bước đầu nghiên cứu đăc điểm thưc vât, thành phần tinh dầu và đánh giá tính kháng khuẩn của tinh dầu cây giổi michelia tonkinensis a chev thu hái taị hòa bình

Các hợp chất được chiết xuất và phân lập từ thảo dược đã thể hiện nhiều ưu điểm nổi bật như: cấu trúc hóa học đa dạng, hoạt tính sinh học phong phú, hoạt chất có các tính chất lý h

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI PHA ̣M ÁI CHÂU

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN TINH DẦU VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG KHUẨN

CỦA TINH DẦU CÂY GIỔI MICHELIA

HÒA BÌNH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI PHA ̣M ÁI CHÂU MÃ SINH VIÊN: 1301035

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN TINH DẦU VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG KHUẨN

CỦA TINH DẦU CÂY GIỔI MICHELIA

HÒA BÌNH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Ha ̀ Vân Oanh

2 HVCH Đỗ Văn Ha ̉ i

Nơi thực hiê ̣n:

1 Bô ̣ môn Dươ ̣c ho ̣c cổ truyền, trường đa ̣i ho ̣c Dươ ̣c Hà Nô ̣i

2 Phòng Phân tích hóa học, viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam

3 Khoa Vi sinh, viê ̣n kiểm nghiê ̣m thuốc Trung ương

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận, em đã may mắn nhận được sự hỗ trợ, giúp đỡ của nhiều thầy cô, anh chị Với tình cảm chân thành, cho phép em được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất cả các cá nhân, tập thể đã tạo điều kiện giúp

đỡ em trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu đề tài

Trước hết em xin gửi tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Dược học cổ truyền – trường đại học Dược Hà Nội lời chúc sức khỏe và lời cảm ơn sâu sắc

Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới TS Hà Vân Oanh và DS

Đỗ Hải, người không quản ngại khó khăn trực tiếp hướng dẫn, quan tâm động viên và chỉ bảo tận tình để em hoàn thành tốt khóa luận này

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể các thầy cô giáo trong trường, các cán bộ phòng ban, thư viện – trường đại học Dược Hà Nội đã hết sức tạo điều kiện cho

em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài

Tuy nhiên, với điều kiện thời gian cũng như kinh nghiệm còn hạn chế của một sinh viên, khóa luận này không thể tránh khỏi những thiếu sót Em kính mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của các thầy cô để hoàn thiện hơn khóa luận cũng như làm bài học, hành trang cho sự nghiệp sau này

Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2018 Sinh viên

Châu Bùi Phạm Ái Châu

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 8

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 10

1.1 Tổng quan về chi Michelia Linnaeus 10

1.1.1 Vị trí phân loại 10

1.1.2 Đặc điểm hình thái của chi Michelia L 10

1.1.3 Sự đa dạng và phân bố của chi Michelia L 10

1.1.4 Thành phần hóa học một số loài thuộc chi Michelia L 13

1.1.5 Tác dụng sinh học của một số loài thuộc chi Michelia L 14

1.2 Tổng quan về loài Michelia tonkinensis A Chev 17

1.2.1 Tên khoa học và vị trí phân loại 17

1.2.2 Đặc điểm hình thái 18

1.2.3 Phân bố, sinh thái 18

1.2.4 Thành phần hóa học 19

1.2.5 Tác dụng sinh học 19

1.2.6 Công dụng 19

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 20

2.1.1Nguyên liệu 20

2.1.2 Dung môi, hóa chất 20

2.1.3 Trang thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm 20

2.2 Nội dung nghiên cứu 21

2.3 Địa điểm nghiên cứu 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu 21

2.4.1 Giám định tên khoa học và nghiên cứu đặc điểm thực vật 21

2.4.2 Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu 21

2.4.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn 25

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31

3.1 Đặc điểm hình thái cây 31

3.2 Đặc điểm vi học 34

3.2.1 Đặc điểm vi phẫu lá 34

3.2.2 Đặc điểm vi phẫu vỏ quả 35

3.2.3 Đặc điểm bột lá 35

3.2.4 Đặc điểm bột hạt 36

3.3 Kết quả định lượng tinh dầu 37

3.3.1 Kết quả định lượng tinh dầu lá Giổi 37

3.3.2 Kết quả định lượng tinh dầu hạt Giổi 37

3.4 Kết quả phân tích thành phần hóa học tinh dầu 38

3.4.1 Kết quả phân tích thành phần tinh dầu lá Giổi 38

3.4.2 Kết quả phân tích thành phần tinh dầu hạt Giổi 40

3.5 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu 40

3.5.1 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu hạt Giổi 40

3.5.2 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu lá Giổi 43

3.6 Nhận xét, bàn luận 45

3.6.1 Về đặc điểm thực vật loài Michelia tonkinensis 45

3.6.2 Về kết quả định lượng tinh dầu 45

3.6.3 Về phân tích thành phần hóa học 46

3.6.4 Về kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu 48

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

KẾT LUẬN 51 KIẾN NGHỊ 52

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân bố và công dụng của một số loài thuộc chi

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học một số loài

Bảng 3.5 Đường kính vòng vô khuẩn thu được trên dung dịch

Bảng 3.8 So sánh một số yếu tố khác biệt giữa các nghiên cứu về

Bảng 3.9 So sánh giá trị MBC/MFC của tinh dầu lá Giổi với một

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 2.1 Dụng cụ xác định hàm lượng nước bằng

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thuốc có nguồn gốc từ thảo dược đã có lịch sử rất lâu đời trong việc phòng, chữa trị nhiều loại bệnh và vẫn đang tiếp tục trở thành một trong những nguồn nguyên liệu chính để nghiên cứu và tìm kiếm các loại thuốc mới Tổ chức y tế thể giới (WHO)

đã báo cáo rằng, khoảng 80% dân số thế giới tin tưởng vào việc sử dụng các loại thảo dược cũng như các thuốc có nguồn gốc từ thảo dược trong điều trị bệnh Các hợp chất được chiết xuất và phân lập từ thảo dược đã thể hiện nhiều ưu điểm nổi bật như: cấu trúc hóa học đa dạng, hoạt tính sinh học phong phú, hoạt chất có các tính chất lý hóa thích hợp, dễ dàng được hấp thụ và chuyển hóa trong cơ thể mà độc tính lại thấp Do đó, các hợp chất này đã và đang tiếp tục trở thành các nhân tố quan trọng trong việc tìm kiếm, tổng hợp và bán tổng hợp các hoạt chất mới có tác dụng chữa bệnh cho con người Năm 2017, Chính phủ đã chủ trì cuộc họp nhằm tìm hướng cho phát triển dược liệu và các sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu ở nước ta Cùng với xu hướng đó, đề

tài “Nghiên cứu khai thác và phát triển nguồn gen Giổi ăn hạt (Michelia tonkinensis A

Chev.) tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam” đã được Bộ Khoa học và Công nghệ phê duyệt danh mục đặt hàng nhiệm vụ Khoa học và Công nghệ về Quỹ Gene cấp quốc gia

Cây Giổi đã được nhân dân vùng Hà Tây, Hòa Bình (đặc biệt người dân tộc Mường) dùng quả giã với muối làm gia vị; ngoài ra còn dùng làm thuốc chữa đau bụng, ăn uống không tiêu, xoa bóp khi đau nhức, tê thấp [10] Mặc dù nguồn nguyên liệu Giổi rất dồi dào nhưng hầu như chưa có nghiên cứu đầy đủ về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của dược liệu này Để góp phần bổ sung cơ sở dữ liệu thực vật, hóa học cũng như nâng cao giá trị tiềm năng của cây Giổi trong kho tàng cây thuốc Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài “Bước đầu nghiên cứu đặc điểm thực vật,

thành phần tinh dầu và đánh giá tính kháng khuẩn của tinh dầu cây Giổi Michelia

tonkinensis A Chev thu hái tại Hòa Bình” với một số mục tiêu cụ thể như sau:

- Nghiên cứu đặc điểm thực vật, giám định tên khoa học cây Giổi ăn hạt Michelia

tonkinensis A Chev

- Nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học của tinh dầu lá Giổi, hạt Giổi

- Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá Giổi, hạt Giổi

Để thực hiện mục tiêu trên, đề tài tiến hành những nội dung sau:

- Mô tả chi tiết đặc điểm hình thái, đặc điểm vi phẫu, đặc điểm bột và giám định

tên khoa học của cây Giổi ăn hạt Michelia tonkinensis A Chev

- Định lượng và phân tích thành phần tinh dầu trong mẫu lá và hạt Giổi

- Thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu mẫu lá và hạt Giổi

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Michelia Linnaeus

1.1.1 Vị trí phân loại

Chi Michelia Linnaeus thuộc họ Ngọc lan (Magnoliaceae), bộ Ngọc lan

(Magnoliales), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [45]

1.1.2 Đặc điểm hình thái của chi Michelia L

Các đại diện của chi Michelia L là cây gỗ hoặc cây bụi, thường xanh Vỏ cây

thường có màu xám, nhẵn, đôi khi có rãnh Cành giòn dễ bẻ, thường có lỗ vỏ, có các vết sẹo dạng vòng

Lá kèm đơn độc hoặc dính với nhau ở gốc, rụng sớm để lại các vết sẹo dạng vòng ở cành Lá đơn nguyên, xếp xoắn ốc Lá non thẳng hoặc gập đôi trong chồi

Hoa lưỡng tính, mọc nách lá, đơn độc Cánh hoa 6-21, mẫu 3 hoặc mẫu 6, gần như nhau hoặc hiếm khi cánh vòng ngoài khác biệt Bao phấn mở trong, bên hoặc gần bên, trung đới hình mấu nhọn, dài hoặc ngắn Lá noãn 1 vài (hiếm khi 1) hoặc rất nhiều, thường không hoàn chỉnh, rời hoặc đính nhau, noãn 2 đến nhiều

Quả thường hình trứng; noãn chín chất da hoặc gỗ, dính lấy trục, không có cuống hoặc cuống ngắn, mở thành hai mảnh ở đường nối mặt lưng hoặc cả mặt lưng và bụng, đầu

có mỏ ngắn và rất chắc Có từ 2 tới vài hạt trên 1 noãn, màu đỏ hoặc nâu [31], [14]

1.1.3 Sự đa dạng và phân bố của chi Michelia L

Theo Thực vật chí Trung Quốc, trên thế giới, chi Giổi (Magnoliaceae : Michelia

L.) có khoảng 70 loài phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Á, ở Trung Quốc có khoảng 37-39 loài [31]

Ở Việt Nam, Phạm Hoàng Hộ (1999) đã mô tả 19 loài thuộc chi Michelia L và hai loài thuộc các chi khác Paramichelia Hu và Tsoongiodendron Chun mà nay đã trở thành tên đồng nghĩa (synonym) của Michelia L., Michelia baillonii (Pierre) Finet & Gagnep và M.odora (Chun) Nooteboom & B.L.Chen Theo Nguyễn Tiến Bân (2003) chi này ở Việt Nam có 18 loài và 1 thứ M.floribunda Finet & Gagnep var tokinensis Dandy và 3 loài thuộc chi khác nhưng nay cũng đã trở thành synonym của Michelia

braianensis, M baillonii và M.odora Tiếp đó, Vũ Quang Nam (2009) và Vũ Quang

Nam & Xia Nian He (2009) đã thông báo và bổ sung thêm 2 loài, đó là Giổi annam

(Michelia Gioii (A Chev) Sima & H Yu) và Giổi Sapa (M velutina DC.) Gần đây cũng đã ghi nhận thêm loài Giổi lông nâu (Michelia Fulva Chang et B.L Chen) và Giổi lá bạc (M flaviflora Y W Law & Y F Wu) [12]

Phân bố và công dụng của một số loài thuộc chi Michelia L ở Việt Nam được

thể hiện ở Bảng 1.1

Bảng 1.1: Phân bố và công dụng của một số loài thuộc chi Michelia L ở Việt Nam

TT Tên Việt

(Michelia figo) Hà Nội, Hà Nam

Hoa dùng ướp

hoa

Magnolia floribunda (Michelia floribunda)

Lào Cai, Lâm Đồng

Gỗ đóng đồ gia

3 Giổi lá nhẵn

Magnolia foveolata

(Michelia

foveolata)

Lào Cai, Yên Bái, Vĩnh Phúc, Nghệ An, Đà

(Michelia

mediocris)

Lào Cai, Sơn La, Thanh Hóa, Nghệ An, Kon Tum, Gia Lai, Lâm Đồng

Gỗ dùng trong xây dựng, hạt dùng làm gia vị, chữa sốt, đau bụng

[1], [8]

baillonii

Lai Châu, Sơn

La, Lào Cai, Yên Bái, Quảng Bình đến Huế,

Gỗ dùng trong xây dựng Vỏ đắng có khi dùng làm thuốc hạ

[1], [8]

1.1.4 Thành phần hóa học một số loài thuộc chi Michelia L

Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của một số loài trong chi Michelia L được

thể hiện ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học một số loài trong chi Michelia L

lacton

Costunolid, satamarin, reynosin,parthenolid, lipiferolid

[29]

Magnolia masticata

5 Magnolia

Levoxin (15,59%), methylcyclopropanr (24,26%), 2-beta-pinen (5,3%), caryophyllen oxit (4,01%) và beta-caryophyllen (1,7%)…

[19]

(E)-β-caryophyllen (23,7%), α-humulen (11,6%), geraniol (9,1%), borneol (7,0%)…

[36]

1.1.5 Tác dụng sinh học của một số loài thuộc chi Michelia L

Sau đây là các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của một số loài thuộc chi Michelia

L

a Tác dụng kháng khuẩn

Năm 2015, Dalvi Sanjay Marotrao đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu

Michelia champaca L Tinh dầu từ hoa Michelia champaca L thu được bằng cách sử

dụng n-Hexan để trích ly Sau đó dịch chiết tinh dầu hexan này được đem đi thử hoạt

tính kháng khuẩn Một sự ức chế nhẹ đã được tìm thấy đối với Staphylococcus aureus,

một vi khuẩn Gram dương bằng phương pháp thử độ nhạy trên đĩa Người ta quan sát

thấy 25% Staphylococcus aureus bị ức chế bằng phương pháp khuếch tán ống Durham chứng tỏ dịch chiết tinh dầu Michelia champaca có hiệu lực kháng khuẩn thấp [24]

b Tác dụng chống ung thư

Trong một nghiên cứu năm 2014, Chien-Hsing Lee và các cộng sự chỉ ra rằng: (-) –

anonaine là một alkaloid được phân lập từ lá của Michelia alba Các nghiên cứu hiện

tại đã chứng minh rằng (-) - anonaine thể hiện một số tác dụng dược lý, bao gồm hiệu quả chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống nấm và chống trầm cảm Điều quan trọng là các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng (-) - anonaine có một số hoạt tính chống ung thư Điều trị với (-) - anonaine gây ra phá hủy DNA phụ thuộc liều tương quan với sự tăng natri oxyd nội bào, các dạng oxy hoạt hóa, sự suy giảm glutathione, kích hoạt

caspase 3, 7, 8, và 9 và sự phân tách poly ADP ribose polymerase quy định sự biểu hiện của Bax cũng như các protein p53 (Chú thích: Caspase là viết tắt của cysteine-aspartic protease là một họ của protease cysteine đóng vai trò quan trọng trong quá trình chết tế bào theo chu kì, hoại tử và sưng viêm; Bax là một trong các protein có vai trò kích thích sự chết theo chu trình của tế bào) Ngoài ra, (-) - anonaine đã được báo cáo là ức chế đáng kể di căn của các tế bào ung thư phổi [23]

Cũng trong năm 2014, Yu-Yi Chan và cộng sự công bố: Để đánh giá hoạt động ức chế

tăng trưởng đối với tế bào ung thư của các hoạt chất được phân lập từ Michelia

compressa, 6 dòng tế bào khác nhau từ khối u ác tính bao gồm: ung thư biểu mô vòm

họng người (NPC-TW01), ung thư phổi tế bào không nhỏ (NCI-H226), bệnh bạch cầu

tế bào T (Jurkat), ung thư biểu mô thận (A498), ung thư biểu mô phổi (A549) và fibrosacoma (HT1080) được sử dụng Kết quả cho thấy điều trị liriodenine và

oliveroline (phân lập được từ M compressa) ức chế các dòng tế bào ung thư ở người

với giá trị IC50 trong khoảng 15,7-3,68 μM Hơn nữa, liriodenine và oliveroline thể hiện hoạt tính ức chế mạnh mẽ chống lại ung thư thận (A498) với giá trị IC50 4,52 -

3,62 μM Nghiên cứu cho thấy gỗ lõi của M compressa var formosana và các chất

phân lập của nó có thể được xem như là những ứng cử viên tiềm năng cho sự phát triển của nhóm thuốc chống ung thư mới [52]

Cùng năm 2014, Vanessa Mara Chapla và cộng sự có đề cập trong một nghiên cứu: Các hoạt tính chống ung thư của dịch chiết và các hợp chất tinh khiết được phân lập từ

Michelia champaca được nghiên cứu bằng cách sử dụng DNA tái tổ hợp của nấm men

S cerevisiae để sàng lọc Nghiên cứu sinh học này là một mô hình đánh giá hoạt tính

chống ung thư dựa trên việc sử dụng các dòng nấm men biến đổi gen Tất cả các dịch chiết được thử ở liều 2 mg/mL (100 μL) trong các giếng chứa môi trường nuôi cấy với các chủng khác nhau [52Y Rad (0,05-0,1), Rad + (0,05) và 321 Rad (0,05 đến 0,1)] và

ủ trong 48 h Các hợp chất đối chiếu: camptothecin (4 và 5 μg / ml đối với RAD + và 52Y Rad) và streptonigrin (200 μg / mL đối với 321 Rad) Kết quả được báo cáo là giá trị IC12 (biểu thị nồng độ cần thiết để tạo ra một vùng ức chế đường kính 12mm xung quanh một giếng chứa 100 μl có chứa dịch nấm men) Một dịch chiết được coi là có hoạt tính nếu nó thể hiện hoạt tính chọn lọc chống lại một hoặc nhiều dòng nấm men

tái tổ hợp và biểu hiện giá trị IC12 dưới 2000 Kết quả nghiên cứu cho thấy 3 dịch

chiết được chiết xuất từ lá M champaca thể hiện hoạt tính chống ung thư ở mức trung

bình [48]

c Tác dụng bảo vệ da

Năm 2014, theo Chien-Hsing Lee và các cộng sự: Tyrosinase được biết đến như là enzyme đầu tiên trong nghiên cứu tổng hợp các sắc tố melanin chịu trách nhiệm quy định màu da, tóc và mắt (Slominski et al, 2005) Trong tế bào bạch cầu da người, sự ức chế tyrosinase ở tế bào được kiểm tra bằng việc chuyển đổi L-tyrosine và oxy hóa L-DOPA thành dopaquinone (Park et al., 2009) Nghiên cứu gần đây cho thấy một trong

những hoạt chất của Michelia alba có khả năng ức chế tyrosinase và làm giảm tyraxin,

melanin trong tế bào biểu bì ở người mà không gây độc tế bào Bên cạnh đó, chiết xuất

từ lá Michelia alba và dịch thủy phân của chúng có thể làm giảm tác hại của tia UVB

do metalloproteinase, elastase, acid hyaluronic và procolagen kiểu I trong các nguyên bào sợi ở người (Chiang et al., 2012).[23]

d Tác dụng ức chế sự sản sinh Nitric Oxide (NO)

Năm 2014, Yu-Yi Chan và cộng sự phát hiện: Các hợp chất phân lập từ Michelia

compressa được đem kiểm tra tác động của chúng đối với việc sản xuất NO do LPS

gây ra trong dòng tế bào macrophage chuột RAW 264.7 Tế bào RAW 264.7 được ủ với nồng độ khác nhau của các hợp chất này và LPS (100 ng / mL) trong 24 giờ để phát hiện sự sản xuất NO NO đóng vai trò là chất dẫn truyền thần kinh, chất giãn mạch, và chất điều tiết miễn dịch trong nhiều mô khác nhau ở nồng độ sinh lý Nồng độ NO cao do synthase nitric oxide gây ra (iNOS) được xác định là một yếu tố gây độc trong quá trình viêm Sau 24 giờ ủ, môi trường nuôi cấy non-LPS đã được sử dụng làm đối chứng nồng độ nitrit Nitrit tích lũy trong môi trường nuôi cấy được ước lượng bằng phản ứng Griess như là một chỉ số NO phóng thích từ tế bào Trong nghiên cứu này, NO sản xuất đã được giảm đáng kể bằng cách điều trị với roemerine và

cyathisterol (được phân lập từ Michelia compressa) theo liều qui định, với giá trị IC50

lần lượt là 8,5 ± 0,3 và 9,6 ± 0,5 μg / mL [52]

e Tác dụng chống nấm

Năm 2014, theo Vanessa Mara Chapla và các cộng sự: Các dịch chiết và các hợp chất

phân lập từ cây Michelia champaca được đánh giá tính kháng nấm đối với các nấm

Cladosporium cladosporioides (Fresen) Vries SPC 140 và C sphaerospermum

(Perzig) SPC 491 Nystatin 1.0 μg được sử dụng như một đối chứng dương tính Các mẫu được tiến hành trên các tấm TLC silicagel đã được lót sẵn dung dịch (10 μL) có chứa: 200 μg dịch chiết thô hoặc 100.0, 50.0, 25.0, 10.0, 5.00 và 1.00 μg dịch hoạt chất tinh khiết Sau khi khai triển với CHCl3: CH3OH (9: 1), các tấm silicagel được phun rải dịch nấm và ủ ở 25°C trong 2-3 ngày Hoạt tính kháng nấm được xác định là các vùng sạch (không có nấm) trên nền nấm Đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy tất

cả các chất đã chiết xuất được từ Michelia champaca đều có hoạt tính kháng nấm ít

nhất là ở mức trung bình [48]

1.2 Tổng quan về loài Michelia tonkinensis A Chev

1.2.1 Tên khoa học và vị trí phân loại

Cây Giổi ăn hạt hay còn có tên gọi khác là Giổi ngọt, Giổi lúa [8], Giổi ăn quả

[16] có tên khoa học là Michelia tonkinensis A Chev, tên đồng nghĩa là Michelia

hypolampra Dandy, Magnolia hypolampra (Dandy) Figlar; Michelia hedyosperma Y

W Law [30], [49] Talauma gioi A Chev, Michelia gioii (A Chev) Sim & Hong Yu

thuộc họ Ngọc lan (Magnoliaceae) [49]

Dựa vào hệ thống phân loại thực vật của Takhtakjan, khung phân loại của

ngành Ngọc lan, vị trí phân loại của cây Giổi ăn hạt (Michelia tonkinensis A Chev)

được thể hiện như sau: [45]

Giới: Thực vật (Plantae)

Chi: Michelia Linnaeus

Loài: Michelia tonkinensis A Chev

1.2.2 Đặc điểm hình thái

Cây gỗ lớn cao đến 21m, đường kính thân có thể đến 60cm Chồi, cuống lá non, nụ hoa phủ đầy lông tơ mịn màu sáng Cành con màu xám đen chuyển sang màu nâu nhạt khi già, rải rác các lỗ bì Lá hình trứng ngược đến elip hẹp, kích cỡ khoảng 6-13 × 5-5,5 cm, phiến lá dai, cứng, mùi thơm giống lá hồi khi vò nát Cả hai mặt phiến lá màu xanh lục tươi, bóng, không lông, gân bên 8-10 đôi nổi rõ, gân tam cấp hình mạng dày, dễ nhận thấy bằng mắt thường Nụ hoa hình elip hẹp, dài khoảng 2 cm Hoa đơn độc, mùi thơm Bao hoa 9, mẫu 3; bao hoa bên ngoài thuôn dài kích cỡ khoảng 15 × 2 mm; bao hoa bên trong hình elip hẹp, kích cỡ khoảng 1,5-2 × 0,6 cm Nhị nhiều khoảng 25, trung đới dài khoảng 8-9 mm, có mũi nhọn khoảng 1-1,5 mm Quả tụ gồm khoảng 5 đại, mỗi đại chứa 6-8 hạt, mặt ngoài phủ dày đặc các lỗ vỏ màu sáng Đại khi chín mở thành 2 mảnh, vỏ các đại dày, nạc [30]

1.2.3 Phân bố, sinh thái

Giổi phân bố ở các tỉnh miền núi như Lào Cai (Văn Bàn), Yên Bái, Tuyên Quang (Nà Hang), Phú Thọ (Thanh Sơn), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Thanh Hóa, Nghệ

An, Hà Tĩnh (Hương Sơn), Gia Lai và Kon Tum Cây thường mọc trong các quần hệ

rừng kín, thường xanh ẩm, lẫn với một số loài cây gỗ khác như Michelia faveolata,

Pelthoforum ferrugineum, … ở độ cao từ 300 đến 800 m Đôi khi cũng thấy cây mọc

ngay ở ven rừng ẩm Giổi là cây ưa sáng, khi còn nhỏ chịu bóng, mọc nhanh Cây ra hoa quả hàng năm nhưng không đều Theo nhân dân ở Yên Lập (Phú Thọ), những cây con đem về trồng ở vườn sau khoảng 6-7 năm bắt đầu có hoa quả, những năm sau lượng hoa quả càng nhiều hơn Hạt rơi vãi dưới tán rừng có khả năng nảy mầm tốt Cây còn nhỏ nếu bị chặt hoặc gãy vẫn có thể mọc lại Gỗ Giổi có màu vàng nhạt sau chuyển sang màu nâu vàng, thường được dùng đóng hòm tủ và làm nhà cửa Hạt Giổi là loại gia vị quý và cũng là đặc sản của Việt Nam Cây trồng được bằng hạt và có thể trồng rừng.[2]

1.2.4 Thành phần hóa học

Cho đến nay, các nghiên cứu về cây Giổi ăn hạt thường chỉ tập trung vào phương pháp tạo giống, chăm sóc phát triển chứ hầu như có rất ít nghiên cứu về thành phần hóa học

Năm 1997, Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự dùng phương pháp sắc ký khí và sắc ký khí kết hợp khối phổ để xác định thành phần hóa học của các bộ phận lá, thân, vỏ, thịt quả, hạt của cây Giổi Kết quả thấy rằng thịt quả và hạt chứa safrole: 70,2% (thịt quả), 72,9% (hạt) và methyl eugenol 24,2% (thịt quả) và 18,5 % (hạt) Tinh dầu ở thân chứa chủ yếu là camphor (23,8%) Tinh dầu vỏ cây chứa camphor (15,7%), safrole (14,3%), β-caryophylen (15,6%) và elemicin (13,7%) Tinh dầu lá có thành phần chủ yếu là

Theo nghiên cứu của Đỗ Ngọc Đài, hàm lượng tinh dầu trong lá Giổi là 0,15% (tt/kl) theo khối lượng dược liệu khô tuyệt đối, với các thành phần chính là α-pinen (40,3%), β-phellandren (7,6%), β-pinen (7,4%) và bicyclogermacren (7,3%) [26]

1.2.5 Tác dụng sinh học

Hiện nay, hầu như chưa có nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây Giổi ăn hạt

Michelia tonkinensis

1.2.6 Công dụng

Theo y học cổ truyền, quả và hạt Giổi có vị cay, thơm, tính ấm Vỏ cây có vị đắng, hơi thơm, tính ấm Cả quả và vỏ cây đều có tác dụng tiêu thực, khu phong, thanh nhiệt

Quả và vỏ cây Giổi được dùng làm thuốc kích thích tiêu hóa, trị đau bụng, ăn không tiêu Vỏ cây còn được dùng làm thuốc chữa sốt Ngày dùng 6-10 g quả, 20-30 g vỏ cây, sắc uống Quả (100 g) hoặc vỏ cây (200 g) còn được ngâm với 500 ml rượu 40◦ để xoa bóp chữa đau nhức, tê thấp Quả và hạt giã với muối được dùng làm gia vị hoặc cất lấy tinh dầu [2]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

- Mẫu của cây Giổi ăn hạt (Michelia tonkinensis), họ Ngọc lan (Magnoliaceae) được

thu hái tại xã Chí Đạo, huyện Lạc Sơn, tỉnh Hòa Bình

- Mẫu nghiên cứu đặc điểm thực vật: Thu hái mẫu có hoa, quả làm tiêu bản để giám định tên khoa học; mẫu lá, mẫu quả, hạt của cây để nghiên cứu đặc điểm vi học (Ngày thu mẫu: 15/3/2017 và 1/9/2017)

- Mẫu định lượng tinh dầu và phân tích thành phần hóa học tinh dầu: mẫu lá Giổi tươi (thu hái đầu tháng 4/2018) và mẫu hạt khô (thu hái cuối tháng 9/2017)

- Mẫu nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn: Mẫu lá tươi và mẫu hạt khô đem chiết xuất tinh dầu

2.1.2 Dung môi, hóa chất

- Hóa chất dùng trong tẩy nhuộm vi phẫu: javen, cloramin B, acid acetic, xanh

methylen, đỏ son phèn, glycerin và nước cất

- Dung môi, hóa chất dùng trong thử hoạt tính kháng khuẩn: Môi trường thạch

Mueller- Hinton (Mueller- Hinton Agar); Môi trường thạch Sabouraud (Sabouraud Dextrose Agar); Dung dịch pha loãng số 1: pH 8,0 ± 0,1 (KH2PO4, K2HPO4, nước cất); Dung dịch pha loãng số 2: pH 6,0 ± 0,1(Kali dihydrophosphat, Dikali

hydrophosphat, Nước cất); Vi sinh vật thử nghiệm (Staphylococcus aureus ATCC

6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Candida albicans ATCC 10231,

Escherichia coli ATCC 8739); chuẩn Gentamycin sulfat; chuẩn Nystatin;…

2.1.3 Trang thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm

- Kính hiển vi nối camera, máy tính (Eclipse Ci-L) 520-526NSADBTW

- Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262 SMA- FR, máy xác định độ ẩm Precisa HA60

- Bếp hồng ngoại, bếp đun cách thủy Memmert, tủ sấy Memmert

- Hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS

- Các dụng cụ khác như: bình cầu, bình nón, pipet, bình định mức, ống đong, cốc có

mỏ, đũa thủy tinh, phễu lọc, bình gạn, bình nón, đĩa petri…

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật; đặc điểm vi phẫu lá, vỏ quả và mẫu bột lá, bột hạt Từ đó giám định tên khoa học của loài

- Nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học của tinh dầu: định lượng tinh dầu và phân tích thành phần hóa học tinh dầu các mẫu: mẫu lá tươi (thu hái đầu tháng 4); mẫu hạt khô (thu hái cuối tháng 9)

- Đánh giá tính kháng khuẩn của tinh dầu mẫu lá tươi và mẫu hạt khô

2.3 Địa điểm nghiên cứu

- Nghiên cứu đặc điểm thực vật, đặc điểm vi phẫu; định lượng các mẫu tinh dầu tại

phòng thí nghiệm – bộ môn Dược học cổ truyền, trường Đại học Dược Hà Nội

- Phân tích thành phần hóa học các mẫu tinh dầu bằng GC-MS tại Phòng Phân tích hóa học, viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn tại phòng thí nghiệm khoa Vi sinh, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Giám định tên khoa học và nghiên cứu đặc điểm thực vật

- Thu hái, làm tiêu bản mẫu cành mang hoa, quả và lưu giữ tiêu bản

- Giám định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái thực vật,

so sánh với các khóa phân loại của chi Magnolia (hoặc chi Michelia) dưới sự

hướng dẫn của các chuyên gia phân loại thực vật [8], [7], [11], [50], [42], [32]

- Nghiên cứu đặc điểm vi học: cắt, làm tiêu bản vi phẫu và soi bột lá, hạt Quan sát các đặc điểm, mô tả và chụp ảnh tiêu bản dưới kính hiển vi [5]

2.4.2 Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu

2.4.2.1 Xác định hàm lượng tinh dầu trong mẫu hạt và mẫu lá cây Giổi ăn hạt

a) Xác định hàm ẩm của mẫu hạt và mẫu lá

 Xác định độ ẩm lá Giổi tươi bằng phương pháp sấy

Độ ẩm (X%) của dược liệu được tính theo công thức sau:

p: Số gam của mẫu thử trước khi sấy a: Số gam của mẫu thử sau khi sấy Trong trường hợp này, ta dùng cân xác định độ ẩm Precisa HA60

 Xác định độ ẩm hạt Giổi khô bằng phương pháp dùng dung môi [4]

* Dụng cụ (Hình 2.1)

Hình 2.1 Dụng cụ xác định hàm lượng nước bằng phương pháp cất với dung môi

Dụng cụ gồm bình cầu A, được nối với ống sinh hàn C qua bộ phận “xác định lượng nước” Bộ phận này bao gồm bầu ngưng tụ B, bộ phận chia vạch E và ống dẫn hơi D Bộ phận chia vạch được chia độ đến 0,1ml Sau quá trình cất, nước sẽ ngưng tụ ở đây

Vì vậy ta có thể đọc được dễ dàng lượng nước chứa trong dược liệu đem thử Nguồn nhiệt thích hợp là bếp điện có biến trở hoặc đun cách dầu

* Cách tiến hành

(a1): Cho vào bình cầu (đã được làm khô) 200ml toluen hoặc xylen, 2ml nước Lắp dụng cụ (đã được sấy khô) Cất khoảng 2 giờ, để nguội trong 30 phút rồi đọc thể tích nước cất được ở ống hứng (V1) chính xác đến 0,05ml

(a2): Thêm vào bình cầu một lượng mẫu thử đã cân chính xác tới 0,01g có chứa khoảng 2 - 3ml nước Thêm vài mảnh đá bọt (nếu cần) Đun nóng nhẹ, khi toluen đã bắt đầu sôi thì điều chỉnh nguồn cấp nhiệt để cất với tốc độ 2 giọt dịch cất trong 1 giây Khi đã cất được phần lớn nước sang ống hứng thì nâng tốc độ cất lên 4 giọt dịch cất trong 1 giây Tiếp tục cất cho đến khi mực nước cất được trong ống hứng không tăng lên nữa

Dùng 5 - 10ml toluen rửa ống sinh hàn rồi cất thêm 5 phút nữa Sau đó, tách bộ cất ra khỏi nguồn cấp nhiệt, để cho ống hứng nguội đến nhiệt độ phòng Nếu còn có những giọt nước đọng lại trên thành ống sinh hàn thì dùng 5ml toluen để rửa kéo xuống Khi lớp nước và lớp toluen đã được phân tách hoàn toàn, đọc thể tích nước trong ống hứng (V2)

Độ ẩm (X%) của dược liệu được tính theo công thức sau:

V1: số ml nước cất được sau lần cất đầu V2: số ml nước cất được sau lần cất thứ hai

p: số gam mẫu đã cân đem thử Lưu ý: Toluen là dung môi dễ cháy vì vậy nguồn nhiệt phải là bếp điện kín, tránh lửa trong phòng thí nghiệm

b) Định lượng tinh dầu trong mẫu hạt và mẫu lá

Tinh dầu trong các mẫu nghiên cứu được định lượng bằng phương pháp cất kéo hơi nước với bộ dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến (dựa trên cơ sở dụng cụ theo quy định của Dược điển Việt nam I, 1971), mỗi mẫu được tiến hành 3 lần, lấy giá trị trung bình [3]

Hàm lượng tinh dầu trong mỗi mẫu được tính theo công thức:

Trong đó: X: Hàm lượng tinh dầu trong mẫu (%) (tt/kl)

a: Thể tích tinh dầu đọc được sau khi định lượng (mL)

b: Khối lượng dược liệu sau khi đã trừ độ ẩm (g)

2.4.2.2 Phân tích thành phần tinh dầu thu được từ các mẫu

Phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS):

Mẫu tinh dầu được phân tích bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) Các cấu tử có trong tinh dầu hạt và lá Giổi được định danh trên GC Agilent 7890A, đầu dò phổ khối lượng (MS) 5975C VL Triple-Axis với cột mao quản không phân cực HP-5MS (60,00 m x 0,25 mm) với độ dày màng 0,25 µm Khí mang helium Nhiệt độ đầu nạp và đầu dò được thiết lập ở 250◦C Thể tích mẫu nạp vào là 1 µl với chế độ chia dòng (split) 100:1 Chương trình nhiệt được thiết lập với nhiệt độ đầu 60◦C, tăng 4◦C/phút đến 250◦C

Việc định danh các cấu tử trong tinh dầu được thực hiện bằng cách so sánh các giá trị chỉ số khóa thời gian lưu (retention time index, RI) và phổ khối lượng của chúng với các hợp chất tham khảo được công bố bởi Adams và hệ thống dữ liệu MS từng hợp chất từ thư viện phổ MS Wiley 8th kết hợp NIST 2008 Các giá trị chỉ số khóa thời

gian lưu của từng cấu tử trong tinh dầu được xác định qua dãy đồng đẳng alkan C30

C7-2.4.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn

2.4.3.1 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn [6]

a Môi trường và dung dịch pha loãng

* Môi trường thạch Mueller- Hinton (Mueller- Hinton Agar)

Mixture of Peptic Digest of Animal Tissue and

Điều chỉnh pH của dung dịch về 6,0 ± 0,1 bằng acid phosphoric 18 N hay kali hydroxyd 10 N

b Vi sinh vật thử nghiệm

- Staphylococcus aureus ATCC 6538

- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

- Candida albicans ATCC 10231

* Chuẩn bị hỗn dịch vi sinh vật:

Tăng sinh các chủng vi khuẩn trên môi trường Soyabean Casein Digest Agar vô khuẩn, và chủng nấm trên môi trường Sabouraud dextrose agar, ủ ở 32 đến 35oC trong

18 – 24 h Sau thời gian ủ, cho vào mỗi ống môi trường 5 ml nước muối sinh lý vô khuẩn, lắc kỹ để gặt sinh khối thu được hỗn dịch chủng gốc Pha loãng dung dịch chủng thu được bằng nước muối sinh lý và so sánh với độ đục chuẩn McFarland số 0,5 để được hỗn dịch vi sinh vật làm việc có nồng độ khoảng 1,5 x 108 CFU/ml

c Khảo sát tính kháng khuẩn của tinh dầu hạt Giổi

- Pha lần lượt các dung dịch thử nghiệm T5 (1:5), T6 (1:6), T7 (1:7), T8 (1:8), T9 (1:9),

T10 (1:10): Hút 50 µl dịch thử nghiệm, thêm theo thứ tự 250 µl, 300 µl, 350 µl, 400 µl,

450 µl, 500 µl dung dịch pha loãng số 1

LẦN 2:

Hút 0,2 ml dịch thử nghiệm, thêm 1,8 ml dung dịch pha loãng số 1 được dung dịch Ttg

Pha loãng tiếp từ dung dịch Ttg giống như lần 1 để được các dịch thử nghiệm T11 đến

T25 (theo tỉ lệ từ 1:18 đến 1:135)

d Chuẩn bị dung dịch chuẩn

 Dung dịch chuẩn Gentamycin sulfat

Chuẩn Dược điển Việt Nam: Gentamycin sulfat

Số kiểm soát: 20716011.03 Hoạt lực: 599,3 IU/mg (nguyên trạng)

Cân 0,0501 g chuẩn Gentamycin sulfat Thêm nước vừa đủ 50 ml để được dung dịch Sgốc (600,50 IU/ml)

- Đối với chủng S aureus ATCC 6538:

Hút 10 ml Sgốc, thêm dung dịch pha loãng số 1 vừa đủ 100 ml để được Stg (60,05 IU/ml)

Hút 10 ml Stg,thêm dung dịch pha loãng số 1 vừa đủ 24 ml được S1 (25,02 IU/ml) Hút 4 ml S1,thêm dung dịch pha loãng số 1 vừa đủ 5 ml để được S2 (20,02 IU/ml) Làm tương tự ta được: S3 (16,02 IU/ml); S4 (12,82 IU/ml); S5 (10,26 IU/ml); S6 (8,21 IU/ml); S7 (6,57 IU/ml); S8 (5,26 IU/ml); S9 (4,21 IU/ml); S10 (3,37 IU/ml); S11 (2,70 IU/ml); S12 (2,16 IU/ml)

- Đối với chủng P aeruginosa ATCC 9027:

Hút 10 ml Sgốc, thêm dung dịch pha loãng số 1 vừa đủ 24 ml được S1 (250,21 IU/ml)

Hút 4 ml S1, thêm dung dịch pha loãng số 1 vừa đủ 5 ml để được S2 (200,17 IU/ml) Làm tương tự ta được: S3 (160,14 IU/ml); S4 (128,11 IU/ml); S5 (102,49 IU/ml); S6 (81,99 IU/ml); S7 (65,59 IU/ml); S8 (52,47 IU/ml); S9 (41,98 IU/ml); S10 (33,58 IU/ml); S11 (26,86 IU/ml); S12 (21,49 IU/ml)

 Dung dịch chuẩn Nystatin

Chuẩn VKN Thành phố Hồ Chí Minh: Nystatin

Số kiểm soát: QT033080217 Hoạt lực: 5609 IU/mg (nguyên trạng)

Cân 0,0446 g chuẩn Nystatin Thêm N,N dimethylformamid (DMFM) vừa đủ 100

ml để được dung dịch Sgốc (2501,61 IU/ml)

Đối với chủng Candida albicans ATCC 10231:

Hút 5 ml Sgốc,thêm dung dịch pha loãng số 2 vừa đủ 25 ml được S1 (500,32 IU/ml) Hút 4 ml S1, thêm dung dịch pha loãng số 2 vừa đủ 5 ml để được S2 (400,26 IU/ml) Làm tương tự ta được: S3 (320,21 IU/ml); S4 (256,17 IU/ml); S5 (204,94 IU/ml); S6 (163,95 IU/ml); S7 (131,16 IU/ml); S8 (104,93 IU/ml); S9 (83,94 IU/ml); S10 (67,15 IU/ml); S11 (53,72 IU/ml); S12 (42,98 IU/ml)

e Bố trí thử nghiệm

Chuẩn bị các đĩa môi trường thử nghiệm Mỗi đĩa môi trường có đục 6 lỗ thạch (đường kính 8 mm)

Thể tích các dung dịch nhỏ vào mỗi lỗ thạch: 100 l

Nồng độ chủng cho vào môi trường: 1,0 % hỗn dịch chủng làm việc

Thể tích môi trường trong mỗi đĩa (đường kính 90 mm): 22 ml

+ Lớp nền (không có vi sinh vật): 12 ml

+ Lớp chủng (có vi sinh vật): 10 ml

Thời gian và nhiệt độ ủ: 37oC trong 16 - 18 h

2.4.3.2 Xác định MBC (Minimum Bactericidal Concentration) của tinh dầu bằng phương pháp hòa tan trong môi trường lỏng [6]

a Môi trường và dung dịch pha loãng

- Môi trường số 3 (pH sau tiệt khuẩn: 7,0 ± 0,05)

- Môi trường cho vi khuẩn hiếu khí và vi nấm: Soyabean Casein Digest Medium (CSB)

Nước vừa đủ 1000 ml

pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3 ± 0,2

b Vi sinh vật thử nghiệm:

- Tên vi sinh vật thử nghiệm:

+ Escherichia coli ATCC 8739

+ Staphylococcus aureus ATCC 6538

+ Candida albicans ATCC 10231

- Chuẩn bị hỗn dịch chủng theo DĐVN IV, phụ lục 13.9 “Xác định hoạt lực thuốc kháng sinh bằng phương pháp thử vi sinh vật”: Nuôi cấy chủng ở 37 °C ± 1°C trong môi trường số 3 trong 24 giờ, thu được ống hỗn dịch chủng gốc có nồng độ tương đương độ đục McFarland số 2 (có độ truyền qua khoảng 35,6% ở bước sóng 600 nm) Lấy 0,5 ml hỗn dịch chủng gốc cấy vào 100 ml môi trường số 3 thu được hỗn dịch chủng làm việc Chuẩn bị hỗn dịch chủng làm việc mỗi khi tiến hành thử nghiệm

c Chuẩn bị dung dịch thử nghiệm :

- Dung dịch 1/2: Lấy 1000 µl tinh dầu lá Giổi, thêm 1000 µl ethanol tuyệt đối, lắc đều được dung dịch có độ pha loãng 1/2

- Dung dịch 1/4: Lấy 1000 µl dung dịch 1/2, thêm 1000 µl ethanol tuyệt đối, lắc đều được dung dịch có độ pha loãng 1/4

- Tiếp tục pha tương tự như trên ta được dung dịch 1/8 và dung dịch 1/16

d Bố trí thử nghiệm:

- Chuẩn bị 15 ống thủy tinh vô khuẩn, kích thước 1,6 cm × 20 cm hoặc 1,8 cm × 20

cm, nắp kín

- Trong điều kiện vô khuẩn:

+ Hút chính xác 9 ml hỗn dịch chủng làm việc chuẩn bị ở mục 2 vào mỗi ống nghiệm, chú ý lắc đều trong khi hút

+ Hút chính xác 100 µl dung dịch thử nghiệm có độ pha loãng khác nhau vào một ống nghiệm chứa hỗn dịch chủng làm việc trên Tiến hành lần lượt với các dung dịch 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 Sau khi cho dung dịch thử nghiệm vào trong ống nghiệm chứa hỗn dịch chủng làm việc, tinh dầu trong ống nghiệm bị tủa lại, làm đục môi trường

+ Ủ các ống nghiệm trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 37 ± 0,5 °C trong 18 - 24 giờ

+ Song song tiến hành một ống chứng: chứa 9 ml hỗn dịch chủng làm việc

+ Sau thời gian nuôi cấy, không thể quan sát được sự phát triển của vi sinh vật trong các ống nghiệm do bản chất tinh dầu tủa lại trong ống nghiệm nên không xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

+ Tiếp tục tiến hành xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC): cấy 100 µl của mỗi ống nghiệm thu được ở trên vào môi trường CSB Ủ ở 30 – 35 °C trong 5 ngày