Nghiên cứu chiết tách và phân lập hợp chất hóa học gây độc tế bào ung thư từ dịch chiết cây đu đủ đực (Carica Papaya L.)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM BÁO CÁO TĨM TẮT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP HỢP CHẤT HÓA HỌC GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ TỪ DỊCH CHIẾT CÂY ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.) Mã số: B2018-ĐN03-30 Chủ nhiệm đề tài: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Đà Nẵng, 9/2019 i DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH TT TT DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI Đơn vị công tác lĩnh vực Họ tên chuyên môn Trường Đại học Sư phạm-Đại ThS Đỗ Thị Thúy Vân học Đà Nẵng, Hóa hữu Trường Đại học Sư phạm-Đại GS.TS Đào Hùng Cường học Đà Nẵng, Hóa hữu PGS.TS Giang Thị Kim Liên Đại học Đà Nẵng, Hóa hữu Trường Đại học Sư phạm-Đại ThS Trần Thị Diệu My học Đà Nẵng, Hóa hữu ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Họ tên người đại diện Tên đơn vị phối hợp Viện Hóa Sinh biển-Viện Hàn TS Nguyễn Hải Đăng lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Công nghệ Sinh họcPGS.TS Đỗ Thị Thảo Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ii MỤC LỤC DANH SÁCH THÀNH VIÊN VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục đích nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu đu đủ 1.2 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học đu đủ 1.2.1 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học đu đủ nước 1.2.2 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học đu đủ giới 1.3 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học đu đủ CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập, tinh chế hợp chất hóa học 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư 2.3 Nghiên cứu thực nghiệm 2.3.1 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro iii cao chiết 2.3.2 Chuẩn bị cao chiết để tiến hành phân lập hợp chất hóa học 2.3.3 Q trình phân lập hợp chất hóa học 2.3.4 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro hợp chất hóa học CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro cao chiết 3.2 Tính chất vật lý kiện phổ hợp chất hóa học phân lập 3.3 Xác định cấu trúc hóa học chất 10 3.4 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro hợp chất hóa học 14 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 14 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng 3.1 3.2 3.3 Tên bảng Trang Hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao chiết từ hoa đu đủ đực Số liệu phổ NMR hợp chất CP12A Hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất hóa học từ hoa đu đủ đực 11 14 v DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu hình 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 Tên hình Trang Sơ đồ tạo cao chiết từ hoa đu đủ đực Sơ đồ tạo cao chiết từ đu đủ đực Sơ đồ phân lập hợp chất hóa học từ cao chloroform hoa đu đủ đực Sơ đồ phân lập hợp chất hóa học từ cao dichloromethane hoa đu đủ đực Sơ đồ phân lập hợp chất hóa học từ cao chloroform đu đủ đực Cấu trúc hóa học (a) tương tác HMBC (b) hợp chất CP12A Phổ HRESIMS hợp chất CP12A Phổ 1H-NMR hợp chất CP12A Phổ 13C-NMR hợp chất CP12A Phổ DEPT hợp chất CP12A Phổ HSQC hợp chất CP12A Phổ HMBC hợp chất CP12A 5 6 10 12 12 12 13 13 13 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng anh Các phương pháp sắc ký CC Column Chromatography TLC Thin Layer Chromatography Các phương pháp phổ Proton Nuclear Magnetic H-NMR Resonance Spectroscopy Carbon-13 Nuclear Magnetic 13 C-NMR Resonance Spectroscopy COSY DEPT ESIMS HMBC HRESIMS HSQC NOESY ROESY δ (ppm) Correlation Spectroscopy Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Electrospray Ionization Mass Spectrometry Diễn giải Sắc ký cột Sắc ký mỏng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 Phổ tương tác hai chiều 1H-1H Phổ DEPT Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt Heteronuclear Mutiple Bond nhân qua nhiều liên Connectivity kết Phổ khối lượng phân High Resolution Electronspray giải cao phun mù điện Ionization Mass Spectrum tử Heteronuclear Single-Quantum Phổ tương tác dị hạt Coherence nhân qua liên kết Nuclear Overhauser Phổ NOESY Enhancement Spectroscopy Rotating frame nuclear Overhauser Enhancement Phổ ROESY Spectroscopy Độ dịch chuyển hóa δ (ppm = part per million) học tính phần triệu vii Kí hiệu Tiếng anh s Singlet d Doublet t Triplet q Quartet m Multiplet dd double doublet dt double triplet br Broad br s broad singlet br d broad doublet ddd double doublet double Các dòng tế bào A549 LU-1 Human lung carcinoma PC14 Bcap-37 MCF-7 MDA-MB- Human breast adenocarcinoma 21 TD47 Hep3B Hep-G2 Human hepatoma Hepa1c1c7 Human prostate LNCaP adenocarcinoma Human cervical HeLa adenocarcinoma Human promyelocytic HL-60 leukemia H2452 Human epidermoid carcinoma KB Diễn giải Ung thư phổi người Ung thư vú người Ung thư gan người Ung thư tuyến tiền liệt Ung thư cổ tử cung Ung thư máu cấp tính Ung thư biểu mơ viii Kí hiệu Tiếng anh SCC25 P-388 Lymphocytic leukemia UACC62 Melanoma Các ký hiệu viết tắt khác CTPT CS % IC50 mp OD TB BuOH CHCl3 CH2Cl2 DMSO EtOAc MeOH OMe Me SRB Melting point Optical Density Diễn giải Ung thư máu lympho Khối u ác tính Cơng thức phân tử Phần trăm tế bào sống sót Nồng độ ức chế 50% Điểm chảy Mật độ quang Tế bào n-butanol Chloroform Dichloromethane Dimethylsulfoxide Ethyl acetate Methanol Methoxy Methyl Sulforhodamine B Phương pháp Monks thử độ độc tế bào in vitro 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)MTT 2,5-diphenyltetrazolium Phương pháp MTT bromid Ghi chú: Tên hợp chất, lớp chất, nhóm thế, chức hóa học viết theo nguyên Tiếng Anh để đảm bảo tính thống xác MỞ ĐẦU Đ t vấn đề Cây đu đủ (Carica papaya L.) loại ăn có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ Ở Việt Nam, đu đủ trồng phổ biến tỉnh đồng bằng, dọc theo sông, loại đất phù sa Cây đu đủ có lợi loại dễ trồng, sớm, suất cao đồng thời phận đu đủ sử dụng với nhiều mục đích chữa bệnh khác Chính cơng dụng chữa bệnh đu đủ, có nhiều đề tài nghiên cứu tập trung xác định thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài này, chủ yếu phận đu đủ Thế nghiên cứu phận đu đủ đực Vì vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa học chứng minh thành phần hoạt chất cụ thể đu đủ đực có hoạt tính sinh học việc làm cần thiết, tạo sở khoa học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có Việt Nam làm thuốc điều trị bệnh hiểm nghèo, có bệnh ung thư Do đó, đề tài: “Nghiên cứu chiết tách phân lập hợp chất hóa học gây độc tế bào ung thư từ dịch chiết đu đủ đực (Carica papaya L.)” lựa chọn Mục đích nghiên cứu Phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất có khả ức chế tế bào ung thư từ hoa đu đủ đực Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu Hoa đu đủ đực; Các dịch chiết từ đu đủ đực với dung mơi khác nhau; Các hợp chất hóa học phân lập từ dịch chiết; 3.2 Phạm vi nghiên cứu Chiết xuất dịch chiết hoa đu đủ đực dung môi khác nhau; Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào số dịch chiết hợp chất hoá học phân lập từ hoa đu đủ đực Phương pháp nghiên cứu 4.1 Phư ng pháp l thuyết 4.2 Phư ng pháp thực nghi m nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Nội dung nghiên cứu 6.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu hướng tiếp cận đề tài 6.2 Phân lập xác định cấu trúc hợp chất hóa học từ đu đủ đực Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc hợp chất hóa học từ đu đủ đực 6.3 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư dịch chiết hợp chất hóa học phân lập từ đu đủ đực Nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư số dịch chiết hợp chất hóa học phân lập từ đu đủ đực CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu đu đủ Cây đu đủ thuộc họ đu đủ (Caricaceae), có nguồn gốc Châu Mỹ, trồng khắp nơi nước ta Họ đu đủ (Caricaceae) giới gồm có chi 45 loài, phân bố vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Ở nước ta có chi lồi 1.2 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học đu đủ 1.2.1 Tình hình nghiên cứu thành ph n hóa học đu đủ nước Năm 1983, Nguyễn Tường Vân cộng chiết xuất xác định alkaloid carpaine đu đủ Năm 2012, Trần Thanh Hà Trịnh Thị Điệp phân lập chất từ phân đoạn chiết n-hexane đu đủ Bao gồm, β-sitosterol, daucosterol, cycloart-23-ene-3β,25-diol (sterculin A) cycloart-25ene-3β,24(R/S)-diol Trong đó, sterculin A cycloart-25-ene3β,24(R/S)-diol triterpene lần phân lập từ đu đủ Năm 2014, Hồ Thị Hà tiến hành chiết phân đoạn dịch chiết MeOH từ đu đủ dung mơi có độ phân cực tăng dần (nhexane, CH2Cl2, EtOAc, n-butanol) Từ cao chiết CH2Cl2 phân lập hợp chất: danielone, carpainone, acid pluchoic, apocynol A, carpaine, pseudocarpaine Trong carpainone hợp chất chất danielone, apocynol A lần phân lập từ đu đủ Năm 2015, Giang Thị Kim Liên Đỗ Thị Lệ Uyên khảo sát thành phần hóa học hoa đu đủ đực Kết cho thấy có mặt alkaloid, ester, acid b o, số sterol hoa đu đủ đực thu hái Đà Nẵng Năm 2017, Đỗ Thị Hoa Viên Trần Văn Lộc phân lập định lượng carpaine từ đu đủ thu hái Đông Anh, Hà Nội Kết cho thấy carpaine chiếm 63% tổng hàm lượng alkaloid chiết từ đu đủ 1.2.2 Tình hình nghiên cứu thành ph n hóa học đu đủ giới Các kết nghiên cứu công bố hợp chất alkaloid, phenol có đu đủ Một số nghiên cứu cho thấy hoa đu đủ đực có số triterpenoids/steroid, flavonoid, tannin, glycosides, saponin 1.3 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học đu đủ Các cơng bố hoạt tính đu đủ gồm: Tác dụng trị giun sán, hạ huyết áp; kháng sinh, kháng nấm; trị u bướu, ung thư; chống oxy hóa Nhận xét chung: Việc nghiên cứu phân lập hợp chất hóa học từ đu đủ đực, xác định cấu trúc thử nghiệm hoạt tính hợp chất hóa học mục tiêu nghiên cứu đề tài, tạo sở khoa học ban đầu việc sử dụng nguồn dược liệu bổ ích CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 2.1.1 Nguyên li u Hoa đu đủ đực sau thu hái loại bỏ phần hư hỏng, rửa sạch, thái nhỏ, phơi bóng râm sấy 50-60oC khơ Sau đó, mẫu xay thành bột Bột hoa đu đủ đực chia thành nhiều phần, bảo quản tủ lạnh để sử dụng cho nhiều nội dung thực nghiệm 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phư ng pháp phân lập, tinh chế hợp chất hóa học 2.2.2 Phư ng pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 2.2.3 Phư ng pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư 2.3 Nghiên cứu thực nghiệm 2.3.1 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro cao chiết Điều chế cao chiết từ hoa đu đủ đực: Lấy 100 gam bột hoa đu đủ đực, chiết với dung môi methanol thu dịch chiết Tiến hành cô quay chân không dịch chiết methanol thu cao methanol Tiến hành phân bố cao methanol vào nước chiết phân đoạn với dung môi n-hexane, chloroform, ethyl acetate thu ba dịch chiết tương ứng Tiến hành cất loại dung môi áp suất thấp ba dịch chiết thu ba cao chiết nhexane, chloroform ethyl acetate Tiến hành tương tự với 100 gam bột đu đủ đực thu ba cao chiết n-hexane, chloroform ethyl acetate Hoạt tính gây độc tế bào in vitro cao chiết n-hexane, chloroform, ethyl acetate từ hoa đu đủ đực tiến hành thử nghiệm ba dòng tế bào ung thư phổi (A549), ung thư gan (Hep3B), ung thư vú (MCF-7) theo phương pháp MTT, thực Phòng thử hoạt tính sinh học – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.3.2 Chuẩn bị cao chiết để tiến hành phân lập hợp chất hóa học Sơ đồ tạo cao chiết từ bột hoa đu đủ đực khô trình bày Hình 2.1 Sơ đồ tạo cao chiết từ bột đu đủ đực khô trình bày Hình 2.2 Hình 2.1 Sơ đồ tạo cao chiết từ hoa đu đủ đực Hình 2.2 Sơ đồ tạo cao chiết từ đu đủ đực 2.3.3 Quá trình phân lập hợp chất hóa học a Phân lập hợp chất hóa học từ mẫu hoa đu đủ đực  Phân lập hợp chất hóa học từ cao chloroform (CPC) Sơ đồ phân lập hợp chất hóa học từ cao chloroform hoa đu đủ đực trình bày Hình 2.3 Hình 2.3 Sơ đồ phân lập hợp chất hóa học từ cao chloroform hoa đu đủ đực  Phân lập hợp chất hóa học từ cao dichloromethane (CPD) Sơ đồ phân lập hợp chất hóa học từ cao dichloromethane hoa đu đủ đực trình bày Hình 2.4 Hình 2.4 Sơ đồ phân lập hợp chất hóa học từ cao dichloromethane hoa đu đủ đực b Phân lập hợp chất hóa học từ mẫu đu đủ đực Sơ đồ phân lập hợp chất hóa học từ cao chloroform đu đủ đực (CPLC) trình bày Hình 2.5 Hình 2.5 Sơ đồ phân lập hợp chất hóa học từ cao chloroform đu đủ đực 2.3.4 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro hợp chất hóa học Hoạt tính gây độc tế bào in vitro hợp chất hóa học phân lập từ hoa đu đủ đực tiến hành thử nghiệm ba dòng tế bào ung thư phổi (A549), ung thư vú (MCF-7), ung thư gan (Hep3B) theo phương pháp SRB, thực Phòng thử hoạt tính sinh học – Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Hợp chất C2, CP12A CPL-C3 không đưa vào thử nghiệm lượng mẫu không đủ, hợp chất C1, C3 CPL-C4 có cấu trúc quen thuộc nghiên cứu nhiều nên không đưa vào thử nghiệm CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro cao chiết Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư phổi (A549), tế bào ung thư gan (Hep3B), tế bào ung thư vú (MCF-7) cao chiết từ hoa đu đủ đực trình bày Bảng 3.1 Bảng 3.1 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao chiết từ hoa đu đủ đực Kết thu Bảng 3.1 cho thấy cao chiết từ hoa đu đủ đực có khả ức chế phát triển ba dòng tế bào ung thư người mức độ khác Trong đó, cao chiết chloroform hoa đu đủ đực thể hoạt tính gây độc tế bào tốt ba dòng tế bào với phần trăm tế bào sống sót khoảng 15,49±1,65 đến 55,28±2,80% nồng độ 100 µg/mL 44,64±2,21 đến 70,42±1,49% nồng độ 30 µg/mL Đây sở để định hướng lựa chọn cho nghiên cứu thành phần hóa học 3.2 Tính chất vật lý kiện phổ hợp chất hóa học phân lập 3.2.1 Hợp chất (C1): Rutin Tinh thể hình kim, màu vàng; Nhiệt độ nóng chảy: 190-193oC; Cơng thức phân tử C27H30O16, M = 610; ESIMS: m/z 633,1 [M+Na]+; H-NMR (500 MHz, CD3OD) 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 3.2.2 Hợp chất (C2): Acid gallic Tinh thể hình kim, màu trắng; Nhiệt độ nóng chảy: 236-238oC; Cơng thức phân tử C7H6O5, M = 170; 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD) 3.2.3 Hợp chất (C3): Daucosterol Chất bột, màu trắng; Nhiệt độ nóng chảy: 283-286oC; Cơng thức phân tử C35H60O6, M = 576; ESIMS: m/z 397,3 [MC6H12O6+H]+; 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) 3.2.4 Hợp chất (CP1): 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2carbaldehyde (Chất l n đ u tiên công bố phân lập từ nguồn tự nhiên) Chất nhựa, không màu; Công thức phân tử C13H13NO2, M = 215; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) 3.2.5 Hợp chất (CP3): Vitexoid Chất nhựa, không màu; Công thức phân tử C10H16O3, M = 184; H-NMR (500 MHz, CDCl3) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) 3.2.6 Hợp chất (CP4): Lariciresinol Chất bột, màu trắng; Nhiệt độ nóng chảy: 165-168oC; Cơng thức phân tử C20H24O6, M = 360; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) 13CNMR (125 MHz, CDCl3) 3.2.7 Hợp chất (CP5): Dehydrodiconiferyl alcohol Chất bột, không màu; Nhiệt độ nóng chảy: 141-142oC; Cơng thức phân tử C20H22O6, M = 358; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) 13CNMR (125 MHz, CDCl3) 3.2.8 Hợp chất (CP6): Benzyl-O- -D-glucopyranoside Chất bột, màu trắng; Nhiệt độ nóng chảy: 121-122oC; Cơng thức phân tử C13H18O6, M = 270; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) 13CNMR (125 MHz, CDCl3) 3.2.9 Hợp chất (CP9): 6-hydroxy-2,6-dimethyl-2,7-octadienoic acid Chất dầu, không màu; Công thức phân tử C10H16O3, M = 184; H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) 3.2.10 Hợp chất 10 (CP10): 6-hydroxy-2,6-dimethyloct-7-enoic acid Chất dầu, không màu; Công thức phân tử C10H18O3, M = 186; H-NMR (500 MHz, CDCl3) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) 3.2.11 Hợp chất 11 (CP14): 2,6-dimethylocta-2,7-diene-1,6-diol Chất dầu, không màu; Công thức phân tử C10H18O2, M = 170; H-NMR (500 MHz, CD3OD) 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 3.2.12 Hợp chất 12 (CP12A): Caricapapayol (Chất mới) Chất bột, màu vàng; Công thức phân tử C29H34O4, M = 446; HRESIMS: m/z 447,2526 [M+H]+; Tính tốn lý thuyết cho công thức C29H35O4: 447,2535; 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 3.2.13 Hợp chất 13 (CPL-C1): Tetratriacontanyl palmitate Chất bột, màu trắng; Nhiệt độ nóng chảy: 67-71oC; Công thức phân tử C50H100O2, M = 732; ESIMS: m/z 713,47 [M-H-H2O]-, 767,53 [M-H+2H2O]1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 0,88 (3H, t, J = 6,5 Hz, H-16); 0,88 (3H, t, J = 6,5 Hz, H-34′); 1,26 (m); 1,61 (2H, m, H-3); 2,28 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-2); 4,05 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1′); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 174,0 (C-1); 64,4 (C-1′); 14,1 (C-16); 14,1 (C-34′); 34,4-22,7 3.2.14 Hợp chất 14 (CPL-C2): 1-hentriacontanol Chất bột, màu trắng; Nhiệt độ nóng chảy: 85-89oC; Cơng thức phân tử C31H64O, M = 452; ESIMS: m/z 453,34 [M+H]+ H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-31); 1,26 (m); 1,56 (2H, m, H-30); 3,64 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1); 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 63,1 (C-1); 14,1 (C-31); 32,822,7 3.2.15 Hợp chất 15 (CPL-C3): Vanillin Chất bột, màu trắng; Nhiệt độ nóng chảy: 82-84oC; Cơng thức phân tử C8H8O3, M = 152; ESIMS: m/z 175,0 [M+Na]+; 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 3.2.16 Hợp chất 16 (CPL-C4): Stigmasterol Tinh thể hình kim, màu trắng; Nhiệt độ nóng chảy: 169-172oC; Cơng thức phân tử C29H48O, M = 412; ESIMS: m/z 395,3 [M1 10 H2O+H]+; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) 3.3 Xác định cấu trúc hóa học chất Hợp chất CP12A phân lập dạng chất bột vơ định hình màu vàng Trên phổ HRESIMS (Hình 3.2) CP12A cho thấy xuất pic ion giả phân tử m/z 447,2526 [M+H]+ (tính tốn lý thuyết cho C29H35O4 447,2535), kết hợp với kiện phổ 13 C-NMR đề nghị CTPT hợp chất C29H34O4 Phổ 1H-NMR (Hình 3.3) CP12A tín hiệu đặc trưng nhóm phenyl đối xứng 1,3,4,5 H 6,49 (2H, s, H-4′, H-8′), nhóm phenyl không đối xứng 1,3,4,5 δH 6,88; 6,69 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-3, H-5), nhóm cis-vinylene δH 6,35; 5,69 (2H, d, J = 10,0 Hz, H-7, H-8), nhóm trans-vinylene δH 6,84; 6,76 (2H, d, J = 16.0 Hz, H-1′, H-2′), proton olefin δH 5,27; 5,09 (2H, t, J = 7,0 Hz, H2″, H-7″) nhóm methyl δH 1,78; 1,64; 1,58; 1,44; 1,44 (15H, s, H4″, H-9″, H-10″, H-10, H-11) Phổ 13C-NMR (Hình 3.4) DEPT (Hình 3.5) CP12A tín hiệu 29 carbon bao gồm carbon liên kết với oxy sp2 (δC 157,2; 157,2; 146,4; 141,2), carbon bậc bốn sp2, carbon liên kết với oxy sp3 (δC 77,8), 10 carbon methine sp2, carbon methylene sp3 carbon methyl a b Hình 3.1 Cấu trúc hóa học (a) tương tác HMBC (b) hợp chất CP12A Các tương tác HMBC (Hình 3.7) H-1′ (δH 6,84) C-3 (δC 114,3)/C-5 (δC 117,1)/C-3′ (δC 137,4); H-2′ (δH 6,76) C-4′ (δC 105,8)/C8′ (δC 105,8)/C-4 (δC 132,0) nhóm phenyl 1,3,4,5 liên kết với thơng qua nhóm trans-vinylene Sự diện nhóm geranyl thể tương tác HMBC H3-9″ (δH 1,64)/H3-10″ (δH 1,58) C-7″ (δC 125,5)/C-8″ (δC 131,9); H2-6″ (δH 2,07) C-7″/C8″/C-5″ (δC 40,9)/C-3″ (δC 134,9); H3-4″ (δH 1,78) C-5″/C-3″/C-2″ (δC 124,5); H2-1″ (δH 3,33) C-3″/C-2″ Ngoài ra, tương quan 11 HMBC H2-1″ C-5′ (δC 157,2)/C-7′ (δC 157,2)/C-6′ (δC 116,1) với tín hiệu carbon C-5′, C-7′ δC 157,2 xác nhận có mặt nhóm hydroxy C-5′, C-7′ nhóm geranyl C-6′ để tạo thành nhóm phenyl đối xứng 1,3,4,5 Thêm vào đó, tương tác HMBC H-3 (δH 6,88) C-1 (δC 141,2)/C-2 (δC 146,4) đề xuất việc gán carbon liên kết với oxy sp2 C-1 C2 Sự xuất chuỗi 3-methylbut-1-enyl liên kết chuỗi vị trí C-6 xác nhận thơng qua tương tác HMBC H3-10 (δH 1,44)/H3-11 (δH 1,44) C-9 (δC 77,8)/C-8 (δC 132,3); H-7 (δH 6,35) C-1 (δC 141,2)/C-6 (δC 123,2)/C-5 (δC 117,1) Một cầu nối ether C-1 C-9 suy tín hiệu carbon liên kết với oxy sp3 δC 77,8 (C-9) Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR hợp chất CP12A δHa, c (J, Hz) C δCa, b δHa, c (J, Hz) C δCa, b 141,2 5′ 157,2 146,4 6′ 116,1 114,3 6,88 (d, 2,0) 7′ 157,2 132,0 8′ 105,8 6,49 (s) 117,1 6,69 (d, 2,0) 1″ 23,2 3,33 (d, 7,0) 123,2 2″ 124,5 5,27 (t, 7,0) 123,4 6,35 (d, 10,0) 3″ 134,9 132,3 5,69 (d, 10,0) 4″ 16,3 1,78 (s) 77,8 5″ 40,9 1,97 (t, 7,0) 10 28,0 1,44 (s) 6″ 27,8 2,07 (m) 11 28,0 1,44 (s) 7″ 125,5 5,09 (t, 7,0) 1′ 128,2 6,84 (d, 16,0) 8″ 131,9 2′ 128,0 6,76 (d, 16,0) 9″ 25,8 1,64 (s) 3′ 137,4 10″ 17,7 1,58 (s) 4′ 105,8 6,49 (s) a đo CD3OD, b125 MHz, c500 MHz Từ việc phân tích liệu phổ thu cho ph p xác định cấu trúc hợp chất CP12A hợp chất phenolic mới, lần phân lập từ tự nhiên đặt tên caricapapayol (Hình 3.1) 12 Hình 3.2 Phổ HRESIMS hợp chất CP12A Hình 3.3 Phổ 1H-NMR hợp chất CP12A Hình 3.4 Phổ 13C-NMR hợp chất CP12A 13 Hình 3.5 Phổ DEPT hợp chất CP12A Hình 3.6 Phổ HSQC hợp chất CP12A Hình 3.7 Phổ HMBC hợp chất CP12A 14 3.4 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro hợp chất hóa học Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư phổi (A549), tế bào ung thư vú (MCF-7), tế bào ung thư gan (Hep3B) hợp chất hóa học phân lập từ hoa đu đủ đực trình bày Bảng 3.3 Bảng 3.3 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất hóa học từ hoa đu đủ đực Kết thu Bảng 3.3 cho thấy tất hợp chất hóa học thử nghiệm thể hoạt tính gây độc tế bào ba dòng tế bào ung thư người với giá trị IC50 khoảng 30,70±2,72 đến 93,07±5,03 µg/mL Đáng lưu ý hầu hết hợp chất hóa học có tác dụng ức chế tốt dòng tế bào ung thư người MCF-7 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN Thành phần hóa học Từ hoa đu đủ đực, phân lập xác định cấu trúc hóa học 16 hợp chất tinh khiết Theo tra cứu tài liệu thời điểm nghiên cứu hợp chất phân lập có hợp chất mới, hợp chất lần công bố phân lập từ nguồn tự nhiên, hợp chất lần phân lập từ loài - Một hợp chất caricapapayol - Một hợp chất lần công bố phân lập từ nguồn tự nhiên 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2-carbaldehyde 15 - Chín hợp chất lần phân lập từ loài này: vitexoid, lariciresinol, dehydrodiconiferyl alcohol, 6-hydroxy-2,6dimethyl-2,7-octadienoic acid, 6-hydroxy-2,6-dimethyloct-7-enoic acid, 2,6-dimethylocta-2,7-diene-1,6-diol, tetratriacontanyl palmitate, 1hentriacontanol vanillin - Năm hợp chất lại biết: rutin, acid gallic, daucosterol, benzyl-O--D-glucopyranoside stigmasterol Hoạt tính gây độc tế bào ung thư - Đã tiến hành sàng lọc đánh giá hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn n-hexane, chloroform, ethyl acetate từ hoa đu đủ đực ba dòng tế bào ung thư (A549, MCF-7, Hep3B) điều kiện in vitro Kết cho biết cao chiết có khả ức chế phát triển ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm mức độ khác Trong đó, cao chloroform hoa đu đủ đực thể hoạt tính gây độc tế bào tốt ba dòng tế bào với phần trăm tế bào sống sót khoảng 15,49±1,65 đến 55,28±2,80% nồng độ 100 µg/mL 44,64±2,21 đến 70,42±1,49% nồng độ 30 µg/mL - Đã tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 10/16 hợp chất tinh khiết phân lập từ đu đủ đực ba dòng tế bào ung thư người A549, MCF-7 Hep3B Kết cho thấy 10/10 hợp chất thử nghiệm có khả ức chế phát triển ba dòng tế bào ung thư với mức hoạt tính ức chế có giá trị IC50 khoảng từ 30,70±2,72 đến 93,07±5,03 µg/mL, đáng lưu ý hầu hết hợp chất có tác dụng ức chế tốt dòng tế bào ung thư người MCF-7 II KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào ung thư đu đủ đực (Carica papaya L.) Việt Nam, kiến nghị: - Cần tiếp tục khảo sát thành phần hóa học phân đoạn khác từ loài nhằm tìm kiếm hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào ung thư người - Cần tiếp tục thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư người khác nghiên cứu chế gây chết tế bào ung thư người hợp chất phân lập - Đối với hợp chất phân lập, cần nghiên cứu thêm hoạt tính sinh học khác hoạt tính oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính kháng viêm,… ... epidermoid carcinoma KB Diễn giải Ung thư phổi người Ung thư vú người Ung thư gan người Ung thư tuyến tiền liệt Ung thư cổ tử cung Ung thư máu cấp tính Ung thư biểu mơ viii Kí hiệu Tiếng anh... nghèo, có bệnh ung thư Do đó, đề tài: Nghiên cứu chiết tách phân lập hợp chất hóa học gây độc tế bào ung thư từ dịch chiết đu đủ đực (Carica papaya L.) lựa chọn Mục đích nghiên cứu Phân lập xác... gây độc tế bào ung thư in vitro hợp chất hóa học Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư phổi (A549), tế bào ung thư vú (MCF-7), tế bào ung thư gan (Hep3B) hợp chất hóa học phân lập từ hoa đu