mục đích:

1 Sơ bộ thiết lập được các thông số kỹ thuật tối ưu cho hai phương pháp tạo bọt

2 So sánh được khả năng tạo vi bọt của hai phương pháp bằng cách đánh giá một số đặc tính của vi bọt

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về vi bọt

1.1.1 Những ứng dụng độc đáo của vi bọt

1.1.1.1 Tác nhân tương phản trong siêu âm

Siêu âm là kỹ thuật hình ảnh được sử dụng rất rộng rãi để chẩn đoán hình ảnh

và hỗ trợ điều trị trong lĩnh vực y học hiện nay Siêu âm có rất nhiều tiện ích như: không xâm lấn nên rủi ro thấp, chi phí thấp và thời gian phù hợp Tuy nhiên, gần đây siêu âm đã bị hạn chế do thiếu các tác nhân tương phản hình ảnh hiệu quả

Tác nhân tương phản được định nghĩa là tác nhân làm thay đổi độ tương phản hình ảnh một cách có ý nghĩa, giúp chẩn đoán phân biệt giữa điều kiện bình thường

và bất thường Một tác nhân tương phản hiệu quả sẽ giúp phân biệt các mô lành và

mô bệnh bằng cách cung cấp những phản âm khác biệt Điều này yêu cầu trở kháng

âm (sức cản âm thanh truyền tới, liên quan tới mật độ mô và vận tốc âm thanh) giữa các mô phải khác nhau Không chỉ có một trở kháng âm kháng biệt đáng kể so với

mô, vi bọt còn cộng hưởng với sóng siêu âm làm tăng phản âm của máu lên đến hơn

10 lần so với các tế bào hồng cầu [22]

Vi bọt có khả năng phản âm cao do mức độ chịu nén ở các cường độ siêu âm khác nhau là lớn hơn nhiều so với bất kỳ chất lỏng hoặc rắn nào khác nên vi bọt có thể cung cấp được cường độ tán xạ cao [22] Hơn nữa khi vi bọt chịu tác động của sóng âm tại một tần số phù hợp, chúng sẽ cộng hưởng âm Và rất may mắn là vi bọt trong phạm vi kích thước micrometer cộng hưởng dải tần số thường dùng trong siêu

âm chẩn đoán thông thường (1-3MHz)

Tác nhân tương phản siêu âm vi bọt có hai đặc tính độc đáo mà không có ở các tác nhân sử dụng trong kỹ thuật chụp X-quang hay chụp cộng hưởng từ Thứ nhất, vì

vi bọt có kích thước lớn hơn 1μm nên chúng bị giới hạn phân bố bên trong không gian mạch máu và chỉ phân bố đúng trong không gian mạch máu Do đó, khi có bất

kỳ một tín hiệu nào nhận được thì chắc chắn đó là tín hiệu đến từ không gian mạch máu Thứ hai, vi bọt có thể bị phá hủy bởi chính sóng siêu âm Chính vì vậy, tác nhân

tương phản vi bọt đã giúp cải thiện đáng kể chất lượng hình ảnh trong siêu âm, thể hiện cụ thể trong các trường hợp sau:

 Hình ảnh buồng tim

Sử dụng các tác nhân tương phản vi bọt để lấp đầy buồng tim đã cho những tín hiệu nổi bật ở khoang thất trái giúp đánh giá chuyển động của nó trong quá trình tâm thu Phân định rõ được biên giới của tâm thất còn giúp đánh giá toàn bộ chức năng tim bằng cách đo phân suất tống máu (tỉ lệ máu trong tâm thất trái được đẩy ra trong một nhịp tim) và theo dõi chuyển động của thành tim hay sự tưới máu của động mạch vành để phát hiện bệnh thiểu năng mạch vành

 Hình ảnh mạch máu

Khi tiến hành chụp ảnh mạch máu, tác nhân tương phản siêu âm vi bọt giúp chúng ta dễ dàng đạt được các mục đích sau:

- Xác định được rằng các mạch máu có bị tắc hay không

- Đánh giá được những bất thường của thành mạch máu: phát hiện các mảng xơ vữa và đánh giá ảnh hưởng của chúng đến lưu lượng dòng máu

- Xác định hướng dòng chảy và vận tốc dòng máu thông qua chu kỳ tim ở trạng thái bình thường

- Thu được những hình ảnh chụp X-quang mạch máu giống như cây mạch máu trong các cơ quan

Một cục máu đông thường rất khó phát hiện vì nó cũng tương tự như máu, điều này làm cho mạch máu nhìn rất bình thường trong khi nó có thể bị tắc hoàn toàn Sử dụng tác nhân tương phản siêu âm, sẽ cho phép chúng ta quan sát rõ ràng vị trí các cục máu đông và thu được hình ảnh bên trong thành động mạch, giúp phát hiện mảng

xơ vữa [17], [30]

 Hình ảnh tưới máu mô

Khả năng nhận biết ra các mô được tưới máu và tình trạng tưới máu mô là vô cùng quan trọng để phát hiện ra các mô bệnh Siêu âm tuy có thể cho phép quan sát

mô cấu trúc của cơ tim và nội tạng thì nó lại không nhạy cảm với những mô thiếu

máu cục bộ, chẳng hạn như trong trường hợp suy mạch vành hay thậm chí là những

mô đang thay đổi trong giai đoạn đầu của tắc mạch cục bộ và nhồi máu mô [29] Sử dụng tác nhân tương phản để lấp đầy mạch máu trong các mô không chỉ giúp phát hiện tắc mạch ngay sau khi nó vừa xảy ra mà còn đánh giá được khả năng tưới máu

số lượng vi tuần hoàn của khối u qua đó đánh giá việc hình thành mạch máu để nuôi khối u [35]

 Hình ảnh phân tử

Việc phát hiện các dấu hiệu đặc trưng cụ thể ở mức phân tử của một bệnh lý nào

đó thì được gọi là hình ảnh phân tử Để làm được điều này, người ta gắn lên vỏ vi bọt một số tác nhân sao cho chúng có khả năng hướng đích là vị trí đang cần có hình ảnh phân tử Khi chúng tập trung tại đó, hình ảnh siêu âm sẽ trở nên rõ nét hơn Chẳng hạn như, khi kết hợp phosphotidylserine vào vỏ lipid, vi bọt sẽ hấp dẫn bạch cầu bắt giữ chúng ngay tại các ổ viêm [20] Vi bọt nhắm đích được tạo ra bằng cách gắn các phối tử thích hợp bao gồm cả kháng thể lên vỏ của chúng thông qua các liên kết hóa trị hoặc qua khớp nối avidin/biotin Các loại mô mục tiêu hay được hướng tới gồm huyết khối, mảng xơ vữa, ổ viêm, khối u Ví dụ, để có được hình ảnh rõ ràng về huyết khối, người ta sử dụng tác nhân tương phản là vi bọt có gắn trên bề mặt các thụ thể GPIIb/IIIa được tìm thấy trên tiểu cầu đã được kích hoạt [26], [36]

1.1.1.2 Tác nhân phân phối thuốc và gen

Không có khả năng cung cấp acid nucleic nhắm tế bào đích bằng một hệ thống phân phối đang là rào cản lớn nhất trong liệu pháp gen Sử dụng kỹ thuật siêu âm kết

hợp với vi bọt đã khắc phục tốt được hạn chế này Gen hướng đích được phân phối bằng cách tiêm đồng thời DNA plasmid và vi bọt có thể mang lại hiệu quả thông qua mức độ biểu hiện của gen, nhưng phương pháp này yêu cầu một lượng lớn DNA kết hợp để có thể định lượng được [1] Do acid nucleic dễ bị nuclease phân giải và nhanh chóng đào thải qua hệ thống lưới nội mô khi được đưa vào trong máu, vì vậy vi bọt

đã được sử dụng làm chất mang để bảo vệ chúng khỏi bị thoái hóa, tăng thời gian lưu thông trong mạch máu, cải thiện tính đặc hiệu của việc phân phối tới đích

Phân phối thuốc tới đích được thực hiện bằng cách kết hợp các phân tử thuốc

và vỏ của vi bọt Khác với các acid nucleic, các phân tử thuốc hiếm khi liên kết tĩnh điện với bề mặt vi bọt, thay vào đó chúng kết hợp cùng lớp vỏ hoặc ngay dưới bề mặt của lớp vỏ hoặc chúng được kết hợp với một chất mang khác có thể liên kết với bề mặt vi bọt Sau khi vi bọt tới đích chúng sẽ bị phá vỡ bởi lực siêu âm và giải phóng thuốc Như vậy, sử dụng vi bọt làm tác nhân phân phối thuốc sẽ mang lại nhiều lợi ích như:

- Bảo vệ dược chất khỏi sự tác động của các enzyme phân hủy thuốc trong máu

- Tăng thời gian lưu thông của thuốc trong máu

- Hạn chế khả năng gây độc cho các mô lành

- Vi bọt bị phá vỡ bởi sóng siêu âm do đó có thể kiểm soát được quá trình giải phóng thuốc

Lớp vỏ có thể được tạo thành từ những thành phần khác nhau, tùy theo bản chất của các thành phần đó mà cơ chế tạo vỏ cũng khác nhau Thông thường, nguyên liệu

để tạo vỏ là những chất có khả năng hoạt động bề mặt như: protein (albumin), lipid (phosphotidylcholin, phosphotidylethanolamine…), polymer (PVA, polycaprolacton…), chất diện hoạt (Tween, Span…)

Mỗi loại vỏ đều có những ưu nhược điểm riêng nhưng nhìn chung vi bọt vỏ lipid có nhiều điểm nổi trội hơn cả Để tạo vỏ, các phân tử phospholipid tự sắp xếp thành một lớp bao xung quanh bọt khí, quay đầu ưa nước ra ngoài và đuôi thân dầu vào trong; các phân tử còn liên kết với nhau rất chặt chẽ nhờ lực Van der Waals giữa các nhóm acyl và do tính kị nước của chúng [16] Những yếu tố này giúp vỏ lipid ổn định hơn do việc hình thành lớp vỏ không phụ thuộc quá nhiều vào phương pháp bào chế Với vi bọt vỏ protein, lớp vỏ phải hình thành nhờ các cầu nối disulfide giữa các nhóm thiol trong quá trình siêu âm Do các phân tử phospholid liên kết với nhau bằng một lực vật lý yếu nên lớp vỏ không chỉ bền mà còn rất linh hoạt, có khả năng đàn hồi cao, đảm bảo khả năng phản âm cho vi bọt Ngoài ra, vật liệu lipid còn tương thích sinh học hơn so với polymer hay chất diện họat Còn vỏ polymer thường dày và cứng hơn vỏ lipid bởi nó được tạo thành nhờ các liên kết ngang, chéo giữa các phân

tử polymer Lớp vỏ dày tuy bền và ổn định hơn nhưng lại làm giảm khả năng cộng hưởng âm ở dải tần số sử dụng trong điều trị [25] Chính vì vậychúng thường được ứng dụng làm tác nhân tương phản trong siêu âm nhiều hơn là phân phối thuốc và gen do lớp vỏ khá bền vững khó bị phá vỡ hơn

1.1.2.2 Lõi khí

Là phần không gian được bao bọc bởi lớp vỏ ngoài Có thể gồm 1 khí hoặc là hỗn hợp của nhiều khí Khi hỗn hợp khí gồm 2 khí thì khí chính được gọi là khí sơ cấp, thường là không khí, đôi khi là N2 Khí còn lại là khí thứ cấp, là 1 tác nhân khí thẩm thấu, khí này ít hòa tan trong máu và huyết thanh và có áp suất riêng phần ở nhiệt độ cơ thể đủ để cung cấp một hiệu lực thẩm thấu mong muốn Khí kết hợp được

dùng để tạo ra sự khác biệt trong áp suất riêng phần và tạo áp suất khí thẩm thấu qua

đó ổn định vi bọt, PFC là khí hay được dùng nhất

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến vi bọt trong quá trình tồn tại

Trong quá trình tồn tại, bản thân vi bọt chịu sự tác động của rất nhiều yếu tố nhưng phải kể đến trước tiên đó là áp lực Laplace ΔP cho bởi:

ΔP = 2 𝜎

𝑟 Trong đó: σ là sức căng bề mặt khí/nước

r là bán kính của vi bọt

Áp lực này càng lớn thì vi bọt càng nhanh chóng bị biến mất, có nghĩa là khi sức căng bề mặt càng lớn và bán kính vi bọt càng nhỏ thì thời thời gian tồn tại của vi bọt càng ngắn Ngoài áp lực Laplace còn có huyết áp, nhiệt độ, độ nhớt môi trường,

pH cũng có những tác động đáng kể tới sự tồn tại của vi bọt

Khi tiêm tác nhân tương phản vi bọt có lõi là không khí làm vào máu, vì không khí hòa tan rất nhanh nên vi bọt nhanh chóng teo nhỏ lại và biến mất Nguyên nhân

là do áp suất không khí trong vi bọt bằng tổng của áp lực Laplace và huyết áp, khi nó lớn hơn áp suất không khí trong máu thì không khí trong vi bọt sẽ nhanh chóng bị thoát ra ngoài Không khí bị thoát ra ngoài, bán kính vi bọt sẽ giảm đồng thời kéo theo lực Laplace tăng, lại càng làm cho khí thoát nhanh hơn, vi bọt sẽ nhanh chóng teo nhỏ và biến mất Để làm chậm tốc độ vi bọt hòa tan trong máu, người ta phải giảm

hệ số phân bố giữa pha khí và pha nước của khí bên trong, bằng cách sử dụng PFC làm một thành phần cho lõi khí

Với vi bọt chỉ chứa khí PFC, khi được tiêm vào máu thì chúng nhanh chóng phồng lên do sự chênh lệch giữa nồng độ không khí hòa tan trong máu và nồng độ không khí trong vi bọt Không khí tràn vào bên trong vi bọt làm chúng tiếp tục phồng lên cho đến khi áp suất riêng phần của không khí bên trong bằng với áp suất không khí của môi trường xung quanh và áp suất riêng phần của PFC bằng tổng của áp lực

Laplace và huyết áp Vì vậy, các nhà khoa học đã có ý tưởng về việc thiết kế vi bọt sao cho áp suất riêng phần của PFC được tính toán một cách chính xác để tương đương với áp lực Laplace và huyết áp[14], [28]

Quá trình biến mất hay hòa tan của vi bọt có chứa không khí và một khí ổn định thẩm thấu khi lưu thông trong máu có thể được mô tả qua các giai đoạn như sau:

- Giai đoạn 1: do nồng độ không khí bên trong vi bọt thấp hơn rất nhiều so với nồng

độ không khí trong máu nên chúng nhanh chóng phồng lên do không khí tràn vào bên trong Tốc độ phồng lên của vi bọt phụ thuộc vào sức căng bề mặt lớp vỏ, tỉ

lệ khí ổn định thẩm thấu ban đầu, huyết áp, và mức độ trao đổi khí oxy của máu

- Giai đoạn 2: khí ổn định thẩm thấu khuếch tán ra khỏi vi bọt cũng do chênh lệch nồng độ giữa bên trong và bên ngoài vi bọt, nên vi bọt bị teo nhỏ lại

- Giai đoạn 3: khi vi bọt teo nhỏ lại, áp lực Laplace tăng lên cao kết hợp với huyết

áp làm cho áp suất thẩm thấu tăng mạnh, nên các khí ổn định thầm thấu sẽ ngưng

tụ thành chất lỏng để kéo dài thời gian tồn tại của vi bọt

Muốn kéo dài tuổi thọ vi bọt đồng nghĩa với việc phải kéo dài khoảng thời gian

mà trong đó vi bọt vẫn ổn định về kích thước và độ bền Chẳng hạn vi bọt tối thiểu phải tồn tại được trong một khoảng thời gian đủ để tiến hành siêu âm khi nó được sử dụng làm tác nhân tương phản Có rất nhiều giải pháp để giải quyết vấn đề này nhưng điều được cân nhắc trước tiên vẫn là việc lựa chọn thành phần cho lõi khí và lớp vỏ ngoài

Chọn lựa nguyên liệu làm lớp vỏ được xem xét kỹ càng vì nó quyết định độ bền, tính đàn hồi của vi bọt nên ảnh hưởng trực tiếp tới thời gian tồn tại, khả năng cộng hưởng âm của vi bọt Lớp vỏ tạo ra phải vừa bền vững, vừa linh hoạt, có khả năng co giãn tốt để đảm bảo tính phản âm cho vi bọt Khi sử dụng các chất có khả năng hoạt động bề mặt, sức căng bề mặt càng nhỏ thì áp lực Laplace càng nhỏ do đó vi bọt tồn tại được lâu hơn và ngược lại Các thành phần để tạo vỏ ngoài tốt nhất là những chất

dễ chuyển hóa, dễ bài tiết và có rất ít tác dụng phụ, tương thích sinh học, hay tốt hơn nữa là có thể vô trùng được bằng nhiệt và có thời gian sử dụng lâu dài

Đối với phần lõi khí, thành phần và tỉ lệ các khí dùng để đưa vào bên trong vi bọt cũng được cân nhắc và tính toán kỹ lưỡng Thông thường khí kết hợp hay khí thứ cấp phải đáp ứng được hai yêu cầu là: phải có hệ số Ostwald thấp (<10-4) và áp suất hơi bão hòa ở nhiệt độ cơ thể phải tương đối cao (>3.104 Pa), khi đó tuổi thọ của vi bọt sẽ được gia tăng đáng kể Các PFC chính là lựa chọn lý tưởng có thể đáp ứng được các yêu cầu trên, ngoài ra khi vi bọt bị hòa tan các khí này còn được bài tiết ra dưới dạng nguyên vẹn qua đường thở mà không gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người

1.1.4 Phương pháp bào chế

Với mục đích tạo ra những hệ vi bọt bền vững, ổn định về kích thước, phân bố kích thước hẹp, tuổi thọ lâu dài và tương thích về sinh học, đã có rất nhiều phương pháp bào chế được phát triển Điển hình như các phương pháp: bay hơi dung môi nhũ tương, phun sấy, siêu âm, khuấy tốc độ cao, màng nhũ hóa, hệ vi dẫn

1.1.4.1 Siêu âm

Đây là phương pháp phổ biến nhất được sử dụng, vi bọt được tạo thành bằng cách phân tán pha khí hoặc pha lỏng vào dung dịch chứa nguyên liệu tạo vỏ thích hợp với lực siêu âm ở cường độ cao [4], [32], [38] Người ta cho rằng có hai nguyên tắc

cơ bản trong phương pháp này [31] Thứ nhất, các chất khí hoặc chất lỏng được phân tán để tạo thành một hệ vi giọt hoặc vi bọt, sau đó các vật liệu bao phủ như protein hoặc chất diện hoạt tự động hấp phụ lên bề mặt chúng Thứ hai, nhiệt độ và áp suất cao làm thay đổi cấu trúc hóa học của lớp vỏ bề mặt nên cải thiện độ ổn định của vi bọt hoặc vi giọt Kích thước bọt và phân bố kích thước bọt tạo thành phụ thuộc vào tần số, năng lượng và xung của chế độ siêu âm [10] Nhìn chung phân bố kích thước bọt được tạo thành bằng phương pháp này thường tương đối rộng, vì thế trước khi đem sử dụng cần phải được phân loại để loại bỏ những bọt lớn có thể gây tắc mạch

[21]

1.1.4.2 Bay hơi dung môi

Đây cũng là một phương pháp tương đối phổ biến đặc biệt hay áp dụng với các loại vi bọt sử dụng polymer làm lớp vỏ ngoài Tiến hành bằng cách nhũ hóa dung dịch polymer (được hòa tan trong một loại dung môi thích hợp) thành nhũ tương bởi các lực cơ học như: khuấy đảo, chia cắt mạnh [2], [12]; trong đó có sử dụng một chất không hòa tan polymer và không đồng tan với nước làm chất ổn định Dung môi hòa tan polymer phải là chất dễ bay hơi, khi bay hơi dung môi polymer sẽ kết tủa trên bề mặt các vi giọt nhũ tương tạo nên các vi cầu (microspheres) Các vi cầu được rửa sạch để loại dung môi dư thừa sau đó đem đông khô để sản xuất vỏ vi bọt

Đối với phương pháp này, phân bố kích thước vi bọt chủ yếu phụ thuộc vào kích thước của các hạt nhũ tương và bất kỳ sự chia cắt hay hợp nhất nào của vi cầu ở các giai đoạn tiếp theo

1.1.4.4 Màng nhũ hóa

Vi bọt được tạo ra bằng cách đẩy hỗn hợp chứa nhiều thành phần đi qua một màng xốp một hoặc nhiều lần, tạo thành các giọt lỏng [13] Sau đó cũng tiến hành các bước tiếp theo như phương pháp bay hơi dung môi để tạo vi bọt, hoặc có thể tạo

ngay vi bọt bằng cách sử dụng khí tạo lõi cho vi bọt như một pha phân tán [19]

Ưu điểm của phương pháp này đó là kiểm soát kích thước vi bọt tốt hơn, phân

bố kích thước hẹp hơn rất nhiều so với phương pháp siêu âm hay bay hơi dung môi [18] Và quan trọng hơn là số lượng vi bọt tạo thành không bị giảm theo thời gian hay

khối lượng của hỗn hợp các thành phần tạo vi bọt Kích thước cũng như phân bố kích thước của hệ vi bọt phụ thuộc nhiều vào đặc điểm của các lớp màng (phân bố kích

thước lỗ màng, độ xốp của màng) [15]

1.1.4.5 Phun sấy kiểm soát bằng điện trường

Đây là kỹ thuật được sử dụng nhằm cải thiện tính đồng nhất của vi bọt được tạo

ra [19] Các vi bọt được tạo thành từ một vòi phun bằng thép không gỉ (đường kính đầu phun 20-50μm) được cung cấp dịch phun trong buồng phun có nhúng một điện cực Bằng cách thay đổi điện thế của điện cực, xung áp suất sẽ được tạo ra trong lòng dịch phun, với mỗi xung áp suất một giọt chất lỏng sẽ được đẩy ra khỏi vòi phun và dịch phun lại được tiếp tục hút vào buồng phun Để thu được các vi giọt, có thể phun trực tiếp vào không khí hoặc phun chìm vào trong một môi trường lỏng

Ưu điểm của phương pháp này là có thể kiểm soát được kích thước giọt bằng cách thay đổi chế độ phun và không đòi hỏi áp suất cao để tạo giọt như là với phương pháp màng nhũ hóa [19]

Cho đến nay phương pháp này chỉ được sử dụng để tạo ra các hạt chứa chất lỏng, ví dụ như paclitaxel được bao bọc trong lớp vỏ polylactiddecolglycolide [24]

hoặc vi cầu chứa dung môi dễ bay hơi có thể loại bỏ để tạo thành vi bọt

1.1.4.6 Phun điện đồng trục (CEHDA)

Đây là kỹ thuật gần đây mới áp dụng để tạo vi bọt, trong đó một dòng dịch lỏng được đưa vào trong buồng phun dưới sự kiểm soát của một điện trường tương tự như

kỹ thuật phun sấy Sau đó phun tạo thành các giọt nhỏ được giữ trong một hệ treo nhờ các kim phun đồng trục khác Để bào chế vi bọt, kim bên trong cung cấp khí còn kim bên ngoài cung cấp dịch có vật liệu bao ngoài mong muốn

Nhờ thay đổi tỉ lệ pha khí, pha lỏng hay điện áp cung cấp cho đầu kim phun mà kích thước và độ đồng nhất của vi bọt tạo thành có thể được kiểm soát [7] Đường kính vi bọt giảm bằng cách giảm tỉ lệ khí, tăng điện áp hay giảm đường kính của đầu kim phun [11]

Ưu thế của phương pháp này so với kỹ thuật phun sấy đó là có thể cung cấp ngay khí cho lõi vi bọt chỉ trong một bước mà không cần các bước xử lý tiếp theo và cho phép tạo ra các vi bọt có vỏ đa lớp bằng cách tăng số lượng dòng chất lỏng

Vi bọt vỏ phospholipid có kích thước 6,6 ± 2,5μm được chế tạo bằng phương pháp này đã ổn định hơn 2,5h ở nhiệt độ phòng [7] Vi bọt vỏ polymer chứa chất lỏng cũng đã được bào chế thành công [6], [23]

1.1.4.7 Hệ vi dẫn (Microfluidic)

Kỹ thuật hệ vi dẫn được sử dụng để tạo ra vi bọt có kích thước được kiểm soát một cách chính xác và thường áp dụng với các vi bọt vỏ polymer Thành phần khí tạo lõi được cung cấp nhờ một kênh mao dẫn, sau khi đi vào dung dịch polymer chứa bên trong một kênh mao dẫn đồng trục khác sẽ được bao bọc lại, tạo thành vi bọt Thông thường pha khí thường được tiêm vào pha dầu nhờ một kim đồng trục khác, khí trong pha dầu sau khi thoát ra khỏi đầu mao dẫn sẽ đi vào dung dịch polymer để tạo một hệ phân tán có chứa có vi bọt có cấu trúc lõi khí và vỏ trong pha nước Vi bọt vỏ polymer thu được sau đó sẽ được làm sạch bằng cách bay hơi dung môi

Một cách tiếp cận khác tương tự cũng đã được sử dụng để tạo vi bọt nhiều lớp với một nhũ tương kép và thiết bị hệ vi dẫn đồng trục hoặc kết hợp hai mô hình hệ vi dẫn khác nhau: dòng chảy tập trung và giao nhau hình chữ T [34], [37] Kích thước

vi bọt có thể được kiểm soát nhờ tốc độ dòng chảy, độ nhớt của chất lỏng, áp suất của dòng khí và kích thước các đầu kim hệ vi dẫn

Có thể tạo các vi bọt đa thành phần bằng cách kết hợp các thành phần này vào pha dầu để tạo lớp vỏ trong cùng Phương pháp bào chế này rất thuận lợi để nghiên cứu số lượng vi bọt ổn định dựa vào bán kính và độ dày vỏ Tuy nhiên so với các phương pháp khác thì phương pháp hệ vi dẫn có năng suất tương đối thấp

1.2 Một số nghiên cứu về vi bọt trên thế giới

Các sản phẩm thương mại về vi bọt xuất hiện đầu tiên trên thế giới vào những năm

1990 ở châu Âu và Hoa Kỳ đó là Echovist (Schering AG, Đức) và Alnunex (Hoa Kỳ)

Echovist gồm các vi tinh thể galactose đóng vai trò là mầm mống hình thành nên các

vi bọt không khí lơ lửng trong nước [33], còn Albunex gồm các vi bọt không khí có

vỏ là protein biến tính của con người [8] Các dạng vi bọt này đã được sử dụng, tuy nhiên chúng không đủ ổn định để vượt qua các lòng mao mạch phổi và đến được tâm thất khi tiêm tĩnh mạch Thời gian bán thải của chúng chỉ được tính bằng giây nên việc sử dụng các dạng sản phẩm này là có giới hạn Schering sau đó đã phát triển Levovist bằng cách bổ sung thêm acid palmitic, lớp vỏ của vi bọt được hình thành sau khi được khuấy mạnh, đồng thời cũng tăng tính ổn định của vi bọt [9], [27] Nối

tiếp sau đó là sự ra đời của hàng loạt các sản phẩm khác nhau như:

- Optisona: vỏ albumin người, lõi khí perfluoropropane

- Sonovuea: vỏ albumin người và lõi khí SF6

- PESDA: vỏ phospholipid đơn lớp và lõi khí Perluorobutane

- Quantison: lõi không khí và vỏ albumin

- Definty: lõi khí Perfluoropropane, vỏ albumin khô hoặc vỏ phospholipid đơn lớp Năm 2005, Cui và các cộng sự đã mô tả quá trình tạo vi bọt PLGA từ một nhũ tương kép bằng phương pháp bay hơi dung môi [5] Kích thước khảo sát bằng máy đếm Coulter cho kết quả đường kính nằm trong khoảng 1-2μm Sử dụng kính hiển vi điện tử quét, cho thấy vi bọt tạo thành là những hạt hình cầu có bề mặt nhẵn không

bị thủng hoặc có các lỗ hổng

Năm 2005, Cavalieri và cộng sự mô tả phương pháp tạo vi bọt với vật liệu bao ngoài là PVA [3].Bằng cách khuấy tốc độ cao (8000 vòng/phút) dung dịch đã được

xử lý của PVA, vi bọt sẽ được tạo nên nhờ các liên kết hóa học ngang giữa các phân

tử PVA ngay trên bề mặt phân cách pha lỏng là pha khí Đường kính trung bình vi bọt nằm trong khoảng 6±1μm Độ dày của lớp vỏ ngoài có thể được giảm từ 0,9μm xuống 0,7μm bằng cách giảm nhiệt độ quá trình bào chế xuống 4oC Vi bọt PVA được tạo ra bằng phương pháp này đã có hạn sử dụng trong vài tháng và có khả năng vận chuyển thuốc kỵ nước, gen hoặc các phối tử hướng đích

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

USP

Thái Dương

TCCS

2.1.3 Thiết bị

Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng

3 Máy khuấy tốc độ cao UNDRIVER X 1000 Đức

5 Kính hiển vi gắn camera Nikon Eclipse Ci-L Đức

6 Cốc có mỏ, pipet, lam lính, lá kính… Việt Nam

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát thông số kỹ thuật tối ưu cho hai phương pháp

Khảo sát sự ảnh hưởng của các thông kỹ thuật đến quá trình bào chế vi bọt và chất lượng hệ bọt, từ đó lựa chọn các thông số tối ưu

 Phương pháp siêu âm:

- Cường độ siêu âm

- Thời gian siêu âm

- Xung siêu âm

 Phương pháp khuấy cơ học:

- Thời gian khuấy

- Tốc độ quay của roto

Sự ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật đến quá trình tạo bọt được đánh giá thông qua các chỉ tiêu:

 Hình thức vi bọt

 Kích thước và phân bố kích thước vi bọt

 Thể tích cột bọt

 Thời gian phân lớp của hệ bọt

2.2.2 So sánh khả năng tạo vi bọt của hai phương pháp

Sau khi lựa chọn được các thông số kỹ thuật tối ưu, tiến hành tạo vi bọt bằng hai phương pháp theo các thông số đó, rồi so sánh khả năng tạo bọt của hai phương

pháp bằng cách đánh giá và so sánh các chỉ tiêu:

 Hình thức vi bọt

 Kích thước và phân bố kích thước vi bọt

 Thể tích cột bọt

 Thời gian phân lớp của hệ bọt

 Độ bền của vi bọt theo thời gian

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế vi bọt

2.3.1.1 Chuẩn bị dịch tạo bọt

- Cân pha nước: 0,1g poloxamer 188 và 0,1g cremophor A25

- Cân pha dầu: 0,1g glycerolmonostearat

- Pha nước: hòa tan vào 30ml H2O trong cốc có mỏ, ngâm trong bể cách thủy ở

65oC trong 2 phút

- Pha dầu: cho vào cốc có mỏ, ngâm trong bể cách thủy ở 60oC trong 2 phút

- Đổ pha nước vào pha dầu, đặt đầu dò chìm sâu trong lòng dịch rồi tiến hành siêu

âm phân tán với cường độ siêu âm I= 20%, xung siêu âm 01/00 (s/s) trong thời gian 5 phút

- Để nguội dịch tạo bọt về nhiệt độ phòng

2.3.1.2 Tạo vi bọt

 Tạo vi bọt bằng phương pháp khuấy cơ học

- Cho 15ml dịch tạo bọt vào ống ly tâm Cố định ống ở một ví trí nhất định

- Đuổi không khí: Sục khí N2 trong 1 phút, sau đó nâng đầu ống dẫn khí N2 lên khỏi

bề mặt dịch tạo bọt Cố định lưu lượng khí N2

- Hạ bộ phận trục khuấy xuống ống ly tâm sao cho mặt phẳng dưới của trục cách

bề mặt dịch tạo bọt 3cm, cài đặt thông số máy và bắt đầu tạo bọt

- Sau khi tạo bọt xong, đổ dịch đã tạo bọt vào một ống nghiệm thủy tinh để tiến hành các bước đánh giá

 Tạo vi bọt bằng phương pháp siêu âm

- Cho 15ml dịch tạo bọt vào cốc có mỏ 50ml Cố định cốc trên giá tại một vị trí

- Đuổi không khí: Sục khí N2 trong 1 phút, sau đó nâng đầu ống dẫn khí N2 lên khỏi

bề mặt dịch tạo bọt Cố định lưu lượng khí N2

- Đặt đầu dò của máy siêu âm sâu tiếp xúc với bề mặt dịch tạo bọt Cài đặt thông

số máy rồi bắt đầu quá trình tạo bọt

- Sau khi tạo bọt xong, đổ dịch đã tạo bọt vào một ống nghiệm thủy tinh để tiến hành các bước đánh giá

2.3.2 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của hệ vi bọt

2.3.2.1 Hình thức vi bọt: quan sát vi bọt trong tiêu bản qua kính hiển vi

2.3.2.2 Kích thước và phân bố kích thước vi bọt

Các bước tiến hành:

- Chuẩn bị mẫu: Sau khi tạo bọt, tại thời điểm t= 10 phút, hút dịch chứa bọt tại một

vị trí cố định đã chọn trong ống nghiệm rồi nhỏ lên tiêu bản, đem soi trên kính hiển vi kết nối camera ở vật kính 40, chụp và lưu hình ảnh

- Xử lý hình ảnh: sử dụng phần mềm hỗ trợ Image J

- Xử liệu thống kê dữ liệu về đường kính của vi bọt trong ảnh

Đánh giá:

 Kích thước: đường kính trung bình của vi bọt

 Phân bố kích thước: đường kính trung bình ± 2SD (độ lệch chuẩn)

95,45% vi bọt có kích thước nằm trong khoảng này

2.3.2.3 Thể tích cột bọt: Thể tích cột bọt tạo thành được tính theo công thức:

V= V1–V0

Trong đó: V là thể tích cột bọt (ml)

V1 là thể tích dịch sau khi mới tạo bọt xong (ml)

V0= 15ml là thể tích dịch tạo bọt ban đầu

2.3.2.4 Thời gian phân lớp của hệ bọt

Thời gian phân lớp của hệ bọt được tính kể từ khi đổ dịch vừa tạo bọt vào ống nghiệm thủy tinh sau đó đậy kín đến khi dịch này phân thành 2 lớp rõ rệt, phía trên là

bọt trắng còn ở dưới là lớp dịch trong (xem Phụ lục 1)

2.3.2.5 Phương pháp đánh giá độ bền của vi bọt

 Đánh giá sự thay đổi của vi bọt khi giữ trong tiêu bản

Cách tiến hành:

- Chuẩn bị mẫu: Sau khi tạo bọt, tại thời điểm t= 10 phút, hút dịch chứa bọt tại một

vị trí cố định đã chọn trong ống nghiệm rồi nhỏ lên tiêu bản

- Đem soi trên kính hiển vi kết nối camera ở vật kính 40, giữ nguyên tại một vi trường cố định

- Chụp ảnh vi trường tại các thời điểm cố định và xử lý hình ảnh đã ghi bằng phần mềm Image J

Đánh giá:

- Đánh giá được sự thay đổi về kích thước của một vi bọt cố định đã chọn

- Sự thay đổi về số lượng vi bọt có kích thước nằm trong khoảng cho phép 10μm) theo thời gian

(1- Đánh giá sự thay đổi của vi bọt khi giữ trong ống nghiệm

Cách tiến hành:

- Chuẩn bị mẫu: tại các thời điểm cố định, lắc đều ống nghiệm, hút dịch bọt ở một

vị trí cố định đã chọn nhỏ lên tiêu bản

- Đem soi trên kính hiển vi kết nối camera ở vật kính 40

- Chụp hình ảnh vi trường, xử lý hình ảnh đã ghi bằng phần mềm Image J

Đánh giá: Đánh giá sự thay đổi số lượng vi bọt có kích thước nằm trong khoảng cho

phép (1-10μm) theo thời gian

2.3.3 Phương pháp xử lý hình ảnh bằng phần mềm Image J

Phần mềm Image J được có khả năng đếm tất cả số điểm ảnh trên hình ảnh và tính được diện tích mỗi điểm ảnh đó Với hình ảnh chụp được trên kính hiển vi, mỗi điểm ảnh là 1 vi bọt Từ diện tích của mỗi vi bọt, chúng ta sẽ tính ra đường kính của

mỗi vi bọt theo công thức:

d= √𝑠/3.14 ×2×0,34 Trong đó: S là diện tích vi bọt (pixel)

d là đường kính vi bọt (μm) 0,34 là hệ số quy đổi: 1pixel= 0,34μm

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả khảo sát thông số kỹ thuật tối ưu cho hai phương pháp

3.1.1 Kết quả khảo sát thông số kỹ thuật tối ưu cho phương pháp khuấy cơ

3.1.1.1 Tốc độ quay của roto

Để nghiên cứu ảnh hưởng đến quá trình tạo bọt và chất lượng hệ bọt, tiến hành tạo vi bọt bằng phương pháp khuấy cơ ở các tốc độ quay của roto (n) khác nhau:

5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 vòng/phút trong thời gian 3 phút theo mục 2.3.1

và tiến hành đánh giá theo mục 2.3.2 thu được kết quả trong bảng 3.1