ĐẶT VẤN ĐỀ Hằng năm, nhu cầu về đường trên thế giới khoảng trên 100 triệu tấn. Mặc dù, có nhu cầu sử dụng lớn nhưng người bệnh tiểu đường và béo phì bị hạn chế dùng. Do đó, các nhà nghiên cứu đã không ngừng tìm kiếm các chất ngọt khác thay thế. Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều sản phẩm hóa học tạo vị ngọt như: aspartam, acesulfam potassium, saccharin, sucralose, cyclamat… Mặc dù rẻ và tiện lợi nhưng người ta vẫn e ngại ảnh hưởng về lâu dài của chúng đối với sức khỏe, tâm lý chung của người tiêu dùng là muốn tìm các chất ngọt từ thiên nhiên. Trong đó, cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bert.) được xem là chất ngọt có ưu điểm nhất: người ta đã chiết được glycosid từ cỏ ngọt, có độ ngọt cao hơn sacchrose 250300 lần. Mặt khác, nó còn có tác dụng điều hòa huyết áp, giảm cholesterol trong máu, không gây máu nhiễm mỡ,… và được đánh giá là an toàn cho con người 14, 15. Ở Việt Nam, cỏ ngọt đã được trồng ở nhiều nơi: Cao Bằng, Hà Giang, Hà Nội, Hòa Bình, Hưng Yên, Thái Bình, Nghệ An, Lâm Đồng…4 nhưng chưa có cơ sở nào chiết xuất được glycosid từ cỏ ngọt. Việc sử dụng cỏ ngọt mới chỉ dừng lại ở một số dạng trà thuốc, cao thuốc 11. Đã có một số công trình khoa học trong nước nghiên cứu chiết xuất steviosid từ cỏ ngọt, nhưng chưa có nghiên cứu nào chiết xuất được rebaudiosid A, là thành phần có giá trị sử dụng cao nhất vì ngọt nhất và ít dư vị đắng nhất trong số các glycosid của cỏ ngọt 15, 31. Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất steviosid và rebaudiosid A từ cỏ ngọt” nhằm mục tiêu: 1. Xây dựng đƣợc phƣơng pháp chiết xuất glycosid toàn phần từ lá cỏ ngọt. 2. Phân lập đƣợc steviosid và rebaudiosid A từ glycosid toàn phần.
BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRỊNH THỊ VÂN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT STEVIOSID VÀ REBAUDIOSID A TỪ CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana Bert.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRỊNH THỊ VÂN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT STEVIOSID VÀ REBAUDIOSID A TỪ CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana Bert.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Văn Hân Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp dược HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự kính trọng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS. Nguyễn Văn Hân người thầy đã tận tình giúp đỡ và hướng cho tôi những bước đi đầu tiên trong nghiên cứu khoa học. Thầy đã ân cần chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận, đóng góp cho tôi những kiến thức vô cùng quý báu trong công việc và cuộc sống. Tiếp theo tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị và các bạn ở tổ Chiết xuất – BM Công nghiệp dược đã luôn quan tâm, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô giáo trong trường, tới gia đình và bạn bè đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống. Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong có được những góp ý quý báu của các thầy cô và các bạn sinh viên. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Trịnh Thị Vân MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Vài nét về cây cỏ ngọt 2 1.1.1. Đặc điểm thực vật 2 1.1.2. Phân bố, sinh thái 2 1.1.3. Thành phần hóa học 2 1.1.4. Công dụng 3 1.2. Các loại đƣờng steviol glycosid 3 1.3. Một số nghiên cứu về chiết xuất steviol glycosid từ cỏ ngọt 8 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 1.1. Nguyên liệu, thiết bị 12 1.1.1. Nguyên liệu 12 1.1.2. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ 12 1.2. Nội dung nghiên cứu 13 1.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 14 1.3.1. Phương pháp chiết xuất 14 1.3.2. Phương pháp tinh chế 14 1.3.3. Phương pháp SKLM 14 1.3.4. Xác định nhiệt độ nóng chảy 14 1.3.5. Phương pháp phổ 14 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 15 3.1. Chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt 16 3.2. Tinh chế glycosid 17 3.2.1. Tinh chế bước 1 - Loại tạp chất bằng nước sữa vôi 17 3.2.2. Tinh chế bước 2 20 3.3. Phân lập steviosid và rebaudiosid A 29 3.3.1. Phân lập steviosid 29 3.3.2. Phân lập rebaudiosid A 34 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 4.1. Kết luận 39 4.2. Đề xuất 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1 H-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 13 C-NMR: Phổ cộng hưởng từ carbon IR: Phổ hồng ngoại MS: Phổ khối lượng NXB: Nhà xuất bản SKLM: Sắc ký lớp mỏng STT: Số thứ tự Tr: Trang DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1. Cấu trúc của các steviol glycosid chiết xuất từ cỏ ngọt 4 2 Bảng 3.1. Thể tích dịch chiết thu được sau 3 lần chiết 16 3 Bảng 3.2. Đặc điểm của 2 phương pháp trung hòa 20 4 Bảng 3.3. Đặc điểm của 2 phương pháp tinh chế glycosid: sử dụng nhựa trao đổi ion và sử dụng n-butanol bão hòa nước 25 5 Bảng3.4. Các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ hồng ngoại của steviosid 31 6 Bảng 3.5. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ carbon 13 C- NMR của steviosid 32-33 7 Bảng3.6. Các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ hồng ngoại của rebaudiosid A 35 8 Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ carbon 13 C- NMR của rebaudiosid A 36-37 DANH MỤC HÌNH VẼ STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1. Bộ khung của các steviol glycosid chiết xuất từ cỏ ngọt 4 2 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của steviosid 5 3 Hình 1.3. Công thức cấu tạo của rebaudiosid A 6 4 Hình 3.1. Hình ảnh sắc ký đồ của 3 mẫu dịch chiết cỏ ngọt 17 5 Hình 3.2. Hình ảnh SKLM dịch chiết cỏ ngọt sau loại tạp bằng nước sữa vôi 19 6 Hình 3.3. Cột nhựa trao đổi ion sau rửa giải 23 7 Hình 3.4. Hình ảnh SKLM dịch rửa giải qua 2 cột nhựa trao đổi ion 23 8 Hình 3.5. Hình ảnh SKLM của dịch n-butanol 25 9 Hình 3.6. Hình ảnh SKLM của 2 sản phẩm thu được từ 2 phương pháp tinh chế 26 10 Hình 3.7. Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất và tinh chế glycosid 28 11 Hình 3.8. Hình ảnh SKLM của steviosid thô (SP1)và nước cái (NC) 30 12 Hình 3.9. Hình ảnh SKLM của steviosid kết tinh lại lần 1 30 13 Hình 3.10. Cấu trúc của steviosid 33 14 Hình 3.11. Hình ảnh SKLM của rebaudiosid A thô 34 15 Hình 3.12. Hình ảnh SKLM của rebaudiosid A kết tinh lại lần 1 34 16 Hình 3.13. Cấu trúc hóa học của rebaudiosid A 37 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hằng năm, nhu cầu về đường trên thế giới khoảng trên 100 triệu tấn. Mặc dù, có nhu cầu sử dụng lớn nhưng người bệnh tiểu đường và béo phì bị hạn chế dùng. Do đó, các nhà nghiên cứu đã không ngừng tìm kiếm các chất ngọt khác thay thế. Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều sản phẩm hóa học tạo vị ngọt như: aspartam, acesulfam potassium, saccharin, sucralose, cyclamat… Mặc dù rẻ và tiện lợi nhưng người ta vẫn e ngại ảnh hưởng về lâu dài của chúng đối với sức khỏe, tâm lý chung của người tiêu dùng là muốn tìm các chất ngọt từ thiên nhiên. Trong đó, cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bert.) được xem là chất ngọt có ưu điểm nhất: người ta đã chiết được glycosid từ cỏ ngọt, có độ ngọt cao hơn sacchrose 250-300 lần. Mặt khác, nó còn có tác dụng điều hòa huyết áp, giảm cholesterol trong máu, không gây máu nhiễm mỡ,… và được đánh giá là an toàn cho con người [14], [15]. Ở Việt Nam, cỏ ngọt đã được trồng ở nhiều nơi: Cao Bằng, Hà Giang, Hà Nội, Hòa Bình, Hưng Yên, Thái Bình, Nghệ An, Lâm Đồng…[4] nhưng chưa có cơ sở nào chiết xuất được glycosid từ cỏ ngọt. Việc sử dụng cỏ ngọt mới chỉ dừng lại ở một số dạng trà thuốc, cao thuốc [11]. Đã có một số công trình khoa học trong nước nghiên cứu chiết xuất steviosid từ cỏ ngọt, nhưng chưa có nghiên cứu nào chiết xuất được rebaudiosid A, là thành phần có giá trị sử dụng cao nhất vì ngọt nhất và ít dư vị đắng nhất trong số các glycosid của cỏ ngọt [15], [31]. Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất steviosid và rebaudiosid A từ cỏ ngọt” nhằm mục tiêu: 1. Xây dựng đƣợc phƣơng pháp chiết xuất glycosid toàn phần từ lá cỏ ngọt. 2. Phân lập đƣợc steviosid và rebaudiosid A từ glycosid toàn phần. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1 Vài nét về cây cỏ ngọt Tên khoa học: Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley. Tên khác: Cỏ ngọt, cúc ngọt, cỏ mật. Họ: Cúc (Asteraceae) [1], [4], [11]. 1.1.1 Đặc điểm thực vật Cỏ ngọt là một loại cây thảo nhỏ, sống nhiều năm, cao 0,5-0,6 m, có khi đến 1 m. Thân cứng mọc thẳng, có rãnh dọc và nhiều lông mịn, ít phân nhánh. Lá mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, dài 5-7 cm, rộng 1- 1,5 cm, có 3 gân, 4-6 đôi răng nhọn ở phần nửa về phía đầu lá, hai mặt có lông trắng mịn, nhấm lá thấy có vị ngọt rất đậm; cuống lá rất ngắn. Hoa lưỡng tính, tụ họp thành đầu màu trắng ở ngọn thân. Quả bế, không có mào lông, hạt không có nội nhũ [11]. 1.1.2 Phân bố, sinh thái Cỏ ngọt có nguồn gốc từ Brazin và Paraguay. Ngày nay, nó được sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia châu Á như: Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Philippin, Indonesia, Đài Loan, Thái Lan, Malaysia [11], [16], [17]. Từ 1988, đã di thực vào Việt Nam và được trồng phổ biến tại nhiều vùng khác nhau hiện nay như: Cao Bằng, Lâm Đồng, Hà Giang, Hà Tây, Thái Bình, Bắc Giang, Thái Nguyên,… Cây cỏ ngọt tỏ ra thích nghi với điều kiện khí hậu ở Việt Nam [4], [11]. Cỏ ngọt là cây ưa ẩm và ưa sáng, có thể chịu bóng hoặc ưa bóng vào thời kì cây con. Vốn là cây ở vùng nhiệt đới, cỏ ngọt trồng ở Việt Nam sinh trưởng, phát triển tốt vào vụ xuân – hè. Về mùa đông, cây có hiện tượng rụng lá và hơi bị tàn lụi. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm [11]. 1.1.3 Thành phần hóa học Lá cỏ ngọt chứa: - Các ent – kauren diterpen glycosid hay còn được gọi là các steviol glycosid, gồm: steviosid, rebaudiosid A, B, C, D, E, F, dulcosid, steviobiosid. Chúng là [...]... -Glc -Glc- -Glc (2 1) 4 Rebaudiosid A -Glc -Glc- -Glc (2 1) -Glc- -Glc (2 1) -Glc (3 1) 5 Rebaudiosid B H -Glc- -Glc (2 1) -Glc (3 1) 6 Rebaudiosid C -Glc (Dulcosid B) 7 Rebaudiosid D -Glc- -Rha (2 1) -Glc (3 1) -Glc- -Glc (2 1) -Glc- -Glc (2 1) -Glc (3 1) 8 Rebaudiosid E -Glc- -Glc (2 1) -Glc- -Glc (2 1) 9 Rebaudiosid F -Glc -Glc- -Xyl (2 1) -Glc (3 1) 10 Dulcosid A -Glc -Glc- -Rha (2 1) 5 Các thành... các mức độ khác nhau Bốn steviol glycosid có hàm lượng cao nhất, được đề cập đến nhiều nhất trong các tài liệu tham khảo là: steviosid (5 -10 %), rebaudiosid A (2 -4 %), rebaudiosid C (1 -2 %), dulcosid A (0 ,5-1 %) [15] Chúng ngọt hơn nhiều so với saccharose, trong đó: steviosid ngọt hơn 110 đến 270 lần, rebaudiosid A ngọt hơn 150 đến 320 lần, rebaudiosid C ngọt hơn 40 đến 60 lần, dulcosid A ngọt hơn 30 lần... cho qua Celite và nền nh a Amberlite Sau đó dịch r a giải được phun khô, bột 10 ch a khoảng 65% steviosid và 25% rebaudiosid A Bột được tái kết tinh trong methanol thu được 90% steviosid Dịch lọc còn lại được kết tinh tiếp trong ethanol thu được bột ch a khoảng 90% rebaudiosid A [32] Liu et al (2 01 2) đề xuất phương pháp tách bằng sắc ký gi a hai glycosid steviosid và rebaudiosid A Từ hỗn hợp 41% steviosid. .. siro, thêm ethanol vào, kết t a tách ra ch a 84% rebaudiosid A Dịch lọc còn lại được cho qua nền nh a trao đổi ion, bay hơi cồn thu được bột ch a steviosid khoảng 93% [12] Một phương pháp để đạt được steviosid và rebaudiosid A có độ tinh khiết cao đã được đề xuất như sau: dịch chiết nước cỏ ngọt sau khi được loại tạp bằng canxi hydroxyd sẽ được trung h a bằng dung dịch sắt (III) clorua Dịch lọc được... cationit (Purolite, C100E) Nh a anionit (Trilite) England Korea 13 1.1.2.2 Thiết bị, dụng cụ Thiết bị Bình chiết nóng Tủ sấy MEMMERT ( ức) Cân kỹ thuật điện tử Sartorius BP 20015 ( ức) Máy đo pH Máy cất quay chân không Buchi B-490 và R-220 (Thụy S ) Bếp ôm bình cầu có báo ôn Heating Mantle (Trung Quốc) Bản mỏng silicagel GF254 (MERCK) Máy đo nhiệt độ nóng chảy Mettler Toledo FP62 (Mettler)... quả đó, ta thấy rằng sử dụng ethanol để loại tạp khá hiệu quả và cần thiết Sau bước tinh chế bằng nh a trao đổi ion: Hình 3.3 Cột nh a trao đổi ion sau Hình 3.4 Hình ảnh SKLM dịch r a r a giải giải qua 2 cột nh a trao đổi ion (Chú thích hình 3.4: A: tương ứng là dịch trước khi r a giải B, C: lần lượt tương ứng là dịch r a giải qua 2 cột nh a cationit, anionit) Nhận xét: Qua hình 3.3 ta thấy sau khi... cho qua cột nh a hấp phụ Amberlite XAD-7 và được r a giải bằng methanol Dịch methanol ch a trên 95% steviol glycosid c a dung dịch thu được sau khi qua cột nh a trao đổi ion Cắn khô thu được sau đó được hồi lưu rồi kết tinh trong methanol, thu được steviosid Dịch lọc để kết tinh tiếp thu được rebaudiosid A Kết tinh lại nhiều lần trong methanol thu được rebaudiosid A tinh khiết đến 95% Nghiên cứu đã... (DPPH), gốc hydroxyl, oxid nitric, tham gia nhặt rác anion superoxid và hydrogen peroxid Một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng chiết xuất từ Stevia có tác dụng ức chế các tác nhân gây bệnh liên quan đến thực phẩm như: S marcescens, K pneumoniae, B cereus, P aeruginosa, B subtilis, Alcaligenes denitrificans và Salmonella typhimurium Hoạt động kháng khuẩn c a chiết xuất từ Stevia là thấp hơn so với ciproflaxcin... để lắng qua đêm sau đó gạn lọc Cất thu hồi ethanol, sau đó cho cao lỏng dược liệu (trong nước cất 2 lần) lần lượt qua cột đã được nhồi hạt nh a trao đổi ion (cationit, anionit) R a giải cột hấp phụ bằng nước 22 cất 2 lần đến khi dịch r a giải không còn hoạt chất (kiểm tra các phân đoạn dịch r a giải bằng SKLM) Gộp dịch r a giải và cất loại dung môi thu được cắn Cắn này đem kết tinh trong methanol Tiến... 35,8% rebaudiosid A sau khi h a tan trong ethanol được nạp trên cột sắc ký có thành phần chủ yếu là polymethacrylat/DVB nh a polymer đồng chức năng dưới áp lực cao Cột được tách r a dưới áp lực trung bình với hỗn hợp methanol-aceton Phần phân đoạn c a steviosid và rebaudiosid A được thu riêng và để kết tinh Các tinh thể được lọc ra ch a riêng từng thành phần với độ tinh khiết là 98 % [32] Ngoài ra, một . -Glc--Glc (2 1) -Glc (3 1) 5 Rebaudiosid B H -Glc--Glc (2 1) -Glc (3 1) 6 Rebaudiosid C (Dulcosid B) -Glc -Glc--Rha (2 1) -Glc (3 1) 7 Rebaudiosid D -Glc--Glc (2 1) -Glc--Glc. -Glc--Glc (2 1) -Glc (3 1) 8 Rebaudiosid E -Glc--Glc (2 1) -Glc--Glc (2 1) 9 Rebaudiosid F -Glc -Glc--Xyl (2 1) -Glc (3 1) 10 Dulcosid A -Glc -Glc--Rha (2 1) 5 . khác nhau. Bốn steviol glycosid có hàm lượng cao nhất, được đề cập đến nhiều nhất trong các tài liệu tham khảo là: steviosid (5 -10 %), rebaudiosid A (2 -4 %), rebaudiosid C (1 -2 %), dulcosid A (0 ,5-1%)