ĐẶT VẤN ĐỀCây sen (Nelumbo nucifera Gaertn, Nelumbonaceae) là một dược liệu quý mà tất cả các bộ phận đều được dùng làm thuốc. Trong đó, lá sen là 1 vịthuốc hay được dùng trong y học cổ truyền với tên gọi liên diệp. Trong y học hiện đại, lá sen được sử dụng với các tác dụng: an thần, chống mất ngủ, chống loạn nhịp tim. Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đã chỉ ra tác dụng an thần, chống mất ngủ có liên quan đến alcaloid chính trong lá sen là nuciferin. Ngoài ra, nuciferin còn có tác dụng giải thắt co cơ trơn, ức chế thần kinhtrung ương, chống viêm yếu, giảm đau, giảm ho, kháng serotonin và có hoạttính phong bế thụ thể adrenergic 4. Trong ngành hóa dược, nuciferin lànguyên liệu dùng để bán tổng hợp một số chất có hoạt tính sinh học cao.Nguồn dược liệu lá sen ở nước ta rất dồi dào nên hiện nay trên thịtrường đã có nhiều sản phẩm thuốc an thần làm từ cao lá sen. Tuy nhiên, các sản phẩm này không đảm bảo về tiêu chuẩn chất lượng, khó kiểm soát hàm lượng, không an toàn cho người sử dụng. Dạng cao lá gây khó khăn trong quá trình dập viên. Do đó, việc chiết xuất nuciferin tinh khiết là rất cần thiết. Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu chiết xuất alcaloid toàn phần và tinh chế nuciferin trong lá sen nhưng các nghiên cứu đó mới chỉ tập trung ở quy mô phòng thí nghiệm, chủ yếu sử dụng dung môi chiết là ethanol với quy trình tinh chế phức tạp, rất khó triển khai ở quy mô công nghiệp, chưa có nghiên cứu về chiết xuất bằng dung môi dầu hỏa. Vì vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất alcaloid toàn phần và phân lập nuciferin từ lá sen” với mục đích làm cơ sở cho việc ứng dụng chiết xuất trên quy mô công nghiệp. Đề tài gồm các mục tiêu sau:1, Xây dựng được quy trình chiết alcaloid toàn phần từ lá sen bằng dầu hỏa.2, Xây dựng được quy trình tinh chế nuciferin.
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI 0 NGUYỄN THỊ THU HƯỜNG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT ALCALOID TOÀN PHẦN VÀ PHÂN LẬP NUCIFERIN TỪ LÁ SEN (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ) HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI 0 NGUYỄN THỊ THU HƯỜNG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT ALCALOID TOÀN PHẦN VÀ PHÂN LẬP NUCIFERIN TỪ LÁ SEN (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ) Người hướng dẫn: DS. Trần Ngọc Bảo Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp dược Trường đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình làm khóa luận, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, góp ý từ thầy cô, gia đình và bạn bè. Nhờ đó, em đã hoàn thành khóa luận và có thêm sự hiểu biết về tư duy trong nghiên cứu khoa học. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến DS. Trần Ngọc Bảo - người thầy trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình làm khóa luận. Em xin trân trọng cám ơn TS. Nguyễn Văn Hân đã giúp đỡ hướng dẫn, giúp cho em nâng cao nhận thức và phương pháp luận khi làm thực nghiệm. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô bộ môn Công nghiệp Dược, các anh chị kĩ thuật viên đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận. Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn bộ giảng viên và cán bộ trong trường, những người đã dìu dắt, truyền cho em ngọn lửa đam mê với khoa học trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động viên và giúp đỡ em rất nhiều để em hoàn thành tốt khóa luận. Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2014. Nguyễn Thị Thu Hường MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về cây sen 2 1.1.1. Đặc điểm hình thái của cây sen 2 1.1.2. Phân bố 2 1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến 3 1.1.4. Thành phần hóa học 3 1.1.5. Tác dụng sinh học của lá sen 5 1.2. Tổng quan về nuciferin 6 1.2.1. Công thức hóa học, tính chất 6 1.2.2. Nguồn gốc 6 1.2.3. Tác dụng dược lí 6 1.3. Một số phương pháp chiết xuất alcaloid toàn phần và tinh chế nuciferin từ lá sen 8 1.3.1. Phương pháp chiết alcaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực 8 1.3.2. Phương pháp chiết alcaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước acid hoặc ethanol acid 8 1.3.3. Phương pháp tinh chế nuciferin 11 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 12 2.1.1. Nguyên vật liệu 12 2.1.2. Máy móc thiết bị 13 2.2. Nội dung nghiên cứu 14 2.2.1. Khảo sát quy trình chiết alcaloid toàn phần từ lá sen. 14 2.2.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết 14 2.2.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết 14 2.2.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết 14 2.2.2. So sánh phương pháp chiết bằng dung môi dầu hỏa và EtOH 96% 14 2.2.2.1. So sánh độ tan 14 2.2.2.2. So sánh hiệu suất chiết: 14 2.2.3. Tinh chế nuciferin 15 2.3. Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1. Phương pháp định lượng 15 2.3.1.1. Định lượng alcaloid toàn phần trong lá sen 15 2.3.1.2. Định lượng alcaloid toàn phần trong tủa thô bằng phương pháp chuẩn độ acid - base 16 2.3.1.3. Định lượng nuciferin bằng phương pháp HPLC 16 2.3.1.4. Định lượng nuciferin bằng phương pháp đo quang 18 2.3.2. Phương pháp chiết xuất alcaloid toàn phần 18 2.3.2.1. Chiết bằng dung môi dầu hỏa 18 2.3.2.2. Chiết bằng dung môi EtOH 96% 19 2.3.3. Phương pháp tinh chế nuciferin 19 2.3.4. Kiểm tra độ tinh khiết, khẳng định cấu trúc sản phẩm 20 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1. Xác định hàm lượng alcaloid toàn phần trong lá sen 22 3.2. Khảo sát quy trình chiết alcaloid toàn phần từ lá sen. 22 3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết 22 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết 24 3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết 25 3.3. So sánh phương pháp chiết bằng dung môi dầu hỏa và EtOH 96% 26 3.3.1. So sánh độ tan 26 3.3.1.1. Xác định khoảng tuyến tính 27 3.3.1.2. Kết quả đo độ tan 28 3.3.2. So sánh hiệu suất 28 3.4. Tinh chế nuciferin 29 3.5. Đánh giá độ tinh khiết, khẳng định cấu trúc sản phẩm. 31 3.6. Đề xuất quy trình chiết xuất alcaloid toàn phẩn, tinh chế nuciferin 35 3.6.1. Sơ đồ quy trình 35 3.6.2. Mô tả quy trình 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Kí hiệu, chữ viết tắt Giải thích 1 ACN Acetonitril 2 alc tp Alcaloid toàn phần 3 dd Dung dịch 4 DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV 5 DMSO Dimethyl sulfoxid 6 1 H – NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 7 HPLC High performance liquid chromatography (Sắc kí lỏng hiệu năng cao) 8 IR Phổ hồng ngoại 9 m Khối lượng 10 MS Phổ khối lượng 11 R f Hệ số lưu giữ 12 SKLM Sắc kí lớp mỏng 13 Tb Trung bình 14 TEA Triethylamin DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung bảng Trang 2.1 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu 12 2.2 Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm 13 3.1 Hàm lượng alcaloid toàn phần trong lá sen. 22 3.2 Hàm lượng alcaloid toàn phần và hiệu suất chiết theo thời gian 23 3.3 Hàm lượng alcaloid toàn phần và hiệu suất chiết theo số lần chiết. 24 3.4 Hàm lượng alcaloid toàn phần và hiệu suất chiết theo nhiệt độ. 25 3.5 Độ hấp thụ của dung dịch nuciferin trong EtOH 96% 27 3.6 Độ tan của nuciferin trong dầu hỏa và trong EtOH 96% 28 3.7 So sánh 2 phương pháp chiết xuất bằng dung môi EtOH 96 0 và dung môi dầu hỏa 28 3.8 Khối lượng alcaloid toàn phần thu được, hàm lượng nuciferin và hiệu suất tinh chế 30 3.9 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của nuciferin (IR, KBr) 32 3.10 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 33 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ STT Danh mục các hình ảnh, đồ thị Trang 1 Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất chiết vào thời gian chiết. 23 2 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất chiết vào số lần chiết. 24 3 Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất chiết vào nhiệt độ chiết. 26 4 Hình 3.4. Đồ thị biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ 27 5 Hình 3.5. Sắc kí đồ của dung dịch nuciferin chuẩn. 30 6 Hình 3.6. Sắc kí đồ của mẫu nuciferin tinh chế. 31 7 Hình 3.7. Sắc kí đồ của mẫu alcaloid toàn phần. 31 8 Hình 3.8. Sắc kí đồ nuciferin tinh chế được với các hệ dung môi. 32 9 Hình 3.9. Sơ đồ chiết xuất alcaloid toàn phần và tinh chế nuciferin. 35 10 Hình 3.10. Hình ảnh alcaloid toàn phần. 36 11 Hình 3.11. Hình ảnh nuciferin tinh khiết. 37 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn, Nelumbonaceae) là một dược liệu quý mà tất cả các bộ phận đều được dùng làm thuốc. Trong đó, lá sen là 1 vị thuốc hay được dùng trong y học cổ truyền với tên gọi liên diệp. Trong y học hiện đại, lá sen được sử dụng với các tác dụng: an thần, chống mất ngủ, chống loạn nhịp tim. Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đã chỉ ra tác dụng an thần, chống mất ngủ có liên quan đến alcaloid chính trong lá sen là nuciferin. Ngoài ra, nuciferin còn có tác dụng giải thắt co cơ trơn, ức chế thần kinh trung ương, chống viêm yếu, giảm đau, giảm ho, kháng serotonin và có hoạt tính phong bế thụ thể adrenergic [4]. Trong ngành hóa dược, nuciferin là nguyên liệu dùng để bán tổng hợp một số chất có hoạt tính sinh học cao. Nguồn dược liệu lá sen ở nước ta rất dồi dào nên hiện nay trên thị trường đã có nhiều sản phẩm thuốc an thần làm từ cao lá sen. Tuy nhiên, các sản phẩm này không đảm bảo về tiêu chuẩn chất lượng, khó kiểm soát hàm lượng, không an toàn cho người sử dụng. Dạng cao lá gây khó khăn trong quá trình dập viên. Do đó, việc chiết xuất nuciferin tinh khiết là rất cần thiết. Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu chiết xuất alcaloid toàn phần và tinh chế nuciferin trong lá sen nhưng các nghiên cứu đó mới chỉ tập trung ở quy mô phòng thí nghiệm, chủ yếu sử dụng dung môi chiết là ethanol với quy trình tinh chế phức tạp, rất khó triển khai ở quy mô công nghiệp, chưa có nghiên cứu về chiết xuất bằng dung môi dầu hỏa. Vì vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất alcaloid toàn phần và phân lập nuciferin từ lá sen” với mục đích làm cơ sở cho việc ứng dụng chiết xuất trên quy mô công nghiệp. Đề tài gồm các mục tiêu sau: 1, Xây dựng được quy trình chiết alcaloid toàn phần từ lá sen bằng dầu hỏa. 2, Xây dựng được quy trình tinh chế nuciferin. [...]... Nuciferin được tìm thấy ở các bộ phận của cây sen là tâm sen, lá sen và gương sen Tuy hàm lượng alcaloid toàn phần trong tâm sen là cao nhất (1,23%), trong lá sen (0,89%) và gương sen (0,24%) nhưng hàm lượng nuciferin trong lá sen lại nhiều hơn tâm sen do nuciferin là alcaloid chính trong lá sen, alcaloid chính trong tâm sen là liensinin và neferin [8] 1.2.3 Tác dụng dược lí Nuciferin chiết từ lá sen. .. lấy hạt (liên nhục) Tâm sen là chồi mầm trong hạt sen (liên tâm) Gương sen đã lấy quả (liên phòng) Tu sen bỏ hạt ở đầu (liên tu) Thân rễ gọi là ngó sen (liên ngẫu) Tất cả đều phơi khô hay sấy khô 1.1.4 Thành phần hóa học [2], [4], [8], [15] Lá sen có nhiều alcaloid đã được phân lập và xác định cấu trúc: nuciferin, anonain, roemerin, pronuciferin, N-nornuciferin, O-nornuciferin, nepherin, liriodenin,... armepavin, N-norarmepavin, dehydronuciferin, dehydroanonain, N-methylisococlaurin, N-methylcoclaurin Trong đó, nuciferin là alcaloid chính Ngoài alcaloid, lá sen còn có các flavonoid: quercetin, isoquercitrin, leucocyanidin, leucodelphinidin… 4 Công thức hóa học của một số alcaloid chính có trong lá sen: pronuciferin Nuciferin R= CH3 R1= R2= CH3 CH3 N- nornuciferin CH3 CH3 CH3 O- nornuciferin H CH3 CH3 Anoanin... chiết alcaloid toàn phần từ lá sen, mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu về phương pháp chiết lá sen bằng dung môi dầu hỏa nên chúng tôi thực hiện nghiên cứu xây dựng quy trình chiết bằng dầu hỏa để xem xét khả năng ứng dụng vào quy mô công nghiệp 1.3.3 Các phương pháp tinh chế nuciferin Các tài liệu đã công bố chủ yếu sử dụng phương pháp sắc kí cột để phân lập nuciferin. .. ion lỏng đã được phát triển nghiên cứu để chiết xuất 3 alcaloid là N-nornuciferin, O-nornuciferin và nuciferin từ lá sen Quy trình chiết: trộn 0,5 g bột dược liệu với 10 ml dung dịch ion lỏng thành hỗn dịch, chiết xuất hỗn dịch bằng cách chiếu sóng ngắn vào hỗn dịch Sau đó, làm lạnh xuống nhiệt độ phòng, rửa giải bằng 50ml nước đã loại ion, lọc qua màng lọc 0,45 µm rồi đem phân tích bằng HPLC Wenyan... chế chống loạn nhịp tim của lá sen là do làm tăng ngưỡng kích thích tâm trương và tăng giai đoạn trơ của cơ tâm nhĩ và tâm thất LD50 của lá sen tiêm phúc mạc trên chuột nhắt trắng là 17g/kg thể trọng Alcaloid toàn phần của lá sen có tác dụng ức chế loạn nhịp tim thực nghiệm, tác dụng này của alcaloid lá sen có phần tốt hơn ajmazin [4] Một trong những tác dụng của lá sen đang rất được quan tâm hiện... xác định độ tan của nuciferin trong EtOH 96% ở 250C và 780C, trong dầu hỏa ở 250C và 1000C 2.2.2.2 So sánh hiệu suất chiết: Chiết alcaloid toàn phần trong lá sen trong dung môi dầu hỏa và EtOH 96% theo mục 2.3.2 ; xác định khối lượng tủa alcaloid toàn phần, hàm lượng, hiệu suất chiết từ đó lựa chọn dung môi chiết thích hợp 15 2.2.3 Tinh chế nuciferin Tiến hành tinh chế nuciferin từ alcaloid toàn phần... thuốc hỗ trợ điều trị đái tháo đường ngày một tăng, nuciferin có tiềm năng trở thành nguồn nguyên liệu đóng vai trò quan trọng trong ngành dược không chỉ ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới 8 1.3 Một số phương pháp chiết xuất alcaloid toàn phần và tinh chế nuciferin từ lá sen 1.3.1 Phương pháp chiết alcaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực [1] Sử dụng dung môi chiết là các dung môi... toàn phần của tâm và lá sen có tác dụng an thần, tăng trương lực và co bóp cơ tử cung thỏ, chống co thắt cơ trơn ruột gây nên bởi lustamin và acetylcholine Lá sen có tác dụng chống choáng phản vệ Tác dụng an thần của tâm sen yếu hơn lá sen [4] Lá sen có tác dụng bảo vệ đối với các rối loạn nhịp tim gây nên do calci clorid, làm giảm số chuột chết và chuột bị rung tâm thất Lá sen cũng có tác dụng chống... LUẬN 3.1 Xác định hàm lượng alcaloid toàn phần trong lá sen Mục đích để tính hiệu suất trong quá trình chiết Tiến hành định lượng 5 lần theo DĐVN IV Kết quả thu được ghi trong bảng 3.1 Bảng 3.1 Hàm lượng alcaloid toàn phần trong lá sen Hàm lượng alcaloid toàn phần Lần mdược liệu (g) 1 2,0019 0,8252 2 2,0299 0,9026 3 2,0114 0,8799 4 2,0270 0,8732 5 2,0098 0,8807 trong lá sen (%) Tb 0,8723 SD 0,028573 . gốc Nuciferin được tìm thấy ở các bộ phận của cây sen là tâm sen, lá sen và gương sen. Tuy hàm lượng alcaloid toàn phần trong tâm sen là cao nhất (1,23%), trong lá sen (0,89%) và gương sen. hàm lượng nuciferin trong lá sen lại nhiều hơn tâm sen do nuciferin là alcaloid chính trong lá sen, alcaloid chính trong tâm sen là liensinin và neferin [8]. 1.2.3. Tác dụng dược lí Nuciferin. Do đó, việc chiết xuất nuciferin tinh khiết là rất cần thiết. Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu chiết xuất alcaloid toàn phần và tinh chế nuciferin trong lá sen nhưng các nghiên cứu đó mới chỉ tập