Nghiên cứu chiết tách cao neem từ lá của cây neem ấn độ bằng các hệ dung môi khác nhau và bước đầu nghiên cứu ứng dụng trong dược – mỹ phẩm – thuốc bảo vệ thực vật đề tài nghiên cứu khoa học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA-VŨNG TÀU BÁO CÁO ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CAO NEEM TỪ LÁ CÂY NEEM ẤN ĐỘ BẰNG CÁC HỆ DUNG MÔI KHÁC NHAU VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA-VŨNG TÀU

BÁO CÁO

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CAO NEEM TỪ LÁ CÂY NEEM

ẤN ĐỘ BẰNG CÁC HỆ DUNG MÔI KHÁC NHAU VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG TRONG THUỐC BẢO VỆ

THỰC VẬT

Chủ nhiệm: Phạm Thị Kim Hai Hướng dẫn khoa học: TS Tống Thị Minh Thu

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT i

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH iii

DANH MỤC SƠ ĐỒ iv

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 4

1.1 Giới thiệu về cây Neem 4

1.1.1 Định danh 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái 4

1.1.3 Nguồn gốc và sự phân bố 5

1.1.4 Giá trị và công dụng 5

1.2 Các chất có hoạt tính sinh học trong cây Neem 7

1.2.1 Diterpenoid 8

1.2.2 Triterpenoid (limonvgoid) 8

1.3 Tác động của các hoạt chất trong cây Neem đối với các loài dịch hại

11

1.4 Cơ sở hóa học thuốc bảo vệ thực vật và công nghệ sản xuất thuốc bảo vệ thực vật 12

1.4.1 Hoạt chất 12

1.4.2 Chất mang 12

1.4.3 Chất hoạt động bề mặt 12

1.4.4 Các chất phù trợ 13

1.4.5 Các dạng thuốc bảo vệ thực vật 13

1.4.6 Phân loại thuốc bảo vệ thực vật 14

1.5 Công trình nghiên cứu, phương pháp chiết tách và phối phẩm 15

1.5.1 Trên thế giới 15

1.5.2 Trong nước 17

1.6 Phương pháp thử hoạt tính khuẩn 18

1.6.1 Staphylococcus aureus (Gr +) 18

1.7.2 Các phương pháp hiện đại 24

1.8 Hoạt tính kháng oxi hóa của cao Neem [21] 25

1.9 Một số phương pháp định tính, định lượng cao Neem 25

1.9.1 Phương pháp định tính bằng các phản ứng và thuốc thử 25

1.9.2 Phương pháp phân tích trọng lượng 28

1.9.3 Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) 29

1.9.4 Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ (LC – MS) 30

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 32

2.1 Địa điểm và nguyên vật liệu 32

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 32

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 32

2.1.3 Dụng cụ - thiết bị và hóa chất 32

2.2 Phương pháp nghiên cứu 33

2.2.1 Lý thuyết 34

2.2.2 Thực nghiệm 34

2.2.3 Quy trình chiết tách dịch chiết lá Neem 34

2.3 Mô hình chiết tách thực nghiệm tại phòng thí nghiệm 37

2.3.1 Ngâm dầm 37

2.3.2 Soxhlet 37

2.4 Phương pháp cô quay chân không tuần hoàn 37

2.5 Xác định thành phần hóa học từ cao lá Neem bằng phương pháp GC/MS, LC/MS 38

2.6 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình chiết 38

2.6.1 Xác định ảnh hưởng của thời gian chiết 38

2.6.2 Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 39

2.7 Định tính một số hợp chất có trong lá Neem 39

2.7.1 Định tính Flavonoid 39

2.7.2 Định tính Alkaloid 39

2.7.3 Định tính saponin 40

2.7.4 Định tính Cacbonhyđrat 40

2.8 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá Neem 41

2.9 Xác định hoạt tính kháng oxi hóa của cao Neem 43

2.10 Cách pha thuốc trừ sâu 44

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

3.1 Kết quả khối lượng cao Nem khi chiết bằng các hệ dung môi khác nhau 45

3.1.1 Cao Neem được chiết bằng dung môi Hexan 45

3.1.2 Cao Neem được chiết bằng dung môi Chloroform 46

3.1.3 Cao Neem được chiết bằng dung môi Ethanol 96o 47

3.1.4 Cao Neem được chiết bằng dung môi Methanol 47

3.1.5 Cao Neem được chiết bằng dung môi Ethyl acetat 48

3.1.6 Cao Neem được chiết bằng dung môi Nước 49

3.1.7.So sánh khối lượng cao Neem khi chiết với các hệ dung môi khác nhau 50

3.2 Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao Neem 51

3.2.1 Cao Neem được chiết bằng dung môi Hexan 51

3.2.2 Cao Neem được chiết bằng dung môi Chloroform 52

3.2.3 Cao Neem được chiết bằng dung môi Ethanol 96o 53

3.2.4 Cao Neem được chiết bằng dung môi Methanol 54

3.2.5 Cao Neem được chiết bằng dung môi Ethyl Axetat 55

3.2.6 Nước 55

3.3 Hoạt tính chống oxi hóa của cao Neem 57

3.4 Kết quả kháng khuẩn của cao Neem 58

3.4.1 Cao Neem được chiết bằng dung môi Hexan 58

3.4.2 Cao Neem được chiết bằng dung môi Chloroform 60

3.4.3 Cao Neem được chiết bằng dung môi Ethanol 96o 62

3.4.4 Cao Neem được chiết bằng dung môi Methanol 64

3.4.5 Cao Neem được chiết bằng dung môi Ethyl acetate 66

3.4.6 Cao Neem được chiết bằng dung môi Nước 69

3.5 Thành phần hóa học có trong cao chiết 70

3.5.1 Xác định thành phần hóa học có trong cao lá Neem chiết với n – hexan

3.5.3 Xác định thành phần hóa học có trong cao lá Neem chiết với Methanol

76

3.6 Kết quả thử nghiệm trên sâu 78

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79

4.1 Kết luận 79

4.2 Kiến nghị 80

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

MHA: Mueller Hinton Agar - Môi trường thạch Mueller Hinton

MYP Mannitol Egg Yolk Polymixin

NB: Nutrient Agar

PDA: Potato Dextrose Agar Môi trường dinh dưỡng PDA

rpm: tốc độ vòng/ phút

RNA: Acid ribonucleic

Te: thuốc kháng sinh Tetracycline

TSB: Tryptone Soy Broth - Môi trường dinh dưỡng TSB

TT: Thuốc thử

Bảng 1 1: Hoạt tính dược liệu các chất trong Neem 6 Bảng 1.2: Các thương phẩm thuốc trừ sâu từ Neem đang lưu hành trên thị trường Việt

Nam 14

Bảng 2.1: Độ phân cực và nhiệt độ sôi của các hệ dung môi khác nhau 47

Bảng 3 1: Khối lượng cao Neem khi chiết tách với Hexan bằng 2 phương pháp khác nhau 45

Bảng 3.2: Khối lượng cao Neem khi chiết tách với Chloroform bằng 2 phương pháp

Bảng 3.16: Kết quả hoạt tính chống oxi hóa của cao Neem 57 Bảng 3.17: Đuờng kính vòng kháng khuẩn của cao Neem với dung môi Hexan (mm)

Bảng 3.25: Bảng định danh một số cấu tử trong cao chiết Ethanol 96o từ lá Neem 77

Hình 1.1: Bộ phận của cây Neem 4

Hình 1.2: Neem tricyclic diterpene 8

Hình 1.3: Nhóm protomelicin 9

Hình 1.4: Limonoid với 4 vòng nguyên và chuỗi bên γ – hydroxybutenolid 9

Hình 1.5: Azadirone 10

Hình 1.6: Gedunin và dẫn xuất 10

Hình 1.7: Salannin 10

Hình 1.8: Nimbin 11

Hình 1.9: Azadirachtin A 11

Hình 1.10: Vi khuẩn Staphylococus trên kính hiển vi 20

Hình 1.11: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi 22

Hình 2.1: Lá Neem tươi 32

Hình 2.2: Lá Neem khô 37

Hình 2.3: Mô hình ngâm dầm 37

Hình 2.4: Mô hình chiết tách tại phòng thí nghiệm 37

Hình 2.5: Thiết bị cô quay chân không tuần hoàn 38

Hình 2.6 Mô tả vòng kháng khuẩn 43

Hình 3.1: Biểu đồ khối lượng cao Neem khi chiết tách với Hexan bằng 2 phương pháp khác nhau 45

Hình 3.2: Biểu đồ khối lượng cao Neem khi chiết tách với Chloroform bằng 2 phương pháp khác nhau 46

Hình 3.3: Biểu đồ khối lượng cao Neem khi chiết tách với Ethanol 96o bằng 2 phương pháp khác nhau 47

Hình 3.4: Biểu đồ khối lượng cao Neem khi chiết tách với Methanol bằng 2 phương pháp khác nhau 48

Hình 3.5: Biểu đồ khối lượng cao Neem khi chiết tách với Ethyl acetat bằng 2 phương pháp khác nhau 49

Hình 3.6: Biểu đồ khối lượng cao Neem khi chiết tách với Nước bằng 2 phương pháp khác nhau 50

Hình 3.7: Định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Hexan 52

Hình 3.8: Định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Chloroform 53

Hình 3.9: Định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Ethanol 96o 53

Hình 3.10: Định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Methanol 54

Hình 3.11: Định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Ethyl acetate 55

Hình 3.12: Định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Nước 56

Hình 3.13: Biểu đồ phương trình đường chuẩn Acid gallic 57

Hình 3.14: Biểu đồ thể hiện hoạt tính chống oxi hóa của cao Neem 58

Hình 3.15: Khả năng kháng S aureus và P.aeruginosa của cao Neem ngâm với Hexan 60

Hình 3.16: Khả năng kháng S aureus và P.aeruginosa của cao Neem chiết với Hexan 60

Hình 3.17: Khả năng kháng S aureus và P.aeruginosa của cao Neem ngâm với Chloroform 62

Hình 3.18: Khả năng kháng S aureus và P.aeruginosa của cao Neem chiết với Chloroform 62

Hình 3.19: Khả năng kháng S aureus và P.aeruginosa của cao Neem ngâm với Ethanol 96o 64

Hình 3.20: Khả năng kháng S aureus và P.aeruginosa của cao Neem chiết với Ethanol 96o 64

Hình 3.21: Khả năng kháng S aureus và P.aeruginosa của cao Neem ngâm với Methanol 66

Hình 3.22: Khả năng kháng S aureus và P.aeruginosa của cao Neem chiết với Methanol 66

Hình 3.23: Khả năng kháng S aureus và P.aeruginosa của cao Neem ngâm với Ethyl acetate 68

Hình 3.24: Khả năng kháng S aureus và P.aeruginosa của cao Neem chiết với Ethyl acetate 68

Hình 3.25: Khả năng kháng S aureus và P.aeruginosa của cao Neem ngâm với Nước Chiết 6 giờ 70

Hình 3.26: Khả năng kháng S aureus và P.aeruginosa của cao Neem chiết với Nước

Hình 3.28: Sắc ký đồ GC – MS của cao chiết Ethanol 96o từ lá Neem 74

Hình 3.29: Sắc ký đồ LC – MS của cao chiết Methanol từ lá Neem 77

Hình 3.30 Lá cải nhúng thuốc 78

Hình 3.31 Phun trực tiếp 78

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Quy trình chiết cao từ lá Neem bằng phương pháp ngâm dầm 35

Sơ đồ 2.2: Quy trình chiết cao từ lá Neem bằng Soxhlet 36

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Nông nghiệp là ngành chiếm tỷ trọng lớn đối với nền kinh tế nước ta Nền sản xuất nông nghiệp ở nước ta đang đối đầu với những thách thức và áp lực từ bên trong lẫn bên ngoài Nông nghiệp Việt Nam muốn phát triển bền vững, cần phải có những thay đổi trong cả tư duy lẫn hành động Hiện nay, nền nông nghiệp phát triển theo chiều rộng là chính, năng suất thấp, hiệu quả kém Nguyên nhân là do sự lạc hậu, thiếu sự chuyên môn hóa trong quá trình canh tác và sản xuất dẫn đến những sản phẩm kém chất lượng, làm giảm sự cạnh tranh trên thị trường quốc tế Trên thực tế, nền nông nghiệp nước ta phải đối mặt với nhiều loài sâu, bọ hại cây trồng nên việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật

là không thể tránh khỏi Theo thống kê của tổ chức lương thực thế giới (FAO) cho thấy: các loại cây trồng trên đồng ruộng đang phải chống đỡ với hơn 100.000 loài sâu hại khác nhau, 10.000 loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh Lượng lương thực bị mất do vấn nạn này ngày càng tăng lên Để khắc phục tình trạng trên, con người đã tích cực tìm kiếm các biện pháp phòng chống các tác nhân gây hại, nhiều biện pháp khác nhau đã được sử dụng, trong đó thuốc trừ sâu hóa học được sử dụng nhiều nhất Chúng đóng vai trò quan trọng trong hệ thống canh tác nông nghiệp trong một thời gian dài và mang lại hiệu quả cao với phạm vi sử dụng rộng lớn

Có thể nói, không một biện pháp nào bảo vệ mùa màng tốt hơn thuốc trừ sâu hóa học cả

về mặt qui mô lẫn hiệu quả

Tuy nhiên, các biện pháp hóa học ngày càng bộc lộ những khuyết điểm của nó Do

dư lượng thải ra môi trường ngày càng lớn nên nó đang gây vấn nạn đến môi trường, đầu độc con người, gây mất cân bằng hệ sinh thái Điều nghiêm trọng hơn là do tình trạng sử dụng quá liều lượng, không đúng thời gian sử dụng thuốc và thời gian thu hoạch

đã tạo nên dư lượng thuốc không cho phép trong hoa màu và nông sản Những thông tin như bị ép giá, bị trả lại hàng, không loạt qua được khâu kiểm định nghiêm ngặt khi nhập khẩu vào các nước tiên tiến đã quá quen thuộc trên các mặt báo Đây cũng là nguyên nhân gây nhiễm độc cho khoảng 1,5 triệu người mỗi năm trên toàn thế giới, trong đó có

25 nghìn người bị tử vong (WHO-1998)

Trước thực trạng này, các nhà nông học đã nghiên cứu và đưa ra những phương pháp mới trong phòng trừ và tiêu diệt các loài sâu bọ hại cây trồng Một trong những

hướng nghiên cứu triển vọng là kiểm soát sinh học như: nghiên cứu sử dụng nấm, vi khuẩn, ký sinh thiên địch, các hợp chất thứ cấp từ thảo mộc,….Những chế phẩm sinh học này đang rất được quan tâm, bởi chúng ít làm ảnh hưởng đến các sinh vật sống khác,

dễ phân hủy, không làm độc cho nông phẩm và dễ sử dụng

Cây Neem (Azadirachta indica A.Juss) là một trong những loài thảo mộc có đặc

tính kháng sâu bọ đang được sử dụng và nghiên cứu ở nước ta và nhiều nước khác Nhằm tìm phương pháp tối ưu hóa trong việc sử dụng cây Neem trong quá trình phòng

trừ và tiêu diệt sâu bọ nên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết tách cao Neem

từ lá của cây Neem Ấn Độ bằng các hệ dung môi khác nhau và bước đầu nghiên cứu ứng dụng trong Dược – Mỹ Phẩm – Thuốc bảo vệ thực vật”

1 Mục đích nghiên cứu

- Xây dựng quy trình chiết tách các hợp chất hóa học trong lá Neem

- Xác định tính chất và cấu trúc của các hợp chất hóa học trong lá Neem

- Thử hoạt tính sinh học có trong lá Neem và bước đầu nghiên cứu ứng dụng trong Dược – Mỹ Phẩm – Thuốc bảo vệ thực vật

- Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao Neem theo phương pháp xác định đường kính vòng vô khuẩn

- Xác định lực chống oxy hóa tổng (Total Antioxydant Capacity) theo mô hình phospho molybdenum

2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Nguyên liệu sử dụng để chiết tách cao trong nghiên cứu này là lá Neem Ấn Độ được mua tại Công ty thảo dược An Quốc Thái, phường 11, quận Tân Bình, Thành phố

Hồ Chí Minh.Lá Neem được trồng tại tỉnh Ninh Thuận

- Phòng thí nghiệm Trườg Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu (cơ sở 3), 951 Bình Giã, phường Rạch Dừa, thành phố Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học

Kết quả của luận án tạo ra bộ dữ liệu khoa học tương đối toàn diện về hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học cao (định tính, định lượng) cũng như hoạt tính sinh học (khả năng kháng oxi hóa, kháng khuẩn, trừ sâu) Các dữ liệu khoa học này là nguồn

tư liệu hữu ích cho công tác đào tạo, nghiên cứu về cây Neem ở Việt Nam

4 Cấu trúc bài báo cáo gồm 3 chương:

Chương 1: Tổng quan lý thuyết

Chương 2: Thực nghiệm

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 1.1 Giới thiệu về cây Neem

Tên gọi Azadirachta indica có từ tên của cây Neem trong tiếng Ba Tư Azadarakth-

in - hindi, nghĩa là “Cây tự do của Ấn Độ” Năm 1830, nhà thực vật học Pháp Antoine

Laurent de Jussieu đặt tên cây Neem là Melia azadirachta, sau đó ông đổi thành Azadirachta indica A Juss Trong tiếng Sanskrit cây Neem có tên là Aristha nghĩa là

“Cây làm giảm bệnh tật”.[25]

Trên thế giới tùy từng vùng mà cây Neem có tên gọi khác nhau Ngay cả trong tiếng Anh cây Neem cũng đã có nhiều tên như Neem tree, Indian lilac tree, Paradise tree, White cedar,… nhưng “Neem tree” là tên gọi phổ biến hơn cả Ở Việt Nam, cây

Neem thường được gọi là xoan chịu hạn để phân biệt với cây xoan ta (Melia azedarach

L.).[7]

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Hình 1 1: Bộ phận của cây Neem

A.Nhánh thân Neem; B Lá Neem; C Hạt Neem chín; D Hạt Neem khô; E Nhân hạt Neem

Cây Neem thích hợp với thời tiết nóng (nhiệt độ có thể lên tới 50 oC), mọc tốt ở đất cát cố định, đất cát pha sét

Neem là cây xanh quanh năm, tán lá rộng, cao trung bình 13 - 20 m, cây trưởng

mọc ở những vùng khô hạn có thể rụng lá trong một khoảng thời gian ngắn, lá non mọc lại trong khoảng tháng 3 - 4 Trường hợp cá biệt nếu phát triển trong điều kiện thuận lợi cây có thể cao 35 - 40 m, đường kính thân có thể đạt đến 3.5 m Rễ cây thường ăn rất sâu

1.1.3 Nguồn gốc và sự phân bố

Hiện nay, nguồn gốc của cây Neem vẫn chưa được xác định chính xác Theo Gamble (1902) nguồn gốc cây Neem có từ những cánh rừng ở Karnatka (Nam Ấn Độ) hoặc vùng rừng khô hạn trong nội địa Myanmar Những nhà nghiên cứu khác lại có chung quan điểm là Neem bắt nguồn từ rừng ở các ngọn đồi Shivalik (chân phía Tây của dãy Himalayas) hoặc bờ biển phía Đông miền Nam Ấn Độ Sự đa dạng về hình dạng của lá Neem và các đặc điểm hình thái khác đã dẫn đến thuyết của Schmutterer (1995):

A indica xuất phát từ thượng Myanmar, sau đó lan ra các cánh rừng Trung và Tây Á.[35]

Do thích hợp với khí hậu nóng, Neem đã được di thực vào châu Phi từ những năm đầu thế kỷ 20 Ngày nay nó được trồng rộng rãi ở các nước như Senegal, Ghana, Sudan, Mali, Nigeria, … Trong thế kỷ 20 Neem cũng đã được di thực đến các nước Trung và Nam Mỹ, đặc biệt được trồng rất nhiều ở Haiti, Cộng hòa Dominica, Nicaragua Ở châu

Á, Neem được trồng ở nhiều nơi như Bangladesh, Myanmar, Cambodia, Ấn Độ, Sri Lanka, Indonesia, Iran, Malaysia, Nepal, Pakistan, Thái Lan, Yemen, Trung Quốc Tại Việt Nam, cây Neem được trồng từ 1981.[7]

Bảng 1.1: Hoạt tính dược liệu các chất trong Neem

Chống viêm, chống viêm khớp, hạ sốt, giảm đường huyết, chống viêm dạ dày, chất diệt tinh trùng, chống nấm, chống khuẩn, lợi tiểu

3 Azadirachtin Hạt, dầu Chống vi khuẩn sốt rét

5 Nimbolide Hạt, dầu Chống sốt rét, chống vi khuẩn

8

Gallic acid, (-) epicatrchin và catechin

Vỏ cây Chống viêm, điều hòa hệ miễn

dịch

9

Margolone, margolonone và isomargolonone

13 NB-2-Peptidoglucan Vỏ cây Điều hòa hệ miễn dịch

Ngoài những công dụng trên, vỏ cây Neem còn có công dụng cầm máu, bổ gan, trị đàm,… Neem còn được báo cáo chữa được stress và điều khiển tỷ lệ sinh đẻ,…Tại một

số vùng Andhra Pradesh, nông dân thường cho gia súc ăn lá Neem sau khi sinh con để tăng sự tiết sữa Ngoài ra lá Neem còn có tác dụng phòng trị bệnh giun sán cho gia súc

và kiểm soát nhiều loại tác nhân gây bệnh khác Nhiều nơi còn dùng lá non làm rau ăn vừa bổ sung khoáng chất, vừa có thể phòng ngừa giun sán hoặc viêm nhiễm đường ruột

Ở Ấn Độ, dân gian thường lấy lá Neem để gần trẻ em giúp ngăn ngừa bệnh ho gà

1.1.4.2 Dùng trong mỹ phẩm

Bởi hoạt tính kháng khuẩn tốt, có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn trong tế bào gây mụn nên dầu Neem đang được ưa chuộng trong việc điều trị mụn như một liệu pháp tự nhiên Bằng cách phối dầu Neem vào nền mỹ phẩm hay sử dụng trực tiếp có khả năng điều trị mụn trứng cá, mụn nhọt

Nhờ hoạt tính này, dịch chiết lá Neem còn giảm lượng vi khuẩn, mảng bám men răng từ đó chống bị viêm răng nên có thể phối dịch chiết Neem vào kem đánh răng để

sử dụng hằng ngày.[37] Ngoài ra, Neem còn được phối vào nhiều sản phẩm mỹ phẩm khác như dầu gội đầu, sữa tắm, xà phòng,… để tăng khả năng diệt khuẩn

1.1.4.3 Công dụng khác

Cùng với những hoạt tính sinh học trên, cây Neem còn có nhiều hữu ích khác như tạo bóng mát, tạo môi trường xanh trong lành, giúp bảo vệ đất, chống xói mòn, cát bay,…Gỗ Neem được dùng chế tạo hàng gia công mỹ nghệ có độ bền cao không bị mối mọt làm hư hại Ngoài ra, vỏ Neem chứa nhiều tannin phục vụ cho công nghệ thuộc da, công nghệ nhuộm, nhựa mủ làm kẹo gum,…

1.2 Các chất có hoạt tính sinh học trong cây Neem

Từ trước đến nay, các nhà khoa học đã khảo sát tính sát trùng ở hơn 2000 loài cây, duy nhất cây Neem cho kết quả hứa hẹn Điều này có được do các hoạt chất trong Neem không chỉ tác động hiệu quả lên côn trùng mà còn khá an toàn với con người và động vật máu nóng Tính đến năm 2000 đã có hơn 100 hoạt chất có hoạt tính sinh học từ Neem đã xác định được công thức và cấu tạo Những hoạt chất này chủ yếu thuộc hai nhóm chính là isoprenoid và các hợp chất không phải isoprenoid.[35] Có thể chia chúng thành 2 nhóm:

Isoprenoid (terpen): Gồm diterpenoid và triterpenoid như là các protomeliacin, limonoid, azadirone và dẫn xuất của chúng, gedunin và dẫn xuất của chúng, các hợp

chất dạng vilasinin và C-secomeliacin (nimbin, salanin và azadirachtin)

Non-isoprenoid: Gồm protein, amino acid, carbohydrate, hợp chất của lưu huỳnh, hợp chất polyphenolic như flavonoid, glycoside của chúng, dihydrochalcone, coumarin,

tannins, chất béo,…

1.2.1 Diterpenoid

Trong các loại terpene thì tricyclic diterpene được tìm thấy nhiều nhất, đặc biệt là những chất có vòng C với nhóm chức của oxygen tại C-3 và C-7

Hình 1.2: Neem tricyclic diterpene

Đa số các tricyclic diterpene trong Neem được báo cáo có hoạt tính sinh học cao: chống tế bào ung thư, kháng sinh và trừ sâu cao.[26]

1.2.2 Triterpenoid (limonvgoid)

Đây là những chất đắng trong Neem, thuộc dạng tetranortriterpenoid có khung apo-euphol (hoặc apo-tirucallol) Người ta đã tìm thấy khoảng 300 limonoid trong thực

vật, 1/3 số đó có trong Azadirachta indica và Melia azedarach Nhóm triterpenoid này

có thể phân thành 8 nhóm nhỏ: protomeliacin, limonoid với chuỗi bên xác định, azadirone và dẫn xuất, gedunin và dẫn xuất, vilasinin và 3 nhóm C- seco-meliacin là azadirachtin, nimbin, và salannin

Protomeliacin

Chứa một chuỗi bên 8 carbon tại vị trí C - 17, còn được gọi là protolimonoid hay protomelicin hay meliane Hợp chất đầu tiên melantriol được cô lập từ quả và dầu Neem Nimbocinone, nimolinone, kulactone, limocinol và limocinone là những dẫn xuất của euphol/tirucallol Azadirachtol, azadirachnol, azaditol thuộc chuỗi apo Các hợp chất limocin A và B là limocinin, đó là những tetranortriterpenoid có chuỗi bên tetrahydrofuran bán acetan

β

Hình 1.3: Nhóm protomelicin Limonoid với 4 vòng nguyên và chuỗi bên γ- hydroxybutenolid

Đặc điểm của nhóm này là có chuỗi bên γ - hydroxybutenolid tại vị trí của vòng furan và 4 vòng furan còn nguyên vẹn

Hình 1.4: Limonoid với 4 vòng nguyên và chuỗi bên γ – hydroxybutenolid Nhóm azadirone và các hợp chất tương tự

Nhóm này bao gồm tất cả các hợp chất có khung triterpenoid nguyên, có cầu oxy tại vị trí C - 3 và C - 7

• Nhóm salannin

Hình 1.7: Salannin

• Nhóm C- secomeliacin nimbin

Hình 1.8: Nimbin

• Nhóm azadirachtin

Đây là nhóm chính có hoạt tính gây ngán ăn cho côn trùng Morgan và Butterworth

cô lập được azadirachtin năm 1968 Các đồng phân khác sau đó được xác định bởi Siddiqui, Kraus, Ley và cộng sự

Hình 1.9: Azadirachtin A

Ngoài ra trong cây Neem còn chứa các hoạt chất không phải isoprenoid như các hợp chất polyphenolic (flavonoid, flavonoglycoside, dihydrochalcon, tannin, coumarin), các hợp chất carbohydrat và protein, các hợp chất sulfur dễ bay hơi cũng có hoạt tính mạnh đối với côn trùng

1.3 Tác động của các hoạt chất trong cây Neem đối với các loài dịch hại

Các hoạt chất trong Neem tác động đến nhiều loài dịch hại theo những phương thức sau:

Gây ngán ăn: Đây là tác dụng điển hình nhất của các hoạt chất trong Neem Các

hoạt chất trong Neem thường làm sâu giảm ăn hoặc nhịn ăn đến chết Saxena (1986)

nhận thấy rằng mùi vị của dầu Neem ở nồng độ 6%, 12% làm loài N viresen bỏ ăn ngay lập tức Thí nghiệm với dịch chiết Neem chứa azadirachtin cũng làm cho N viresen bỏ

ăn và chuyển sang tăng cường các hoạt động khác Khả năng gây ngán ăn của Neem liên quan đến một thụ quan gây ức chế quá trình hấp thụ thức ăn Tác dụng gây ngán ăn của Neem tùy thuộc vào giống và tuổi sâu bọ.[9; 13; 39]

Xua đuổi: Theo Saxena (1995), tác động xua đuổi côn trùng của Neem là do sự có

mặt của các hợp chất chứa lưu huỳnh dễ bay hơi trong Neem Dầu Neem và dịch chiết

từ Neem gây xua đuổi côn trùng rất mạnh trong khi azadirachtin tinh khiết lại không có tác động này.[13]

Diệt côn trùng: Hoạt chất trong Neem có tác dụng làm chết côn trùng qua đường

tiếp xúc và đường miệng Tuy tác động diệt côn trùng của các chất trong Neem không

mạnh và nhanh như các thuốc hóa học khác nhưng có tác dụng kéo dài.[16]

Ức chế sự sinh trưởng và gây biến thái: Biểu hiện của tác động này là làm cho

côn trùng giảm kích thước và trọng lượng, kéo dài thời gian phát triển hoặc không phát triển được 1984, Heyde và cộng sự nhận thấy khi phun dịch chiết từ Neem ở nồng độ

500 ppm lên trùng non rầy xanh (Cicadellidae) thì chỉ có khoảng 10% - 28% trùng non

chuyển sang giai đoạn trưởng thành được, nếu ở nồng độ cao hơn thì tất cả các trùng non này đều chết trước khi chuyển sang giai đoạn trưởng thành [39]

Ảnh hưởng khả năng giao phối: Các hợp chất trong Neem làm ảnh hưởng đến

quá trình sản xuất ra hormon giới tính, dẫn dụ, từ đó ảnh hưởng đến quá trình ghép đôi giao phối của côn trùng Saxena (1995) nhận thấy dầu Neem ở nồng độ 1, 2, 5 μg khiến

N lugens cái sản xuất ra tín hiệu sai lạc làm cho con đực không nhận ra nó vì vậy không

ghép đôi giao phối được.[39]

Ảnh hưởng đến khả năng đẻ trứng và làm thối trứng: Các hoạt chất trong Neem

tác động lên hệ nội tiết của côn trùng làm phân hủy các tế bào nuôi dưỡng phôi tạo tế bào trứng làm côn trùng không đẻ trứng hoặc khả năng đẻ trứng giảm Larew và Knodel

- Montz khi phun 0,4% dịch chiết nhân hạt Neem lên Trialeurodes vaporamorum thấy

số lượng trứng giảm đi một phần tư.[13; 39]

1.4 Cơ sở hóa học thuốc bảo vệ thực vật và công nghệ sản xuất thuốc bảo vệ thực vật

Thuốc bảo vệ thực vật là những hợp chất độc có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp hóa học được dùng để phòng trừ sâu bệnh, cỏ dại, chuột, nấm bệnh v.v… hại cây trồng

1.4.1 Hoạt chất

Hoạt chất là những chất có tác dụng diệt dịch hại Hoạt chất, còn gọi là sản phẩm

kĩ thuật có nhiều dạng như dạng bột, kết tinh, lỏng nhão, khí, có các hàm lượng và độ tinh khiết khác nhau tùy thuộc vào công nghệ sản xuất.[9; 12; 14]

1.4.2 Chất mang

Chất mang hay chất làm loãng là những chất ở dạng rắn hoặc lỏng, có tác dụng làm loãng hoạt chất nhưng không làm giảm hoạt tính sinh học của hoạt chất, tạo dạng thuốc an toàn và tiện lợi trong sử dụng

1.4.3 Chất hoạt động bề mặt

Chất hoạt động bề mặt là những chất hóa học đặc biệt khi hỗn hợp với nước sẽ tạo nên một dung dịch không đồng nhất nhưng làm giảm sức căng bề mặt, tăng tính loang dính và thấm ướt dịch phun.[11; 29; 31]

Hàm lượng chất hoạt động bề mặt hoặc hỗn hợp của chúng trong các dạng thuốc

từ 1 – 10%

1.4.4 Các chất phù trợ

Đây là những chất phù trợ khi thêm vào để nâng cao hiệu lực của các chất độc (hoạt chất) Vai trò của chúng là cải thiện lí tính của các hoạt chất và các hợp chất hoạt động, bao gồm:

- Chất ổn định

- Chất hợp lực làm tăng độ độc của thuốc

- Chất thấm ướt tăng sự phân tán

- Chất phân tán hấp phụ trên bề mặt của phân tử thuốc

- Chất hóa sữa tạo độ bền nhũ tương

- Chất hòa tan

- Chất nâng cao hoạt tính sinh học

- Chất chống lắng ngăn cản sự tách lớp và lắng đọng của các phần tử và giọt

- Chất chống đóng vón

- Chất chống đông

- Chất tạo bọt và chất chống bọt

- Chất bảo quản ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật vào dạng gia công

- Chất tác động phối hợp có tác dụng gia tăng tác dụng của thuốc

- Các chất màu dùng để cảnh báo, ngăn ngừa ngộ độc thuốc hoặc để kiểm tra độ đồng đều của thuốc trước khi xử lí.[5; 11]

1.4.5 Các dạng thuốc bảo vệ thực vật

Đối với thuốc tổng hợp hóa học, hợp chất độc được tổng hợp ra còn chứa các phụ chất gọi là thuốc kĩ thuật Trong đó, thành phần thuốc nguyên chất hay hoạt chất là thành phần gây hiệu lực chính đối với sâu hại

Thuốc kĩ thuật hay còn gọi là thuốc nguyên chất cần được gia công thành các dạng thành phẩm (còn gọi là chế phẩm) khác nhau để sử dụng Từ năm 1984, Hiệp hội sản xuất thuốc bảo vệ thực vật (CIPAC: Collaborative International Pesticides Analytical

Council) quy định thống nhất tên dạng thuốc bảo vệ thực vật gồm hai chữ cái biểu thị trạng thái vật lí và hướng sử dụng[13] Các dạng chế phẩm được dùng phổ biến là:

1.4.6 Phân loại thuốc bảo vệ thực vật

Dựa vào một số đặc điểm, thuốc bảo vệ thực vật được chia ra các nhóm sau:

- Theo con đường tác động

- Theo phương pháp xử lí

- Theo nguồn gốc hóa học

- Thuốc trừ sâu gốc thảo mộc

Bảng 1.2: Các thương phẩm thuốc trừ sâu từ Neem đang lưu hành trên thị trường Việt

xanh hại chè

Công ty TNHH nông dược Điện Bàn

0.3EC

0.15EC: Ruồi đục lá cây bó xôi, rệp sáp hại cà phê, bọ cánh tơ hại chè, sâu tơ hại bắp cải, sâu xanh da láng hại

1.5 Công trình nghiên cứu, phương pháp chiết tách và phối phẩm

1.5.1 Trên thế giới

Năm 1985, Robert O Larson cùng cộng sự đã làm bền dịch chiết Neem để làm thuốc trừ sâu Hạt Neem khô xay nhỏ có kích thước 350 microns - 2 mm Dùng ethanol chiết trong vùng nhiệt độ khảo sát từ 60 tới 90 oC, tách thu được dịch chiết ethanol chứa

5 – 10 ppm azadirachtin Pha loãng dịch chiết này với nước, thêm chất nhũ hóa vào để tạo dạng nhũ có nồng độ 2 - 4 ppm azadirachtin Kiểm tra độ pH và điểu chỉnh nó về trong khoảng 3.5 - 6 Sản phẩm thu được duy trì được 80% chất lượng khi ở dạng nhũ tương trong 8 tuần và hơn 50% sau 2 năm.[36]

Năm 1990, Lidert cùng các cộng sự qua nghiên cứu đã chỉ ra rằng dịch chiết từ hạt Neem có chứa những hydrogenation có hoạt tính chống sâu bọ tốt hơn dịch chiết không

có hydrogenation Phương pháp tiến hành: dầu Neem ban đầu được loại bỏ bớt dầu và các acid béo (sử dụng dung môi petroleum ether, hexane hay heptane) Sau đó chiết bằng dung môi phân cực hơn (ethanol, methanol hoặc hỗn hợp nước với các rượu này)

để thu được dịch chiết có hoạt tính sinh học Cho dung môi ethyl acetate vào dịch chiết này để loại đường và protein Cuối cùng hydo hóa để thu được sản phẩm diệt côn trùng

có hiệu quả và tác động lâu dài hơn.[43]

- Dịch chiết trước khi hydrat hóa thường chứa từ 15 – 50% azadirachtin Khi phương pháp hydrat hóa xúc tác được sử dụng, bước hydrat hóa được giám sát và tiếp

tục cho đến khi nồng độ azadirachtin giảm xuống chuyển thành dihydroazadirachtin hoặc tetrahydroazadirachtin Dùng tỷ lệ 1 - 5 mol hydrogen và 1 mol azadirachtin.[43]

- Dung môi tốt nhất để chiết có thể là methanol, hỗn hợp của methanol với nước hoặc ethyl acetate Xúc tác tốt nhất là palladium trên carbon, platinum oxide, nickel boride và Raney nickel Sự hydrat hóa nên được thực hiện trong khoảng 1 - 60 atm bầu khí quyển của hidro và nhiệt độ 10 – 50 oC Dịch chiết sau hydrat hóa trong điều kiện tối ưu chứa từ 1 5- 50% dihydroazadirachtin Điều đáng ngạc hơn là dịch chiết hydrat hóa trong phát minh này cải thiện hoạt động trừ sâu hơn so với dich chiết ban đầu Thuốc trừ sâu này có tác dụng phổ rộng trên nhiều loài côn trùng loài Lepidoptera như bướm Plutella, sâu bắp cải (loại nhập khẩu), cải bắp looper, budworm thuốc lá; loài Coleoptera như Colorado khoai bọ cánh cứng; loài Homoptera như rệp táo xanh, đào rệp màu xanh

lá cây; và Homoptera như phễu lá khoai.[43]

- Liều lượng của các chiết xuất được tính toán dựa vào nồng độ của dihydroazadirachtin trong dịch chiết, thông thường sử dụng 5 – 200 g/ha Công thức thức thuốc trừ sâu được xây dựng gồm: nước, chất phân tán, dd tạo độ nhờn (oily solutions), chất phân tán dầu, bột nhão, bột khô, bột ướt, chất làm đặc nhũ, flowables, nhũ tương,… Với thành phần dihydroazadirachtin hay tetrahydroazadiractin sử dụng lượng đáng kể từ 0.0001% đến 5%, tốt nhất nên từ khoảng 0.001% đến 3%.[43]

Năm 1995, Lidert và các cộng sự đã điều chế các chất chiết có độ tinh khiết cao từ hạt cây Neem Ban đầu, hạt Neem xay hay bánh dầu Neem được khuấy với nước, dung dịch chia 2 lớp, tách lấy pha nước Cho chất hấp thụ macroporous polymeric để thu được phân đoạn giàu azadirachtin Giải hấp bằng dung môi để thu được azadirachtin Quá trình này tạo ra chiết xuất chứa hơn 15% azadirachin Chất hấp thụ macroporous polymeric có thể là một polymer của divinylbenzene, một copolymer của divinylbenzene/styrene, một acrylic polymer hay một phenol/formaldehyde copolymer Chất được chọn là polymer của divinylbenzene Dung môi giải hấp được chọn là ethyl acetate.[42]

Năm 1998, ông Panchapagesa Muthuswamy Murali cùng các cộng sự đã xây dựng quá trình tạo ra một lượng giàu azadirachtin trong thành phần thuốc trừ sâu và làm bền sản phẩm Nhân hạt Neem đã được xay nhuyễn được chiết ngâm tối thiểu 3 lần với dung môi phân cực acetone/nước tỷ lệ 90:10 ở nhiệt độ tối ưu 80 oC Thu được dịch chiết qua

lọc mà không có cặn bùn của hạt Neem Cho dichloromethane với lượng tương đương thể tích dịch chiết, chiết 3 lần và gom lấy dịch chiết dichloromethane Cho Na2SO4 vào

để làm khan nước còn lẫn trong dịch chiết dichloromethane Sau đó, chưng cất dịch chiết trên để thu hồi dichloromethane, AZ thu được dùng cho phối chế sản phẩm.[33] [34]

- Sau quá trình tinh chế để thu được azadirachtin với nồng độ cao, hòa tan nó trong hỗn hợp 2 dung môi ethanol: nước với các tỷ lệ 100 – 70 : 0 – 30 (v/v), để pha loãng nồng độ từ 20 – 40 ppm xuống 1 – 20 ppm azadirachtin ( m/v) Tạo nhũ của azadirachtin 0.2% tới 30% (v/v) với chất nhũ hóa ion và không độc - Tween 20 Thêm

20 – 50% dầu Neem vào hỗn hợp Điều chỉnh pH của dung dịch từ 3.5 đến 6 bằng dung dịch kiềm ammonia hydroxide.[33] [34]

Thêm 1 - 2.5% tác nhân chống nắng của para-amino benzoic acid (PABA) hay ester của nó và 1% oleic acid Sau đó điều chỉnh lại pH để tạo ra sản phẩm bền vững Sản phẩm thu được duy trì được 65% hoạt tính sau hơn 2 năm.[33] [34]

1.5.2 Trong nước

Năm 1991, giáo sư Lâm Công Định đã viết một cuốn sách nói về loài cây Neem được nhập nội vào Việt Nam và công bố những nghiên cứu về điều kiện khí hậu, canh tác để phát triển loài cây này trên vùng đất cát nóng Tuy Phong – Bình Thuận.[8]

Năm 1999 – 2000, Viện sinh học Nhiệt dới Thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành thử nghiệm dầu Neem lên sự phát triển bọ hà khoai lang và kết quả cho thấy có hiệu lực phòng trừ tốt Bên cạnh đó viện đã nhân giống cây Neem bằng nuôi cấy mô.[8]

Năm 2001, Dương Anh Tuấn và cộng sự thuộc Viện Hóa Học - Trung tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia nghiên cứu thành công việc chiết tách và tinh sạch azadirachtin từ nhân hạt Neem và thử nghiệm hoạt tính gây ngán ăn trên sâu khoang Kết quả thu được azadirachtin 92%, hiệu suất chiết tách 0.054%, với liều lượng 7.89 mg/cm3 đạt chỉ số gây ngán ăn trung bình 71.54% và đạt 87% với liều lượng 15.6 mg/cm3.[3]

Năm 2003, Vũ Văn Độ, Nguyễn Tiến Thắng đã chiết xuất, tinh sạch và xác định hàm lượng azadirachtin và salanin trong nhân hạt Neem

Năm 2003, Vũ Đăng Khánh đã khảo sát hoạt tính kháng một số loài nấm gây bệnh

và nấm Aspergiluss flavus sinh độc tố aflatoxins của sản phẩm chiết xuất từ cây Neem

trồng Việt Nam.[16]

Năm 2004, ThS Lê Thị Thanh Phượng đã chiết xuất được các hoạt chất sinh học

từ hạt Neem và khảo sát tác động của chúng đối với ngài gạo (Corcyra cephalonica St).[9]

Năm 2005, Vũ Văn Độ, Vũ Đăng Khánh và Nguyễn Tiến Thắng thuộc Viện Sinh học Nhiệt Đới- Trung tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia đã đánh giá được độ độc của chế phẩm phối trộn giữa dầu Neem với Bt (Baccillus thuringiensis) đối

với sâu xanh (Heliothis armigara), sâu tơ (Plutella xylostella) Kết quả chế phẩm phối

trộn giữa dầu Neem và Bt có tác dụng mạnh hơn so với sản phẩm chỉ chứa dầu Neem hay Bt; hiệu quả gây chết mạnh nhất và rõ ràng nhất ở nồng độ 32% dầu Neem và 10% hay 15% Bt.[15]

1.6 Phương pháp thử hoạt tính khuẩn

Phương pháp khoanh giấy

Nguyên tắc: phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của Hadacek et al (2000) Chủng vi khuẩn sau khi được hoạt hóa từ ống chủng gốc trên môi trường MP đặc, một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5 ml môi trường TSB lỏng và lắc qua đêm ở nhiệt độ 37 oC đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải 100μl dịch khuẩn, nồng độ tương đương 4-5 × 108 CFU/ml lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường

LB đặc Chuẩn bị dịch thử bằng cách hòa tan cao trong DMSO 5% thành các nồng độ theo yêu cầu Đối chứng dương là dung dịch kháng sinh (Ampicilin 10 μg/ml, Tetracyclin 30 μg/ml, Amoxilin 10 μg/ml); đối chứng âm là DMSO Hoạt tính ức chế khuẩn được đánh giá bằng cách đo bán kính (BK) vòng ức chế vi sinh vật bằng công thức: BK (mm) = D – d; trong đó D = đường kính vòng vô khuẩn và d = đường kính lỗ khoan thạch Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị bán kính trung bình

1.6.1 Staphylococcus aureus (Gr +)

Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843 - 1910) phát hiện vào năm 1878,

phân lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời

kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học

Phân loại khoa học:

Giới (Kingdom): Eubacteria

Ngành (Division): Firmicutes

Lớp (Class): Bacilli

Bộ (Order): Bacillales

Họ (Family): Staphylococcaceae

Giống (Genus): Staphylococcus

Loài (Species): Staphylococcus aureus

Staphylococcus có nguồn từ tiếng Hy Lạp staphyle nghĩa là chùm nho là các cầu

khuẩn kị khí tuỳ ý Vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào và thường không có vỏ,có hình cầu, đường kính 0.8 – 1 µm, hình thức tập hợp này do vi khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian; trong bệnh phẩm vi khuẩn có thể đứng lẻ, từng đôi hoặc đám nhỏ

Một số Staphylococcus được tìm thấy khắp nơi và có thể phân lập từ không khí,

bụi, thực phẩm, thường trú ở vùng da và niêm mạc của người

Giống Staphylococcus có hơn 20 loài khác nhau, trong đó có 3 loài tụ cầu có vai

Staphylococcus aureus phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, không thể

sinh trưởng ở nhiệt độ thấp Theo Mc Landsborough L (2005), nhiệt độ sinh trưởng tối

ưu của S aureus là 18 – 40 ℃, pH = 7.2 Tuy nhiên mọc tốt nhất ở 25 ℃, hiếu khí hay

kỵ khí tuỳ ý Ở canh thang, sau 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ làm đục rõ Ở môi trường đặc, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh co thể có màu vàng đậm, màu

vàng cam hoặc màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ Ngoài ra S aureus có thể sinh

trưởng được trên môi trường có hoạt độ thấp hơn các loài vi khuẩn khác hoặc môi trường

có nồng độ muối cao

Khi phát hiện trong môi trường, tạo sắc tố vàng sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng và đều tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 15 ℃, nhiều nhất là khi tăng trưởng

ở 35 – 37 ℃

Hình 1.10: Vi khuẩn Staphylococus trên kính hiển vi

Staphylococcus aureus có trong nhiều môi trường sống trước đây, thường sống ký

sinh vô hại, nhưng cũng có thể gây bệnh, đặc biệt là khi Staphylococcus aureus (SA) xâm nhập hoặc xuyên qua da, chúng có thể gây ra nhiều loại nhiễm trùng khác nhau, chẳng hạn như các sự nhiễm trùng da, làm loét, phỏng da hoặc các sự nhiễm trùng nặng trong máu, phổi hoặc các mô khác

Tính chất sinh hoá và đề kháng

Tụ cầu vàng tương đối chịu nhiệt và thuốc sát khuẩn hơn những vi khuẩn khác, chịu độ khô và có thể sống ở môi trường nồng độ NaCl cao (9%), nhiều chủng tụ cầu vàng đề kháng với penicillin và các kháng sinh khác

S aureus có phản ứng DNase, Catalase (+) (chuyển hoá hydrogen peroxit thành

nước và oxygen, phosphase (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose,

sucrose, desoxyribonuclease là enzyme phân giải DNA Tất cả các dòng S aureus đều

Độc tố: Hầu hết các dòng S aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trường

có nhiệt độ trên 15 ℃ hơn cả vi khuẩn Độc tố ruột enterotoxin sản xuất bởi S aureus là

một protein ổn định nhiệt,nhiều nhất khi tăng trưởng ở nhiệt độ 35 – 37 ℃ và có thể tồn tại nhiệt ở 100 ℃ trong vòng 30 – 700 phút

Các enzyme ngoại bào:

- Protease phân giải protein của tế bào chủ

- Lipase phân giải lipid

- Deoxyribonuclease (DNase) phân giải DNA và các enzyme sửa đổi acid béo (FAME)

1.6.2 Pseudomonas aeruginosa (Gr -)

Theo phân loại của Bergey D.G.(1984), Pseudomonas aeruginosa thuộc giống Pseudomonas, họ Pseudomonadaceae Căn cứ vào sự tương đồng rARN/ADN và những đặc điểm nuôi cấy thông thường, người ta chia giống Pseudomonas thành 92 loài khác nhau, trong đó Pseudomonas aeruginosa là một trong số 12 loài có liên quan nhiều

đến y học

Pseudomonas aeruginosa (P aeruginosa) là trực khuẩn Gram âm, nhỏ, đứng

riêng lẻ, thành đôi và có khi xếp thành chuỗi Di động nhờ một lông duy nhất ở một cực

Có pili, không bào tử

Phân loại khoa học:

Giới (Kingdom): Bacteria

Hình 1.11: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi

Sức đề kháng

Có sức đề kháng cao với các yếu tố lý hoá

Có khả năng đề kháng kháng sinh cao

Kháng nguyên

Kháng nguyên liên kết với tế bào:

- Protein màng ngoài: Các protein ở màng ngoài tế bào có thể kết hợp với LPS tạo thành những thụ thể đặc hiệu của trực khuẩn mủ xanh

- Polysaccharide ngoại tiết: cCó 2 loại polysaccharide được tạo ra bởi những

chủng P aeruginosacó khuẩn lạc dạng M và dạng R

Các kháng nguyên ngoại bào: Vi khuẩn tiết ra rất nhiều chất chuyển hoá trong môi

trường (protease, elastase, exotoxin A, glycocalx, hemolysine, ) là những yếu tố độc lực của vi khuẩn đồng thời còn là những kháng nguyên được nghiên cứu để sử dụng chế tạo vaccine gây miễn dịch

Phân loại trực khuẩn mủ xanh

Việc xác định type rất có ý nghĩa trong phân loại, xác định tính phổ biến và sự phân bố của vi khuẩn theo địa dư và các loại bệnh, để từ đó có cơ sở nghiên cứu chế tạo

ra các chế phẩm miễn dịch phòng và điều trị các nhiễm khuẩn do P aeruginosa Mặt

khác, các phương pháp xác định type cũng có tầm quan trọng trong điều tra dịch tễ học quá trình lây nhiễm loài vi khuẩn này Những phương pháp hay sử dụng nhất là serotype, lysotype và pyocinotype; các phương pháp này cho phép xác định type của 90 – 95% số

chủng P aeruginosa Theo Uỷ ban phân loại Quốc tế, việc định kháng nguyên O (serotype) chia P aeruginosathành 16 nhóm kháng nguyên được ký hiệu từ O1 đến O16

(hoặc P1 đến P16)

Nội độc tố

Là thành phần của vách tế bào vi khuẩn Nội độc tố bao gồm chủ yếu là LPS và một lượng nhỏ protein Hoạt tính sinh học của nội độc tố chủ yếu do phức hợp LPS đảm nhiệm LPS có vai trò quan trọng trong bệnh sinh nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễm khuẩn huyết

Ngoại độc tố

Bản chất là protein có trọng lượng phân tử 66.6 kDa Exotoxin A hoạt động tượng

tự như cơ chế hoạt động của độc tố vi khuẩn bạch hầu Với khả năng khuếch tán và ức

chế sự tổng hợp protein của tế bào, exotoxin A là một độc tố mạnh nhất của P aeruginosa Exotoxin A gây rối loạn chức năng huyết động trung tâm, thay đổi chức

năng đông máu, rối loạn chuyển hoá lipit, gây tổn thương nhiều cơ quan, nhưng biểu

hiện rõ rệt nhất là tổn thương gan 90% số chủng P aeruginosa sản xuất exotoxin A độc

tố này rất khác nhau tuỳ từng chủng

1.7 Một số phương pháp chiết cao Neem

vì vậy không có một phương pháp chiết chung nào áp dụng cho các hợp chất thiên nhiên Phương pháp chiết thông dụng hiện nay là chiết nóng bằng dụng cụ chiết liên tục hay hồi lưu Sau mỗi lần chiết với một loại dung môi cần làm khô hợp chất thiên nhiên rồi mới tiếp tục chiết với loại dung môi tiếp theo Mỗi phân đoạn chiết, cất thu hồi dung môi và tiến hành phân tích riêng

Có hai cách chiết: Chiết ở nhiệt độ thường và chiết nóng Mỗi cách chiết có dung môi và thiết bị riêng

- Chiết ở nhiệt độ thường: Có 2 cách là ngâm kiệt và ngâm phân đoạn Phương pháp ngâm kiệt cho kết quả tốt hơn vì chiết được nhiều hoạt chất và tiết kiệm được dung môi

- Chiết nóng: Thường áp dụng chiết liên tục hoặc hồi lưu đối với dung môi dễ bay hơi

Dung môi dùng để chiết các hợp chất khỏi hợp chất thiên nhiên rất đa dạng và thay đổi tùy theo bản chất của mỗi loại hợp chất thiên nhiên Vì vậy cơ sở để lựa chọn dung môi chiết là tính phân cực của hợp chất chứa trong hợp chất thiên nhiên và của dung môi

Chiết soxhlet là một phương pháp chiết liên tục, được dùng để tách chất phân tích

ra khỏi mẫu vật rắn (thực vật, đất, các mẫu sinh học,… ) bằng một dung môi thích hợp

Bộ chiết soxhlet gồm một bình cầu, một thiết bị chiết và một sinh hàn hồi lưu Chất phân tích chứa trong thiết bị chiết, dung môi chứa trong bình cầu Quá trình chiết xảy ra khi hơi nóng dung môi bốc lên bao quanh thiết bị chiết gặp sinh hàn ngưng tụ ngấm vào chất phân tích Với phương pháp này thì chất phân tích được chiết với dung môi nóng Ưu điểm của phương pháp này là có thể thu hồi dung môi trực tiếp trên thiết bị chiết và có thể sử dụng lại cho quá trình chiết tiếp theo

Ưu nhược điểm của phương pháp truyền thống

Trong đó, chiết ngấm kiệt có đối lưu dòng dung môi và ngâm dầm có khuấy trộn

có ưu điểm là thiết bị đơn giản, đồng thời chiết tách được một lượng mẫu lớn và có thể đạt hiệu suất chiết tách cao đối với chất hòa tan cũng như các hoạt chất sinh học Tuy nhiên, lại cần nhiều thời gian, tốn dung môi, dung môi sử dụng phải tinh khiết, nồng độ chất nghiên cứu trong dịch chiết thu được thấp, phải tốn nhiều thời gian và công sức để loại dung môi ra khỏi dịch chiết để thu cao Chiết bằng thiết bị soxhlet có ưu điểm tiết kiệm dung môi hơn, ít tốn thời gian, nồng độ chất chiết trong dịch chiết tách cao Tuy nhiên, không thể tiến hành một lượng lớn mẫu cùng lúc và hợp chất có thể bị ảnh hưởng

do nhiệt độ cao trong quá trình trích ly

1.7.2 Các phương pháp hiện đại

Ưu nhược điểm của phương pháp hiện đại

Các phương pháp chiết tách hiện đại sẽ rút ngắn được thời gian trích ly, giảm lượng dung môi phải sử dụng nhưng hiệu quả thu hồi vẫn gần bằng và cao hơn so với phương pháp chiết tách chỉ dùng nhiệt độ và dung môi đối lưu Hiệu quả quá trình còn phụ thuộc vào các thông số kỹ thuật đặc trưng của từng phương pháp Tuy nhiên, nhược điểm của

các phương pháp chiết tách hiện đại là đòi hỏi phải có thiết bị phù hợp và chi phí cũng cao hơn

Dịch sau chiết tách được đem cô giảm áp để loại dung môi, thu cao chiết thô chứa flavonoid Cao này sau cùng sẽ trải qua các quá trình tinh chế để tách riêng phần flavonoid Có một số phương pháp khác nhau để thực hiện quá trình này, chủ yếu dựa trên kỹ thuật chiết lỏng lỏng hoặc kỹ thuật chiết pha rắn (SPE: solid phase extraction)

Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị nhưng có nhược điểm là hiệu quả thu hồi thấp, dễ gây sai số, tốn thời gian và dung môi Ngày nay, SPE được sử dụng phổ biến vì tốn ít thời gian, cho kết quả nhanh, tiện lợi, hiệu quả về mặt kinh tế và có thể hoàn toàn tự động.[24]

1.8 Hoạt tính kháng oxi hóa của cao Neem [21]

Một phương pháp xác định lực kháng oxy hoá tổng (total antioxydant capacity) khác dựa theo mô hình phospho molybdenum bằng phép đo quang phổ trên cơ sở việc khử Mo (VI) thành Mo (V) bằng chất phân tích mẫu và sự hình thành tiếp theo của phức chất atacidic photphat/Mo (V) màu xanh lá cây Phương pháp này đã được tối ưu hóa

và đặc trưng theo khoảng cách tuyến tính, độ lặp lại và độ tái lập và hệ số hấp thụ mol

để định lượng một số chất chống oxy hóa

Phương pháp này phù hợp với quy mô và thiết bị của phòng thí nghiệm trường Đại Học Bà Rịa Vũng Tàu nên chúng tôi quyết định sử dụng phương pháp này để xác định lực kháng oxy hóa của cao Neem

1.9 Một số phương pháp định tính, định lượng cao Neem

1.9.1 Phương pháp định tính bằng các phản ứng và thuốc thử

1.9.1.2 Định tính Steroid – triterpenoid

Đặc điểm: Steroid là những alcol thể rắn được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, cấu

trúc tổng quát vòng cyclopentanopentanoperhyrophenantren hoặc một vài trường hợp hiếm gặp là dạng biến đổi của hệ thống vòng nói trên Steroid có nguồn gốc sinh tổng hợp như triterpen với chất liệu cơ bản là pharnesyl pyrophosphat Sterol thuộc nhóm steroid, phân bố rộng rãi, thường có mặt song song với các alkaloid hoặc saponinsteroid Chúng có nguồn gốc động vật (cholesterol) hoặc thực vật (phytosterol, β – sitosterol, ergosterol, stigmasterol,…) Sterol có mặt trong tất cả các bộ phận của cây nhưng có nhiều nhất ở các hạt có dầu dưới dạng tự do hoặc các ester Sterol là chất không phân

cực, rất ít tan trong nước, tan trong dầu béo, carotene Tan nhiều trong các dung môi không phân cực như petroleum ether, benzen, chloroform, nên thường dùng các dung môi này để chiết sterol Sản phẩm chiết được bằng dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp các ester sterol kết hợp vớ i lipid, carotene, lecitin Phải qua giai đoạn xà phòng hóa để tách các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ Tinh chế bằng kết tinh phân đoạn

Một số thuốc thử nhận biết Steroid – triterpenoid:

- Thuốc thử Liebermann – Burchard:

- Anhidrid acetic 1 ml

- H2SO4 đậm đặc

Nếu xuất hiện màu lục, hồng, cam hoặc đỏ và bền là phản ứng dương tính

Thuốc thử Salkowski: H2SO4 đậm đặc, nếu xuất hiện màu đỏ đậm, xanh, xanh tím

là phản ứng dương tính

Phản ứng Rosenthaler để phát hiện Steroid – triterpenoid:

- Vanilin 1% ethanol 2 giọt, 10 ml nước cất

- Hỗn hợp hai dung dịch và thêm đủ 100 ml nước cất

Nếu có Alkaloid sẽ xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt

1.9.1.3 Định tính Alkaloid

Đặc điểm: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ chứa dị vòng nitơ, có tính base,

thường gặp ở nhiều loại thực vật, đôi khi còn tìm thấy trong một số loài động vật Alkaloid tồn tại ở hai trạng thái rắn và lỏng Đa số chúng không tan trong nước (trừ nicotin và coniine), hầu hết tan trong dung môi hữu cơ như benzen, ether, chloroform,… Các alkaloid đa số không mùi và có vị đắng, một số ít có vị cay (piperine)

Đặc biệt alkaloid có hoạt tính sinh lý cao đối với cơ thể người và động vật, nhất là đối với hệ thống thần kinh Với một lượng nhỏ, alkaloid có thể là chất độc gây chết người (như thuốc phiện, heroin), nhưng nó có khi lại là thần dược trị bệnh đặc hiệu hay thành phần quan trọng trong một số thực phẩm (như cacao, cà phê,…)

Alkaloid có chứa lưu huỳnh thường có độc tính rất mạnh, có nhiều trong các loại nấm độc

Một số thuốc thử Alkaloid:

Thuốc thử Mayer:

- Dung dịch 1: Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 mL nước cất

- Dung dịch 2: Hòa tan 5 g KI trong 10 ml nước cất

- Hỗn hợp hai dung dịch và thêm đủ 100 ml nước cất

Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt

Đặc điểm: Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên rất nhiều

màu cho rau, quả, hoa, Phần lớn chúng có màu vàng, một số ít có màu xanh, tím, đỏ hay không màu Một số alkaloid tan trong nước, rượu, acid vô cơ loãng và base băng Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 diphenylpropan, gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một dây 3 carbon, nên thường gọi là C6-C3-C6 Nếu dây C3 đóng thì đánh số bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxygen mang số 1, rồi đánh tiếp đến vòng

Cơ sở phương pháp:

Chỉ số tạo bọt của saponin là độ loãng của nguyên liệu bằng nước để có chiều cao

1 cm khi lắc trong ống nghiệm có kích thước xác định, tiến hành trong điều kiện quy định Cách tiến hành: Cân 1 g bột nguyên liệu cho vào erlen 500 mL chứa sẵn 100 mL nước sôi Tiếp tục cho nước trong erlen sôi thêm 30 phút nữa Lọc, để nguội, thêm nước cất đến 100 mL Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm, đường kính 16 mm Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mL dịch lọc Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10 mL Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây Mỗi giây 2 lần Để yên 15 phút, sau đó đo xác định ống nghiệm có chiều cao 1 cm Chỉ

số tạo bọt được tính theo công thức:

CSB = 100 × 10𝑖Trong đó:

CSB: Chỉ số tạo bọt

i: Ống nhiệm thứ i có bọt cao trên 1 cm

Nếu cột bọt trong các ống nghiệm thấp dưới 1 cm (tức chỉ số tạo bọt dưới 100) thì coi như không có saponin

1.9.1.6 Định tính Cacbonhyđrat

Lấy 2 ml dịch chiết được xử lý bằng 2 giọt dung dịch α – Naphthol có cồn trong

ống nghiệm và sau đó 1 ml axit sunfuric đậm đặc được thêm cẩn thận dọc theo hai bên

thành ống nghiệm

Nếu lớp giữa xuất hiện màu tím cho thấy có sự hiện diện của Cacbonhyđrat

1.9.2 Phương pháp phân tích trọng lượng

Phương pháp phân tích trọng lượng là phương pháp phân tích định lượng dựa vào kết quả cân của khối lượng một chất tinh khiết hay ở dạng đơn chất có trong mẫu cần phân tích

Quá trình phân tích một chất theo phương pháp trọng lượng bao gồm các giai đoạn sau:

- Chọn mẫu và gia công mẫu

- Tách trực tiếp chất cần xác định hoặc các hợp phần của nó khỏi sản phẩm phân tích dưới trạng thái tinh khiết hóa học Tuy nhiên trong nhiều trường hợp việc làm này rất khó khăn, nhiều khi không thực hiện được, do đó chất cần xác định