Nghiên cứu tinh sạch protein p53 tái tổ hợp từ chủng nấm men pichia pastoris x33 36 và ảnh hưởng của nó đến tế bào ung thư nuôi cấy (luận văn thạc sĩ khoa học)
Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 58 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
58
Dung lượng
2,88 MB
Nội dung
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Quang Hòa NGHIÊN CỨU TINH SẠCH PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33-36 VÀ ẢNH HƯỞNG CỦ A NÓ ĐẾN TẾ BÀ O UNG THƯ NUÔI CẤY LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Quang Hòa NGHIÊN CỨU TINH SẠCH PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33-36 VÀ ẢNH HƯỞNG CỦ A NÓ ĐẾN TẾ BÀ O UNG THƯ NUÔI CẤY Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8420101.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đinh Nho Thái Hà Nội - 2020 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Đinh Nho Thái trực tiếp giảng dạy, hướng dẫn giúp đỡ tận tình cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu để hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy, cô thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt thầy, cô Bộ môn Di truyền học truyền đạt cho tri thức quý báu thời gian học tập nghiên cứu trường Đồng thời xin cảm ơn ThS Bùi Thị Vân Khánh hướng dẫn tơi q trình làm thí nghiệm ni cấy tế bào thử nghiệm độc tính tế bào Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô thuộc Phịng thí nghiệm Mơi trường Đất, Khoa Mơi Trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên cho phép sử dụng thiết bị nuôi cấy vi sinh Tôi xin gửi lời cảm ơn học viên cao học em sinh viên Bộ môn Di truyền học cán em sinh viên Phịng Protein tái tổ hợp, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein nhiệt tình hỗ trợ nhiều thời gian làm việc phịng thí nghiệm Lời cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè nhiệt tình động viên, chia sẻ kinh nghiệm ủng hộ hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu Hà Nội, ngày 15 tháng 02 năm 2020 Học viên Nguyễn Quang Hòa DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AIDS Acquired immuno deficiency syndrome BMMY Buffered methanol complex medium Bps Base pairs CI 24 Chloroform : isopropanol DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxy ribonucleotide triphosphates EtBr Ethidium bromide FBS Fetal bovine serum HBV Hepatitis B virus HIV Human immunodeficiency virus HPV Human papilloma virus kDa Kilo Daltons NST Nhiễm sắc thể PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase chain reaction PMS Phenazine methyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis TAE Tris base-acetic-EDTA TBE Tris base-axit boric-EDTA WHO World Health Organization YPD Yeast extract-peptone-dextrose medium MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan tình hình ung thư giới Việt Nam 1.1 Tình hình ung thư giới 1.2 Tình hình ung thư Việt Nam 1.3 Các nguyên nhân gây ung thư 1.4 Các biện pháp phòng ngừa bệnh ung thư Tổng quan gen TP53 protein p53 2.1 Cấu trúc gen TP53 protein p53 2.2 Cấu trúc không gian protein p53 2.3 Các trình tự nhận biết đặc hiệu protein p53 với gen mục tiêu 2.4 Chức protein p53 2.5 Cơ chế protein p53 gây nên apoptosis ảnh hưởng đến ức chế tế bào khối u 2.6 Tổng quan nghiên cứu biểu protein cho liệu pháp điều trị đích ung thư 11 2.6.1 Liệu pháp điều trị ung thư dựa vào protein p53 13 Nghiên cứu biểu protein p53 nấm men giới Việt Nam 13 Vector pPicZαA-TAT-p53-his chế thử nghiệm protein p53 tái tổ hợp mức độ tế bào 14 i CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu hóa chất 16 2.1.1 Vật liệu 16 2.1.2 Hóa chất 18 2.1.3 Các dung dịch đệm 18 2.1.4 Thiết bị dùng nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Kiểm tra chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 nuôi biểu thu sinh khối protein p53 tái tổ hợp 20 2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số nấm men 20 2.2.3 Phương pháp điện di DNA gel Agarose 21 2.2.4 Phương pháp điện di protein gel polyacrylamide (SDSPAGE) 22 2.2.5 Phương pháp sắc ký lực 23 2.2.6 Định lượng protein phương pháp Bradford 24 2.2.7 Phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư điều kiện in vitro 25 2.2.8 Phương pháp kiểm tra ảnh hưởng dung dịch P lên tế bào ung thư điều kiện in vitro 25 2.2.9 Phương pháp thử độc tính tế bào MTS (3-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Kết nuôi biểu protein p53 nấm men Pichia pastoris X33-36 29 ii 3.1.1 Kết kiểm tra gen TAT-p53-His chứa hệ gen nấm men Pichia pastoris X33-36 29 3.1.2 Kết nuôi biểu chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 30 3.1.3 Kết điện di dịch nuôi biểu thô sau tinh 31 3.1.4 Kết định lượng protein phương pháp Bradford 33 3.2 Kết nuôi tế bào ung thư in vitro 35 3.2.1 Kết kiểm tra khả ảnh hưởng môi trường pha thuốc tới tế bào ung thư nuôi cấy 36 3.2.2 Kết thử độc tính tế bào khả ức chế tăng trưởng tế bào ung thư với thuốc thử protein p53 tái tổ hợp 38 KẾT LUẬN 42 KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC iii DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cấu trúc protein p53 người Hình Cấu trúc phân tử protein p53 Hình 3: Các khảo sát nghiên cứu protein p53 từ 319 nghiên cứu độc lập Hình 4: Điều chỉnh mức độ biểu protein p53 tế bào bị tác động bất lợi bình thường 10 Hình 5: Hai đường phổ biến dẫn tới apoptosis [3] 11 Hình 6: Cấu trúc vector pPicZαA-TAT-p53-his 15 Hình 7: Tế bào HeLa kính hiểm vi soi ngược Axiovert 40 CFL 17 Hình 8: Tế bào KMS-20 kính hiểm vi soi ngược Axiovert 40 CFL 17 Hình 9: Cấu trúc hóa học muối MTS sản phẩm Formazan 26 Hình 10: Hình ảnh điện di kết kiểm tra gen phản ứng PCR 29 Hình 11: Đường sinh trưởng chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 mang nuôi biểu 30 Hình 12 Kết điện di SDS-PAGE sản phẩm protein tinh 31 Hình 13: Kết điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh protein p53 nồng độ Imidazol khác 32 Hình 14: Kết điện di SDS-PAGE sản phẩm protein thu sau tinh điều kiện pH 6.0 8.0 33 Hình 15 Đường chuẩn Bradford 34 Hình 16: Tế bào HeLa (A) tế bào KMS-20 (B) sau 48h nuôi cấy in vitro (VK10, room 5.6) 36 iv Hình 17: Tế bào HeLa điều kiện có mơi trường pha mẫu P khơng có mơi trường pha mẫu P soi kính hiển vi (VK10, room 5.6) 37 Hình 18: Tế bào KMS-20 điều kiện có mơi trường pha mẫu P khơng có mơi trường pha mẫu P soi kính hiển vi (VK10, room 5.6) 37 Hình 19: Hình thái tế bào HeLa sau 48h ủ với chế phẩm p53 với nồng độ thử nghiệm khác (VK10, room 5.6) 38 Hình 20: Hình thái tế bào KMS-20 sau 48h ủ với chế phẩm p53-his với nồng độ thử nghiệm khác (VK10, room 5.6) 39 Hình 21: Dải màu sau thêm MTS vào dòng tế bào KMS-20 sau thử hoạt tính protein p53 tái tổ hợp 40 Hình 22: Biểu đồ mối tương quan logarit nồng độ chất thử số tăng sinh A% 41 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Hóa chất sử dụng thí nghiệm Bảng 2: Thành phần dung dịch, đệm môi trường nuôi cấy Bảng 3: Thành phần gel polyacrylamide 12% Bảng 4: Thành phần phản ứng Bradford Bảng 5: Dải nồng độ thuốc sử dụng thử nghiệm Bảng 6: Quy trình tiến hành thí nghiệm MTS Bảng 7: Kết đo OD595 nm dựng đường chuẩn Bảng 8: Kết Bradford trình tinh Bảng 9: Kết đo OD490 nm với dòng tế bào KMS-20 thử nghiệm thuốc vi Bảng 7: Kết đo OD595 nm dựng đường chuẩn mBSA (µg) 10 20 30 40 50 OD595 nm 0.34 0.46 0.622 0.83 0.95 1.102 Đường chuẩn Bradford xây dựng có phương trình y = 0.0198x + 0.1764 1.4 y = 0.0198x + 0.1764 R² = 0.9392 1.2 OD595nm 0.8 OD595 nm 0.6 Linear (OD595 nm) 0.4 0.2 0 10 20 30 40 50 60 mBSA Hình 15 Đường chuẩn Bradford Dựa vào phương trình đường chuẩn (Hình 3.14), chúng tơi xác định nồng độ mẫu cần định lượng (X) công thức sau: X (mg/ml) = (𝑦−0,1764) 0,0198.𝑉 Trong đó, y giá trị OD595 nm đo mẫu, V (µl) thể tích mẫu sử dụng phản ứng Bradford Với ml dịch cô đưa lên cột, thu lại ml dịch tinh chứa protein p53 tái tổ hợp sử dụng để làm mẫu đo phản ứng định lượng Bradford Kết đo OD595 nm nồng độ protein tương ứng trình bày Bảng 34 Bảng 8: Kết đo nồng độ protein phương pháp Bradford trình tinh Dịch Dịch trơi cột FT TAT-p53-His Hiệu suất (%) 50 50 50 - OD595 nm 0.825 0.188 1.185 - Nồng độ (mg/ml) 0.655 0.011 1.019 77.8 V (µl) Lượng protein tổng số 6ml dịch là: mprotein tổng số = 0.655 x = 3.93 (mg) Lượng protein p53 tái tổ hợp thu 3ml dịch tinh là: mp53 = 1.019 x = 3.057 (mg) Hiệu suất tinh là: H = mp53: mprotein tổng số = 3.057/3.93 = 77.8% Với 60ml dịch cô, lượng protein tổng số là: mprotein tổng số = 60 x 0,655 = 39.3 (mg) Với hiệu suất H= 0,778, tổng lượng p53 tái tổ hợp thu từ 60ml dịch cô là: mp53 = 39.3 x 0.778 = 30.5754 (mg) Do vậy, với 400ml môi trường nuôi biểu (tương đương với 60ml dịch cơ) nồng độ p53 tái tổ hợp thu hồi 30.5754 mg Từ kết so sánh với kết nghiên cứu trước nghiên cứu Thạc sĩ Trần Thị Thúy Nga năm 2017, đưa kết luận tinh protein p53 tái tổ hợp với nồng độ cao hơn, khả tinh hiệu tinh cao Tại điều kiện tinh pH=8.0 cho thấy hiệu tinh trở nên rõ ràng so với điều kiện tinh pH=6.0 trước Đồng thời lượng dung dịch thu lại sau lần tinh so với lượng dịch cho vào nửa hiệu suất tinh lại thể rõ ràng 21,8% so với kết công bố trước 3.2 Kết nuôi tế bào ung thư in vitro Dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa ung thư máu KMS-20 hai dòng tế bào sử dụng cho nghiên cứu, dịng HeLa có đặc điểm sinh trưởng phát triển bám dính, cịn dịng KMS-20 có đặc điểm sống trơi môi trường nuôi cấy 35 Điều kiện tối ưu cho sinh trưởng phát triển điều kiện 37oC, 95% O2 5% CO2, môi trường nuôi cấy DMEM low với dòng HeLa RPMI 1640 với dòng tế bào KMS-20 có bổ sung 10% FBS 1% kháng sinh (Ampicillin / streptomycin) A B Hình 16: Tế bào HeLa (A) tế bào KMS-20 (B) sau 48h nuôi cấy in vitro (VK10, room 5.6) 3.2.1 Kết kiểm tra khả ảnh hưởng môi trường pha thuốc tới tế bào ung thư nuôi cấy Môi trường để bảo quản protein p53-his sử dụng Glycerol (25%) + BSA (~1%) + Sucrose (~0.01%) Chúng sử dụng nguyên nồng độ dung dịch thay pha với protein p53-his chúng tơi pha với mơi trường ni cấy dịng tế bào HeLa (DMEM low) KMS-20 (RPMI 1640) 10% FBS 1% kháng sinh P-S Sau ni dịng tế bào 37oC, 5%CO2 24h Kết nuôi cấy sau: 36 A B Hình 17: Tế bào HeLa điều kiện có mơi trường pha mẫu P khơng có mơi trường pha mẫu P soi kính hiển vi (VK10, room 5.6) Chú thích: A: Tế bào HeLa khơng có mơi trường pha mẫu P; B: Tế bào HeLa điều kiện có mơi trường pha mẫu P Với kết tế bào HeLa thu nhận thấy tế bào HeLa nuôi mơi trường có sử dụng mơi trường pha mẫu khơng thể khác biệt so với dòng tế bào đối chứng ni mơi trường ni cấy bình thường Từ kết luận mơi trường sử dụng để pha mẫu khơng có ảnh hưởng đến sức sống, khả sinh trưởng dòng tế bảo HeLa Với dịng tế bào KMS-20: A B Hình 18: Tế bào KMS-20 điều kiện có mơi trường pha mẫu P khơng có mơi trường pha mẫu P soi kính hiển vi (VK10, room 5.6) Chú thích: A: Tế bào KMS-20 khơng có mơi trường pha mẫu P; B: Tế bào KMS-20 điều kiện có mơi trường pha mẫu P 37 Với kết tế bào KMS-20 thu nhận thấy tế bào KMS-20 ni mơi trường có sử dụng mơi trường pha mẫu khác biệt so với dịng tế bào đối chứng ni mơi trường ni cấy bình thường Từ kết luận mơi trường sử dụng để pha mẫu khơng có ảnh hưởng đến sức sống, khả sinh trưởng dịng tế bảo KMS-20 3.2.2 Kết thử độc tính tế bào khả ức chế tăng trưởng tế bào ung thư với thuốc thử protein p53 tái tổ hợp Sau tra thuốc 48h với dải nồng độ: µg/ml – 3.5 µg/ml – 1.75 µg/ml – 0.875 µg/ml – 0.4375 µg/ml – 0.21875 µg/ml – 0.109375 µg/ml đĩa 96 giếng điều kiện 37oC, 5% CO2 Chúng tơi quan sát kính hiển vi ghi lại hình ảnh hình thái tế bào tất giếng đối chứng thí nghiệm, từ so sánh thay đổi số lượng, hình thái lơ Hình 19: Hình thái tế bào HeLa sau 48h ủ với chế phẩm p53 với nồng độ thử nghiệm khác (VK10, room 5.6) Chú thích: A: giếng đối chứng; B: giếng sử dụng nồng độ thuốc 0.109375 µg/ml; C: giếng sử dụng nồng độ thuốc 0.875 µg/ml; D: giếng sử dụng nồng độ thuốc µg/ml 38 Kết thu cho thấy, dòng tế bào HeLa, dòng tế bào có đặc điểm sống bám dính tác dụng chế phẩm P53-his tất nồng độ thử nghiệm cho thấy khơng có khác biệt so với đối chứng mật độ hình thái tế bào Hình 20: Hình thái tế bào KMS-20 sau 48h ủ với chế phẩm p53-his với nồng độ thử nghiệm khác (VK10, room 5.6) Chú thích: A: giếng đối chứng; B: giếng sử dụng nồng độ thuốc 0.109375 µg/ml; C: giếng sử dụng nồng độ thuốc 0.875 µg/ml; D: giếng sử dụng nồng độ thuốc µg/ml Kết dịng tế bào KMS-20, dịng tế bào có đặc điểm sống trơi dịch nuôi cấy, tác dụng chế phẩm P53-his cho thấy khác biệt rõ ràng Trong đó, với nồng độ thuốc thử cao µg/ml cho thấy tế bào sống sót, tế bào trịn đều, sáng chứng tỏ thuốc không ảnh hưởng làm gây chết tế bào Tuy nhiên số lượng tế bào ít, chiếm khoảng 20% bề mặt giếng, nhiều so với giếng đối chứng sinh trưởng khoảng 90% bề mặt giếng Trong giếng thử nghiệm với nồng độ thuốc thử thấp 0.109375 µg/ml cho thấy số 39 lượng tế bào gần không khác biệt lớn so với giếng đối chứng Từ chúng tơi dự đốn số IC50 chế phẩm protein tái tổ hợp p53-his nằm khoảng giới hạn nồng độ thử nghiệm Với kết so sánh hình thái thu cho thấy chế phẩm P53-his khơng thể tính độc hai dịng tế bào nghiên cứu HeLa KMS-20, có tác dụng ức chế q trình sinh trưởng phát triển dịng tế bào ung thư máu KMS-20 Kết nhuộm đĩa 96 giếng với thuốc thử MTS cho thể màu rõ ràng từ màu vàng nhạt đến màu nâu đậm dòng KMS-20 với nồng độ thuốc thử khác sau: Hình 21: Dải màu sau thêm MTS vào dòng tế bào KMS-20 sau thử hoạt tính protein p53 tái tổ hợp Chú thích: ĐC: Đối chứng; 1,2,3,4,5,6,7: Dải thử nồng độ từ 0,109375 µg/ml đến µg/ml với bước nhảy 0,5 lần giếng Kết đo OD490 nm máy đo quang học với bước sóng cực đại 490nm: Với dịng tế bào KMS-20: 40 Bảng 9: Kết đo OD490 nm với dòng tế bào KMS-20 thử nghiệm thuốc Nhiệt độ Đối (oC) chứng 25.8 C7 C6 C5 C4 C3 C2 C1 0.7875 0.7189 0.7012 0.65 0.6063 0.4754 0.372 0.3964 25.8 0.6909 0.7587 0.6473 0.6461 0.56 0.4576 0.3679 0.3987 25.8 0.721 0.8672 0.8646 0.7512 0.6123 0.4667 0.4411 0.4688 Ghi chú: C1: µg/ml; C2: 3.5 µg/ml; C3: 1.75 µg/ml; C4: 0.875 µg/ml; C5: 0.4375 µg/ml; C6: 0.21875 µg/ml; C7: 0.109375 µg/ml Với kết đo bảng trên, hoàn toàn phù hợp với kết so sánh hình thái Để xác định cụ thể giá trị IC50 chất, dựa vào mối tương quan nồng độ chất thử số lượng tế bào, phương pháp toán học Excell vẽ biểu đồ thu giá trị IC50=2.1 µg/ml dịng KMS-20, dịng HeLa chưa xác định giá trị nồng độ thử nghiệm cao số lượng hình thái đạt mức tương đương với đối chứng A% y = 27.723x3 - 158x2 + 250.32x - 15.118 R² = 0.9925 120 100 80 60 40 20 0 0.5 1.5 2.5 Hình 22: Biểu đồ mối tương quan logarit nồng độ chất thử số tăng sinh A% Với giá trị IC50=2.1µg/ml, cho thấy chế phẩm thể rõ ràng tính ức chế 50% sinh trưởng tế bào KMS-20, chưa thấy tác dụng gây độc cho tế bào 41 KẾT LUẬN Từ kết thu được, đưa số kết luận sau: Đã tối ưu quy trình tinh protein p53-his biểu chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 pH = 8.0, đạt hiệu suất tinh lên đến 77,8% Đã thử nghiệm độc tính khả ức chế chế phẩm protein p53-his mức độ tế bào dòng tế bào ung thư máu KMS-20 dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa cho kết chế phẩm gây ức chế sinh trưởng dịng tế bào KMS-20 mà khơng gây độc cho tế bào KIẾN NGHỊ Từ kết thu được, đưa số kiến nghị sau: Tiếp tục sử dụng chế phẩm p53 tái tổ hợp dòng tế bào ung thư khác thử nghiệm cấp độ mô, thể nhằm kiểm nghiệm khả đưa chế phẩm để chữa trị cho bệnh nhân ung thư 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Andreas C., Joerger and Alan R Fersht, (2010), “The Tumor Suppressor p53: From Structures to Drug Discovery”, Cold Spring Harb Perspect Biol, pp 5-6 Arnold J Levine, (2017), “The Evolution of Tumor Formation in Humans and Mice with Inherited Mutations in the p53 Gene”, Curr Top Microbiol Immunol 2017, pp Brandon JA., LK Gemma, J Ana, JH Marco, and A Strasser (2018), “How does p53 induce apoptosis and how does this relate to p53mediated tumour suppression?”, Cell Death and Differentiation Choudhary S , Mathew M and Verma RS., (2011), “Therapeutic potential of anticancer immunotoxins”, Drug Discov Today 2011 Jun, pp 495503 Creagan, T Edward and Mayo C (2001), “Mayo Clinic on healthy aging” Dillman RO., (2011), “Cancer immunotherapy”, Cancer Biother Radiopharm, pp 1-64 el-Deiry W S , S.E Kern, J.A Pietenpol, K W Kinzler and Vogelstein B., (1992) “Definition of a consensus binding site for p53 Nature Genetics”, pp 45-49 el-Deiry W S , T Tokino, V E Velculescu, D B Levy, R Parsons, J M Trent, D Lin, W E Mercer, K W Kinzler and Vogelstein B., (Nov 19), “WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression”, Cell 1993, pp 17-25 el-Deiry W S., T Tokino, T Waldman, J D Oliner, V E Velculescu, M Burrel, D E Hill, E Healy, J L Rees and Hamilton S R., (1995), “Topological control of p21WAF1/CIP1 expression in normal and neoplastic tissues”, Cancer Res, pp 10 Freddie B., J Ferlay; I Soerjomataram, R L Siegel, L A Torre and Ahmedin J (2018), Global Cancer Statistics 2018: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries, CA CANCER J CLIN 2018 11 Friedman PN., X Chen, J Bargonetti and Prives C (1993), “The p53 protein is an unusually shaped tetramer that binds directly to DNA”, pp 5878 43 12 GBD 2015 Risk Factors Collaborators Global, regional, and national comparative risk assessment of 79 behavioural, environmental and occupational, and metabolic risks or clusters of risks, 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015, Lancet 2016 Oct; 388 (10053): pp 1659-1724 13 Hunter J J., B L Bond and Parslow T G., (1996), “Functional dissection of the human Bcl2 protein: sequence requirements for inhibition of apoptosis”, Mol Cell Biol, pp 877-83 14 Kappeler KV., J Zhang, TN Dinh, J Strom and Chen QM (2012), “Histone Deacetylase Associates with Ribosomes and Regulates De Novo Protein Translation during Arsenite Stress”, Toxicol, Sci, pp 246-55 15 Kastan M B., Q Zhan, W S el-Deiry, F Carrier, T Jacks, W V Walsh, B S Plunkett, B Vogelstein and Fornace AJ Jr., (1992), “A mammalian cell cycle checkpoint pathway utilizing p53 and GADD45 is defective in ataxia-telangiectasia”, Cell, 1992 Nov 13; pp 587-97 16 Lane, edited by Arnold J Levine and David P (2010),The p53 family: a subject collection from Cold Spring Harbor Perspectives in biology Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press 17 Liu MA., (2011), “Cancer vaccine”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2011 Oct 12; pp 2823-6 18 M Fischer, (2017), “Census and evaluation of p53 target genes”, Oncogene 2017 Jul 13, pp 3943–3956 19 Maria-Cristina SP and Thiessa RV., (2013), “Production of recombinant immunotherapeutics for anticancer treatment”, Bioengineered, pp 306 20 McBride OW., D Merry and Givol D (January 1986), "The gene for human p53 cellular tumor antigen is located on chromosome 17 short arm (17p13)", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, pp 130–4 21 Mraz M., K Malinova, J Kotaskova, S Pavlova, B Tichy, J Malcikova, Stano K Kozubik, J Smardova, Y Brychtova, M Doubek, M Trbusek, J Mayer and Pospisilova S (June 2009), "miR-34a, miR-29c and miR-17-5p are downregulated in CLL patients with TP53 abnormalities", Leukemia, pp 1159–63 22 Özlem SA., (2017), In Vitro Cytotoxicity and Cell Viability Assays: Principles, Advantages, and Disadvantages, pp 44 23 Plummer M, C de Martel, J Vignat, J Ferlay, F Bray and Franceschi S (2012), “a synthetic analysis Lancet Glob Health”, Global burden of cancers attributable to infections in 2012: pp 30143-7 24 Ricardo A., M B Sherman, K Brownless, R Lurz, A L Okorokov and Elena V O., (2011),” Quaternary structure of the specific p53–DNA complex reveals the mechanism of p53 mutant dominance”, Nucleic Acids Research, Vol 39, No 20, pp 25 Roth JA., Nguyen D., Lawrence DD., Kemp BL., Carrasco CH., Ferson DZ., Hong WK., Komaki R., Lee JJ., Nesbitt JC., Pisters KM., Putnam JB., Schea R., Shin DM., Walsh GL., Dolormente MM., Han CI., Martin FD., Yen N., Xu K., Stephens LC., McDonnell TJ., Mukhopadhyay T and Cai D., (1996), “Retrovirus-mediated wild-type p53 gene transfer to tumors of patients with lung cancer”, Nat Med 1996 Sep, pp 985-91 26 Stewart BW., CP Wild, editors, World cancer report 2014, “Lyon: International Agency for Research on Cancer” 27 Surget S., MP Khoury and Bourdon JC (December 2013), "Uncovering the role of p53 splice variants in human malignancy: a clinical perspective", OncoTargets and Therapy, pp 57–68 28 Wang P., M Reed, Y Wang, G Mayr, JE Stenger, ME Anderson, JF Schwedes and Tegtmeyer P (1994), “p53 domains: structure, oligomerization, and transformation”, pp 5182-91 29 Weidle UH., Schneider B., Georges G and Brinkmann U., (2012), “Genetically engineered fusion proteins for treatment of cancer”, Cancer Genomics Proteomics 2012 Nov, pp 357-72 30 Wu X., J H Bayle, D Olson and Levine A J., (1993), “The p53-mdm-2 autoregulatory feedback loop”, Genes Dev 1993 Jul, pp 1126-32 31 Yan H., N Liu, Z Zhao, X Zhang, H Xu, B Shao and Yan C (2012), “Expression and purification of human TAT-p53 fusion protein in Pichia pastoris and its influence on HepG2 cell apoptosis” Biotechnol Lett 2012 Jul, pp 1217-23 32 Zha H., C Aimé-Sempé, T Sato and Reed J C.,(1996), “Proapoptotic protein Bax heterodimerizes with Bcl-2 and homodimerizes with Bax via a novel domain (BH3) distinct from BH1 and BH2”, J Biol Chem 1996 Mar 29, pp 7440-4 33 Ziemer MA., A Mason and Carlson DM (September 1982), "Cell-free translations of proline-rich protein mRNAs", The Journal of Biological Chemistry, pp 11176–80 45 34 https://www.britannica.com/science/TP53 35 http://vanban.chinhphu.vn/portal/page/portal/chinhphu/hethongvanban?cla ss_id=1&mode=detail&document_id=33577 36 http://www.cancer.org/acs/groups/cid/documents/webcontent/003013pdf.pdf 46 PHỤ LỤC PL Trình tự gen TAT-p53-His sau cải biến > TAT-p53-His 5’GAATTCTACGGTCGTAAGAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTATGGAA GAACCCCAGTCCGATCCTTCTGTGGAGCCACCTTTGTCCCAAGAA ACCTTCTCTGACCTTTGGAAGTTATTGCCAGAGAATAATGTGTTGT CCCCATTGCCTTCCCAGGCTATGGATGACTTAATGTTATCTCCTGA CGACATCGAACAGTGGTTCACTGAGGACCCAGGACCTGATGAAG CCCCAAGGATGCCTGAGGCCGCTCCACGTGTCGCCCCAGCTCCTG CTGCCCCAACCCCTGCTGCCCCAGCTCCAGCCCCATCTTGGCCATT GTCTTCCTCTGTCCCATCCCAAAAAACTTACCAAGGATCTTACGGT TTTCGTTTAGGATTCCTTCACTCCGGTACCGCCAAATCCGTCACTT GTACCTACTCCCCTGCCTTAAATAAGATGTTTTGCCAATTGGCTAA GACCTGTCCTGTCCAGTTGTGGGTTGACTCCACCCCACCTCCAGG AACTAGAGTCAGAGCTATGGCTATCTACAAACAATCCCAACACAT GACTGAAGTTGTCAGAAGATGCCCACATCATGAGAGATGCTCTGA CTCCGATGGATTGGCCCCACCTCAGCACTTAATTCGTGTTGAAGG TAATTTGCGTGTTGAATACTTGGATGATAGAAATACCTTTCGTCAT TCCGTGGTCGTTCCATATGAACCTCCTGAAGTTGGATCTGATTGTA CTACCATTCACTATAACTATATGTGTAACTCCTCTTGTATGGGAGG TATGAATAGACGTCCTATTTTGACCATCATTACTTTAGAAGATTCC TCTGGTAACTTATTGGGTCGTAATTCCTTTGAAGTCCATGTTTGCG CTTGTCCAGGTCGTGATCGTAGAACTGAGGAAGAAAATTTGAGGA AGAAAGGTGAACCTCACCATGAATTACCACCAGGATCCACCAAA AGAGCTTTATCTAACAACACCTCTTCCTCACCACAGCCAAAGAAG AAACCACTTGACGGTGAGTATTTCACTCTTCAAATTAGAGGTCGT GAAAGATTCGAGATGTTTAGAGAGTTGAACGAGGCTCTTGAATTA AAAGACGCCCAAGCTGGTAAAGAACCAGGAGGCTCCAGGGCTCA CTCATCTCATTTGAAGTCCAAAAAGGGACAGTCCACTTCAAGACA CAAAAAGTTAATGTTCAAGACCGAAGGTCCAGATTCAGATCATCA TCATCATCATCATTGATTTCTAGA-3’ PL Trình tự suy diễn acid amin protein p53-his sử dụng website https://web.expasy.org/translate/ > 5'3' Frame 5’EFYGRKKRRQRRRMEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSP LPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPRVAPAPAAPT PAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPA LNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVR RCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYE PPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNS FEVHVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALSNNTSSSP QPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSR AHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSDHHHHHH-FL-3’ ... HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Quang Hòa NGHIÊN CỨU TINH SẠCH PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33-36 VÀ ẢNH HƯỞNG CỦ A NÓ ĐẾN TẾ BÀ O UNG THƯ NUÔI CẤY... p53 tái tổ hợp từ chủng nấ m men Pichia pastoris X33-36 và ảnh hưởng của nó đế n tế bào ung thư nuôi cấy? ?? nhằm nghiên cứu tăng cường độ tinh bước đầu kiểm tra khả tác động ức chế protein. .. biểu protein p53 tái tổ hợp nấm men Pichia pastoris X33”, tạo thành công chủng nấm men Pichia pastoris X33 mang cấu trúc pPICZαA-TAT -p53- His tối ưu quy trình biểu p53 tái tổ hợp nấm men Pichia pastoris