Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây tốc thằng cáng (anodendron paniculatum (wall ex roxb ) a DC )” tt

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC …………***………… HOÀNG THỊ NHƯ HẠNH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÂY TỐC THẰNG CÁNG (ANODENDRON PANICULATUM (WALL EX ROXB.) A.DC.) Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 62.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC Huế, năm 2018 Cơng trình hồn thành tại: Đại học Huế Trường Đại học Khoa học Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS NGUYỄN THỊ HOÀI Khoa Dược - Trường Đại học Y Dược Huế - Đại học Huế Phản biện 1: GS.TS Trần Đình Thắng Phản biện 2: PGS.TS Phạm Xuân Núi Phản biện 3: PGS.TS Trần Thị Văn Thi Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Huế họp tại: Vào hồi: ……….giờ……… ngày………tháng……… năm Có thể tìm hiểu Luận án tại: - Thư viện - Thư viện MỞ ĐẦU Sự gia tăng nhanh chóng nhiều bệnh nguy hiểm có khả lan rộng HIV/AIDS, ung thư, viêm đường hô hấp cấp SARS, cúm gia cầm H5N1, cúm lợn H1N1, dịch Ebola, chứng đầu nhỏ virus Zika… khủng hoảng thực cho sức khỏe cộng đồng thách thức khơng nhỏ cho hệ thống y tế tồn giới Nhằm bảo vệ người trước nguy bệnh tật, nhà khoa học không ngừng nghiên cứu để tìm thuốc mới, phương thức điều trị vừa hiệu vừa an toàn với thể Nhiều nghiên cứu giới nước cho thấy thực vật nguồn tài nguyên có giá trị việc khám phá phát triển thuốc Trong q trình sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thư số thuốc đồng bào Pako, Vân Kiều Quảng Trị mà khảo sát, 10 thuốc chữa bệnh liên quan đến tác dụng chống ung thư đưa vào sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào in vitro Trong đó, Tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum Roxb A.DC – Apocynaceae) thể hoạt tính ức chế phát triển tế bào ung thư tốt dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 thấp, đặc biệt dòng tế bào LU-1 (ung thư phổi), Hep-G2 (ung thư gan) MKN-7 (ung thư dày) Tuy nhiên nay, Việt Nam chưa có nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học lồi Việc sử dụng Tốc thằng cáng để chữa bệnh liên quan đến khối u chủ yếu dựa vào tri thức địa đồng bào Pako, Vân Kiều Do lồi cần nghiên cứu sâu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Từ lí nêu trên, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào ung thư Tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum (Wall ex Roxb.) A.DC.)” đề xuất với mục tiêu: Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học lồi Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ loài Nội dung nghiên cứu luận án: Chiết tách, phân lập, tinh chế hợp chất từ loài Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập Thử hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thư hợp chất phân lập Đóng góp luận án: Đã phân lập xác định cấu trúc hợp chất [anopaniester, anopanin A–C] 16 hợp chất biết từ loài Anodendron paniculatum Trong đó, 14 hợp chất [cycloartenol, (E)phytol, desmosterol, esculentic acid, kaempferol-3-O-rutinoside, rutin, sargentol, 4-O-β-D-glucopyranosyl-3-prenylbenzoic acid, inugalactolipid A, gingerglycolipid A–C, (2S)-1-O-palmitoyl-3-O-[D-galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]glycerol, (2R)-1- O-palmitoyl-3-O-α-D-(6-sulfoquinovopyranosyl)glycerol] phân lập lần từ chi Anodendron Đã đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro 17 hợp chất phân lập nhiều dòng tế bào ung thư khác (LU-1, MKN-7, Hep-G2, KB, SW-480, HL-60, LNCaP, MCF-7) Trong đó, desmosterol có tác dụng ức chế mức trung bình với dịng tế bào LU-1, MKN-7, Hep-G2, KB, SW-480 với giá trị IC50 từ 28,11±1,95 đến 41,41±2,31 µg/mL Hợp chất ursolic acid, (2R)-1-O-palmitoyl-3O-α-D-(6-sulfoquinovopyranosyl)glycerol thể hoạt tính ức chế tế bào LU-1 MKN-7 với giá trị IC50 từ 30,89±3,60 đến 72,42±8,05 µg/mL Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bản luận án tổng quan tài liệu họ Trúc đào chi Anodendron với mục: 1.1 Giới thiệu sơ lược họ Trúc đào (Apocynaceae) 1.2 Giới thiệu chi Anodendron 1.2.1 Vị trí phân loại 1.2.2 Đặc điểm thực vật phân bố 1.2.3 Các nghiên cứu thành phần hóa học 1.2.4 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học 1.3 Giới thiệu sơ lược loài Tốc thằng cáng Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Phần mặt đất loài Tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC.) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập, tinh chế hợp chất Phối hợp phương pháp sắc ký: Sắc ký mỏng, sắc ký cột Silica gel pha thường, pha đảo, Sephadex LH-20, nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất Kết hợp thông số vật lý (mp, [α]D), kiện phổ (IR, UV, MS, 1D-, 2D-NMR) chuyển hóa hóa học với việc phân tích, so sánh với tài liệu tham khảo  Phương pháp xác định thành phần monosaccharide Mẫu saponin thủy phân dung dịch TFA M 105oC Monosaccharide sau khử thành alditol NaBH4 acetyl hóa hỗn hợp acetic anhydride–pyridine (1:1, v/v) 110oC Các alditol per-acetate tạo thành phân tích phương pháp GC-MS Thành phần monosaccharide xác định thông qua việc so sánh thời gian lưu dẫn xuất alditol per-acetate chúng với giá trị tương ứng monosaccharide chuẩn điều kiện phân tích  Phương pháp xác định hợp phần acid béo glycolipid Glycolipid hịa tan toluene sau bổ sung thêm MeOH, dung dịch HCl 8% (pha MeOH) Hỗn hợp ủ 45oC khoảng 2h (để thủy phân phần) qua đêm (để thủy phân hồn tồn) Sau làm lạnh đến nhiệt độ phịng, thêm nhexane nước để chiết lấy dẫn xuất methyl ester (FAME) tạo thành Các dẫn xuất FAME phân tích phương pháp GC-MS 2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học Hoạt tính gây độc tế bào in vitro thử dòng tế bào (HL-60, LNCaP, MCF-7, LU-1, Hep-G2, KB, MKN-7 SW-480) theo phương pháp SRB Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Chương THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Xử lý mẫu chuẩn bị cao chiết: Bột nguyên liệu khô qua xử lý (2,5 kg) chiết với MeOH (10,0 lít x lần) nhiệt độ phịng (72 giờ/lần), cất loại dung môi áp suất thấp thu cao chiết MeOH (105 g) Cao chiết phân tán vào nước chiết với chloroform (CHCl3, lít x3 lần), ethyl acetate (EtOAc, lít x3 lần) Cất loại dung môi áp suất thấp thu phân đoạn tương ứng CHCl3 (AC, 50,7 g), EtOAc (AE, 10,2 g) nước (AW, 27,5 g) 3.2 Quá trình phân lập hợp chất: (1) (2) (3) (4) (5) (6) Pha tĩnh Silica gel Silica gel Silica gel YMC RP-18 Silica gel Silica gel Pha động Gradient CHCl3–MeOH (100:00:100, v/v) Gradient n-hexan–acetone (100:04:1, v/v) n-hexan–EtOAc (10:1, v/v) MeOH–acetone–H2O (10:5:1, v/v) n-hexan–acetone (5:1, v/v) CHCl3–MeOH (20:1, v/v) Hình 3.2 Sơ đồ phân lập chất từ phân đoạn chloroform Tốc thằng cáng (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) Pha tĩnh Diaion HP-20 YMC RP-18 Silica gel Sephadex LH-20 Silica gel Silica gel Sephadex LH-20 YMC RP-18 Silica gel Silica gel YMC RP-18 YMC RP-18 Silica gel Pha động Gradient MeOH−H2O (0:1, 1:3, 1:1, 3:1, 1:0, v/v) MeOH–H2O (1:1, v/v) CHCl3–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v) MeOH CHCl3–MeOH–H2O (5:1:0,1, v/v) CHCl3–MeOH–H2O (4:1:0,1, v/v) MeOH–H2O (4:1, v/v), MeOH–MeCN–H2O (3:2:3, v/v) CHCl3–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v) CHCl3–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v) MeOH–H2O (3:2, v/v) MeOH–H2O (6:1, v/v) EtOAc–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v) Hình 3.3 Sơ đồ phân lập chất từ phân đoạn nước Tốc thằng cáng 3.3 Tính chất vật lý kiện phổ hợp chất phân lập 3.3.1 Hợp chất AP1: Cycloartenol Chất bột màu trắng; IR (KBr) max (cm-1): 3418, 2928, 1670, 1443, 1377; CTPT C30H50O; M = 426; 1H 13 C-NMR: xem Bảng 4.1 Phụ lục 3.3.2 Hợp chất AP2: Anopaniester (Chất mới) Chất dầu không màu; IR (KBr) max (cm-1): 3443, 2922, 2853, 1736, 1630, 1466, 1377, 1260, 1180, 1094; UV (MeOH) max (nm): 201, 231; HRESIMS: m/z 725,5805 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho công thức C48H78O3Na, 725,5849); CTPT: C48H78O3; M = 702; 1HNMR (500 MHz, CDCl3) H (ppm): 1,22 (H-1a), 1,60 (H-1b), 1,61 (H2a), 1,74 (H-2b), 4,56 (dd, J = 11,0, 4,5 Hz, H-3), 1,42 (H-5), 0,79 (H6a), 1,57 (H-6b), 1,08 (H-7a), 1,31 (H-7b), 1,52 (dd, J = 12,0, 4,5 Hz, H-8), 1,11 (H-11a), 1,98 (H-11b), 1,61 (H-12), 1,28 (H-15), 1,29 (H16a), 1,92 (H-16b), 1,58 (H-17), 1,96 (s, H-18), 0,33 (br.d, J = 4,0 Hz, H-19a), 0,57 (br.d, J = 4,0 Hz, H-19b), 1,38 (H-20), 0,88 (d, J = 7,0 Hz, H-21), 1,04 (H-22a), 1,41 (H-22b), 1,86 (H-23a), 2,03 (H-23b), 5,10 (t, J = 6,0 Hz, H-24), 1,68 (s, H-26), 1,60 (s, H-27), 0,84 (s, H28), 0,89 (s, H-29, H-30), 2,30 (H-2), 1,61 (H-3), 1,30 (H-4), 1,30 (H-5), 1,30 (H-6), 1,36 (H-7), 2,17 (td, J = 8,0, 7,0 Hz, H-8), 5,43 (td, J = 10,5, 8,0 Hz, H-9), 5,97 (dd, J = 11,5, 10,5 Hz, H-10), 6,51 (dd, J = 15,0, 11,5 Hz, H-11), 5,69 (dd, J = 15,0, 6,5 Hz, H-12), 4,20 (m, H-13), 2,33 (H-14), 5,36 (td, J = 10,5, 8,0 Hz, H-15), 5,57 (td, J = 10,5, 7,5 Hz, H-16), 2,06 (m, H-17), 0,97 (t, J = 7,5 Hz, H-18); C-NMR (125 MHz, CDCl3) C (ppm): 31,7 (C-1), 27,0 (C-2), 80,5 13 (C-3), 39,6 (C-4), 47,3 (C-5), 21,1 (C-6), 26,0 (C-7), 48,0 (C-8), 20,3 (C-9), 26,1 (C-10), 26,6 (C-11), 33,0 (C-12), 45,4 (C-13), 48,9 (C-14), 35,7 (C-15), 28,3 (C-16), 52,4 (C-17), 18,1 (C-18), 29,9 (C-19), 36,0 (C-20), 18,4 (C-21), 36,5 (C-22), 25,1 (C-23), 125,3 (C-24), 131,0 (C25), 25,9 (C-26), 17,8 (C-27), 25,6 (C-28), 15,4 (C-29), 19,4 (C-30), 173,8 (C-1), 35,0 (C-2), 25,2 (C-3), 29,1 (C-4), 29,2 (C-5), 29,6 (C6), 29,8 (C-7), 27,8 (C-8), 133,1 (C-9), 127,9 (C-10), 126,0 (C-11), 135,2 (C-12), 72,3 (C-13), 35,4 (C-14), 123,9 (C-15), 135,3 (C-16), 20,9 (C-17), 14,4 (C-18) 3.3.3 Hợp chất AP3: (E)-Phytol Chất dầu không màu; IR (KBr) max (cm-1): 3449, 2932, 1636, 1462, 1381, 1003; HRESIMS: m/z 319,2931 [M + Na]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C20H40ONa, 319,2977); CTPT C20H40O; M = 296; 1H 13C-NMR: xem Bảng 4.4 Phụ lục 3.3.4 Hợp chất AP4: Desmosterol Chất bột màu trắng; mp: 122–124oC; IR (KBr) max (cm-1): 3445, 2936, 1636, 1462, 1377, 1053; HRESIMS: m/z 385,3513 [M + H]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C27H45O, 385,3470); CTPT C27H44O; M = 384; 1H 13C-NMR: xem Bảng 4.5 Phụ lục 3.3.5 Hợp chất AP5: Ursolic acid Chất bột màu trắng; [ ]20 +65 (c 0,5, EtOH), mp 284–286oC, UV D (MeOH) λmax (nm): 201, 230; IR (KBr) νmax (cm-1): 3433, 2870, 1690; ESIMS: m/z 479,2 [M + Na]+, 455,2 [M - H]-; CTPT C30H48O3; M = 456; 1H 13C-NMR: xem Bảng 4.6 Phụ lục 3.3.6 Hợp chất AP6: Vanillin Chất bột màu trắng; mp 82–84oC, UV (MeOH) λmax (nm): 204, 231, 278, 309; IR (KBr) νmax (cm-1): 3310, 1674, 1589, 1512, 1026, ESIMS: m/z 175,0 [M + Na]+; CTPT C8H8O3; M = 152; 1H 13C-NMR: xem Bảng 4.7 Phụ lục 3.3.7 Hợp chất AP7: Esculentic acid Chất bột màu trắng; mp 267–268oC; IR (KBr) νmax (cm-1): 3425, 2927, 2363, 1690, 1458, 1038; HRESIMS: m/z 511,3390 [M + Na]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C30H48O5Na, 511,3399); CTPT C30H48O5; M = 488; 1H 13C-NMR: xem Bảng 4.8 Phụ lục 3.3.8 Hợp chất AP8: Kaempferol-3-O-rutinoside Chất bột màu vàng; [ ]20 +11 (c 0,8, MeOH); mp 188–190oC, D UV (MeOH) λmax (nm): 203, 267, 351; IR (KBr) νmax (cm-1): 3410, 1659, 1605, 1497, 1566, 1180, 1065; ESIMS: m/z 617,1 [M + Na]+, 593,1 [M - H]-; CTPT C27H30O15; M = 594; 1H 13C-NMR: xem Bảng 4.9 Phụ lục 3.3.9 Hợp chất AP9: Rutin Chất bột màu vàng; [ ]20 +4 (c 0,5, MeOH), mp 193–195oC, UV D (MeOH) λmax (nm): 204, 257, 357; IR (KBr) νmax (cm-1): 3418, 1651, 1605, 1504 , 1204, 1065; ESIMS: m/z 633,1 [M + Na]+, 609,1 [M - H]-; CTPT C27H30O16; M = 610; 1H 13C-NMR: xem Bảng 4.10 Phụ lục 3.3.10 Hợp chất AP10: Anopanin A (Chất mới) Chất bột trắng; mp: 213–215oC; [ ]22 -19,9 (c 0.1, MeOH); IR D -1 (KBr) max (cm ): 3418, 2932, 1713, 1632, 145, 1383, 1265, 1070, 1030; HRESIMS: m/z 1025,5294 [M + Na]+ (tính tốn cho C50H82O20Na, 1025,5297); CTPT C50H82O20; 1H 13 C-NMR: xem Bảng 4.11, 4.12 3.3.11 Hợp chất AP11: Anopanin B (Chất mới) Chất bột trắng; mp: 222–224oC; [ ]22 +77,7 (c 0,1, MeOH); IR D -1 (KBr) max (cm ): 3443, 2930, 1730, 1647, 1460, 1377, 1252, 1074, 1028; HRESIMS: m/z 1027,5452 [M + Na]+ (tính tốn cho C50H84O20Na, 1027,5454); CTPT C50H84O20; 1H-NMR (600 MHz, C5D5N) H (ppm): 1,11 (H-1a), 1,43 (H-1b), 1,84 (m, H-2a), 2,27 (m, H-2b), 3,38 (dd, J = 11,4, 4,2 Hz, H-3), 1,26 (H-5), 0,68 (q, J = 12,6 Hz, H-6a), 1,51 (H-6b), 1,03 (H-7a), 1,22 (H-7b), 1,52 (H-8), 1,06 (H-11a), 1,98 (H-11b), 1,60 (H-12a), 1,66 (H-12b), 1,48 (H-15a), 2,01 (H-15b), 5,27 (dd, J = 6,0, 6,0 Hz, H-16), 2,15 (s, CH3COO), 2,08 (dd, J = 10,2, 6,6 Hz, H-17), 1,01 (s, H-18), 0,20 (d, J = 4,2 Hz, H-19a), 0,46 (d, J = 4,2 Hz, H-19b), 1,78 (H-20), 1,02 (d, J = 6,0 Hz, H-21), 1,74 (H-22), 1,88 (H-23), 3,76 (m, H-24), 1,52 (s, H-26), 1,55 (s, H-27), 1,30 (s, H-28), 1,14 (s, H-29), 1,13 (s, H-30), 4,86 (d, J = 7,2 Hz, H-1), 4,29 (H-2), 4,30 (H-3), 4,26 (H-4), 3,84 (ddd, J = 9,6, 3,6, 3,0 Hz, H-5), 4,49 (H-6a), 4,53 (H-6b), 5,42 (d, J = 7,8, H1), 4,10 (H-2), 4,23 (H-3), 4,34 (H-4), 3,94 (ddd, J = 9,6, 3,6, 3,6 Hz, H-5), 4,48 (H-6a), 4,52 (H-6b), 5,16 (d, J = 7,8 Hz, H1‴), 4,09 (H-2‴), 4,26 (H-3‴), 4,24 (H-4‴), 4,00 (m, H-5‴), 4,32 (H6‴a), 4,51 (H-6‴b); C-NMR (150 MHz, C5D5N) C (ppm): 32,5 13 (C-1), 30,3 (C-2), 89,4 (C-3), 41,7 (C-4), 48,2 (C-5), 21,5 (C-6), 26,8 (C-7), 48,0 (C-8), 19,8 (C-9), 26,8 (C-10), 27,1 (C-11), 33,5 (C-12), 47,0 (C-13), 48,0 (C-14), 46,2 (C-15), 80,8 (C-16), 171,2 (CH3COO), 22,0 (CH3COO), 58,1 (C-17), 19,5 (C-18), 30,4 (C-19), 34,7 (C-20), 19,1 (C-21), 33,7 (C-22), 28,5 (C-23), 79,6 (C-24), 73,2 (C-25), 26,6 (C-26), 26,4 (C-27), 26,2 (C-28), 15,8 (C-29), 20,3 (C-30), 105,1 (C1), 82,2 (C-2), 77,1 (C-3), 81,6 (C-4), 76,5 (C-5), 62,6 (C-6), 106,0 (C-1), 77,6 (C-2), 78,6 (C-3), 72,2 (C-4), 78,7 (C-5), 63,3 (C-6), 105,4 (C-1‴), 75,3 (C-2‴), 78,3 (C-3‴), 71,9 (C-4‴), 78,9 (C-5‴), 62,7 (C-6‴) 3.3.12 Hợp chất AP12: Anopanin C (Chất mới) Chất bột trắng; mp: 218–219oC; [ ]22 +66,7 (c 0,1, MeOH); IR D -1 (KBr) max (cm ): 3428, 2932, 1709, 1630, 1456, 1381, 1261, 1072, 1028; HRESIMS: m/z 1025,5293 [M + Na]+ (tính tốn cho C50H82O20Na, 1025,5297); CTPT C50H82O20; 1H-NMR (600 MHz, 10 C5D5N) H (ppm): 1,07 (H-1a), 1,42 (H-1b), 1,84 (m, H-2a), 2,27 (m, H-2b), 3,38 (dd, J = 11,4, 4,2 Hz, H-3), 1,25 (H-5), 0,68 (q, J = 12,6 Hz, H-6a), 1,51 (H-6b), 1,01 (H-7a), 1,23 (H-7b), 1,52 (H-8), 1,04 (H-11a), 1,92 (H-11b), 1,62 (H-12a), 1,66 (H-12b), 1,48 (H-15a), 2,01 (m, H-15b), 5,33 (dd, J = 7,8, 7,2 Hz, H-16), 2,21 (s, CH3COO), 2,51 (dd, J = 10,8, 6,0 Hz, H-17), 1,03 (s, H-18), 0,20 (d, J = 3,6 Hz, H-19a), 0,46 (d, J = 3,6 Hz, H-19b), 1,68 (m, H-20), 1,21 (d, J = 6,6 Hz, H-21), 4,19 (m, H-22), 2,10 (m, H-23a), 2,29 (m, H-23b), 4,28 (H-24), 6,41 (d, J = 4,8 Hz, 24-OH), 1,31 (s, H-26), 1,53 (s, H-27), 1,30 (s, H-28), 1,14 (s, H-29), 1,06 (s, H-30), 4,86 (d, J = 7,8 Hz, H1), 4,29 (H-2), 4,30 (H-3), 4,25 (H-4), 3,83 (ddd, J = 9,6, 3,6, 3,0 Hz, H-5), 4,48 (H-6a), 4,53 (H-6b), 5,42 (d, J = 7,2 Hz, H-1), 4,10 (H-2), 4,23 (H-3), 4,35 (H-4), 3,94 (ddd, J = 9,6, 3,6, 3,6 Hz, H-5), 4,46 (H-6a), 4,51 (H-6b), 5,16 (d, J = 8,4 Hz, H-1‴), 4,09 (H-2‴), 4,25 (H-3‴), 4,24 (H-4‴), 4,00 (m, H-5‴), 4,32 (H-6‴a), 4,50 (H-6‴b); C-NMR (150 MHz, C5D5N) C (ppm): 32,5 (C-1), 13 30,3 (C-2), 89,4 (C-3), 41,7 (C-4), 48,2 (C-5), 21,5 (C-6), 26,7 (C-7), 48,0 (C-8), 19,8 (C-9), 26,8 (C-10), 27,1 (C-11), 33,5 (C-12), 47,1 (C-13), 48,0 (C-14), 46,2 (C-15), 80,3 (C-16), 171,0 (CH3COO), 22,1 (CH3COO), 56,2 (C-17), 19,4 (C-18), 30,4 (C-19), 38,3 (C-20), 12,8 (C-21), 76,3 (C-22), 39,6 (C-23), 78,3 (C-24), 82,8 (C-25), 27,1 (C26), 24,2 (C-27), 26,2 (C-28), 15,8 (C-29), 20,2 (C-30), 105,1 (C-1), 82,2 (C-2), 77,1 (C-3), 81,6 (C-4), 76,5 (C-5), 62,6 (C-6), 105,9 (C-1), 77,6 (C-2), 78,6 (C-3), 72,2 (C-4), 78,7 (C-5), 63,3 (C6), 105,4 (C-1‴), 75,3 (C-2‴), 78,3 (C-3‴), 71,9 (C-4‴), 78,9 (C5‴), 62,7 (C-6‴) 3.3.13 Hợp chất AP13: Sargentol Chất bột màu trắng; [ ]20D –70 (c 0,05, MeOH), mp 271–272oC, UV 11 (MeOH) λmax (nm): 207, 273; IR (KBr) νmax (cm-1): 3387, 1597, 1504, 1466, 1234, 1072; ESIMS: m/z 325 [M–H–2OCH3]-; CTPT C17H24O10, M = 388; 1H 13C-NMR: xem Bảng 4.17 Phụ lục 13 3.3.14 Hợp chất AP14: 4-O-β-D-Glucopyranosyl-3-prenylbenzoic acid Chất bột màu trắng; UV (MeOH) λmax (nm): 250, 205; IR (KBr) νmax (cm-1): 3379, 2916, 1694, 1605, 1504, 1250, 1084, 1042; HRESIMS: m/z 391,1398 [M + Na]+ (tính tốn lý thuyết cho công thức C18H24O8Na, 391,1369); CTPT C18H24O8, M = 368; 1H 13CNMR: xem Bảng 4.18 Phụ lục 14 3.3.15 Hợp chất AP15: Inugalactolipid A Chất bột màu trắng; HRESIMS: m/z 937,5842 [M + Na]+ (tính tốn lý thuyết cho công thức C49H86O15Na, 937,5864); CTPT C49H86O15; M = 914; 1H 13C-NMR: xem Bảng 4.19 Phụ lục 15 3.3.16 Hợp chất AP16: Gingerglycolipid A Chất bột màu trắng; [ ]22 +35,7 (c 0,1, MeOH); HRESIMS: m/z D + 763,3423 [M+Na+4xO] (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C33H56O18Na, 763,3364); CTPT C33H56O14; M = 676; 1H 13 C- NMR: xem Bảng 4.20 Phụ lục 16 3.3.17 Hợp chất AP17: Gingerglycolipid B Chất bột màu trắng; [ ]22 +57,0 (c 0,1, MeOH); HRESIMS: m/z D + 701,3721 [M+Na] (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C33H58NaO14, 701,3724); CTPT C33H58O14; M = 678; 1H 13 C-NMR: xem Bảng 4.21 Phụ lục 17 3.3.18 Hợp chất AP18: Gingerglycolipid C Chất bột màu trắng; [ ]22 +29,4 (c 0,1, MeOH); HRESIMS: m/z D 703,3878 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho công thức C33H60NaO14, 703,3881); CTPT C33H60O14; M = 680; 1H 12 13 C-NMR: xem Bảng 4.22 Phụ lục 18 3.3.19 Hợp chất AP19: (2S)-1-O-Palmitoyl-3-O-[-D- galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]glycerol Chất bột màu trắng; [ ]22 +51,6 (c 0,1, MeOH); HRESIMS: m/z D + 677,3746 [M+Na] (tính tốn lý thuyết cho công thức C31H58O14Na, 677,3724); CTPT C31H58O14; M = 654; 1H 13 C-NMR: xem Bảng 4.23 Phụ lục 19 3.3.20 Hợp chất AP20: (2R)-1-O-Palmitoyl-3-O-α-D-(6- sulfoquinovopyranosyl)glycerol Chất bột màu trắng; IR (KBr) νmax (cm-1): 3418, 2932, 2367, 1713, 1383, 1265, 1070; HRESIMS: m/z 579,2797 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho công thức C25H48O11SNa, 579,2815); CTPT C25H48O11; M = 556; 1H 13C-NMR: xem Bảng 4.24 Phụ lục 20 3.4 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư số chất tinh khiết Hoạt tính gây độc tế bào in vitro hợp chất tinh khiết từ Tốc thằng cáng thử nghiệm dòng tế bào LU-1, Hep-G2, HL-60, KB, LNCaP, MKN-7, SW-480 MCF-7 Kết trình bày Bảng 3.1 13 Bảng 3.1 Hoạt tính gây độc hợp chất phân lập dòng tế bào ung thư khác Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập Bằng cách kết hợp phương pháp sắc ký, tổng cộng 20 hợp chất phân lập từ lồi Anodendron paniculatum Trong có chất mới, 14 chất lần phân lập từ chi Anodendron Các hợp chất phân lập thống kê bảng 4.25 Dưới trình bày chi tiết trình xác định cấu trúc hóa học hợp chất AP10 Hợp chất AP10 tách dạng bột trắng Phổ HRESIMS hợp chất píc ion giả phân tử m/z 1025,5294 [M+Na]+ (tính tốn cho cơng thức C50H82O20Na 1025,5297) Kết hợp với phân tích phổ NMR, CTPT hợp chất AP10 xác định C50H82O20 Phổ IR dải hấp thụ mạnh ứng với nhóm carbonyl (1713 cm-1), liên kết đôi (1632 cm-1), ether (1010, 1070 cm-1) hydroxyl (3418 cm-1) Phổ 1H-NMR AP10 C5D5N cho thấy tín hiệu đặc 14 trưng nhóm methyl singlet δH 1,13 (H3-29), 1,25 (H3-30), 1,30 (H3-28), 1,57 (H3-18), 1,66 (H3-27), 1,67 (H3-26) 1,69 (H321); nhóm acetoxy δH 2,06 (3H, s); proton anomer δH 4,86 (1H, d, J = 7,2 Hz), 5,16 (1H, d, J = 7,8 Hz) 5,41 (1H, d, J = 7,8 Hz) đề nghị có mặt ba đơn vị đường với cấu hình  Ngồi ra, hai proton methylene nhóm cyclopropyl δH 0,22 (1H, d, J = 4,2 Hz, H-19a) 0,49 (1H, d, J = 4,2 Hz, H-19b) ghi nhận Phân tích phổ 13 C-NMR, DEPT HMQC 50 tín hiệu 30 tín hiệu carbon gán cho hợp phần aglycone, 18 tín hiệu thuộc đơn vị đường hexose tín hiệu đặc trưng nhóm acetoxy (δC 171,2 22,0) Các kiện phổ NMR gợi ý hợp phần aglycone sở hữu khung cycloartane với carbon olefin liên kết đôi ba lần (δC 125,1 132,5), nhóm oxymethine (δC 77,2, 79,0 89,4), carbon bậc ba mang oxy (δC 76,7), nhóm methyl (δC 15,8, 18,6, 20,7, 21,2, 21,7, 26,2 26,4) Việc gán ghép đầy đủ cho tất proton carbon thực qua phân tích chi tiết phổ HMQC, HMBC COSY Cụ thể, tương tác HMBC H3-28 (δH 1,30)/H3-29 (δH 1,13) C-3 (δC 89,4)/C-4 (δC 41,7)/C-5 (δC 48,1) xác nhận vị trí nhóm oxymethine (C-3) nhóm gemdimethyl C-4 cấu trúc vòng A Tương tự, tương tác HMBC H3-21 (δH 1,69) C-17 (δC 56,5)/C-20 (δC 76,7)/C-22 (δC 79,0), H3-26 (δH 1,67)/H3-27 (δH 1,66) C-24 (δC 125,1)/C25 (δC 132,5) giúp thiết lập vị trí hai nhóm hydroxyl C-20, C22 liên kết đơi C-24/C-25 mạch nhánh Hơn nữa, nhóm acetoxy C-16 (δC 77,2) xác nhận thông qua tương tác HMBC H-16 (δH 6,20) carbon nhóm carboxyl δC 171,2 (Hình 4.33) Từ kiện cấu trúc phần aglycone 15 xác định 16-acetoxy-3,20,22-trihydroxycycloart-24-ene Hóa lập thể hợp phần aglycone AP10 thiết lập chủ yếu dựa vào liệu phổ ROESY phân tích số tương tác J Theo đó, tương tác ROESY H-3 (δH 3,38) với H-1 (δH 1,43)/H-5 (δH 1,26)/H3-28, H-2 (δH 1,84) H3-29 đề nghị định hướng  cho H-3, H-5 H3-28 cấu dạng ghế vòng A (Hình 4.34) Thêm vào đó, giá trị J (11,4 4,2 Hz) H-3 H-2 (δH 1,84, 2,27) đặc trưng cho H-3/axial triterpenoid khung cycloartane Tương tác ROESY H-16 H3-18/H-22 (δH 3,92), H-17 (δH 3,19) H3-30 (δH 1,25) vắng mặt tương tác H-16 H3-30 (δH 1,25) chứng tỏ định hướng của nhóm 16-OAc H-17 Cấu hình tuyệt đối C-20 xác định R dựa vào tương tác ROESY H3-21 H-12 (δH 1,91)/H-17, 20-OH (δH 5,61) H-16/H3-18 vắng mặt tương tác H3-21 H3-18, 20-OH H-17 Lập luận củng cố thông qua việc so sánh độ chuyển dịch hóa học C-21 (δC 21,7) với giá trị tương ứng đồng phân lập thể 5-cholestane-3,20,22-triol [δC-21: 21,1 (20R,22R), 21,9 (20R,22S), 23,8 (20S,22S), 24,2 (20S,22R)] Cấu hình tuyệt đối C-22 xác định S cách so sánh giá trị δC C-20 C-22 AP10 với dạng 20R,22R 20R,22S (trong C5D5N) số chất có cấu trúc tương tự Trên phổ 13 C-NMR hợp chất có cấu hình 20R,22R cholestane-3β,20R,22R-triol, vitexirone, frondoside A7-3, frondoside A7-4 stachysterone C, giá trị C C-20 C-22 gần (C < 0,4 ppm) Trái lại, giá trị C khác khoảng ppm cấu hình 20R,22S Giá trị C C-20 C-22 phổ 13C-NMR AP10 76,7 79,0 ppm cho phép đề nghị cấu hình 20R,22S AP10 Điều 16 củng cố nhờ tương tác ROESY 22-OH (δH 5,64) với H321/H-23 (δH 2,58), H-22 với H-16 khuyết tương tác 22-OH với H-16/20-OH/H-23β (δH 2,93) Thành phần monosaccharide hợp chất AP10 xác định D-glucose theo phương pháp mô tả mục 2.2.2 Theo đó, sắc ký đồ GC-MS cho píc với tR 26,65 phút trùng với dẫn xuất alditol hexaacetate D-glucose chuẩn (Sigma-Aldrich) Kết luận củng cố nhờ vào tương đồng giá trị phổ 13C-NMR phần đường với giá trị tương ứng hợp chất shatavarin IX [3-O-{[-D-glucopyranosyl(1→2)][-D-glucopyranosyl(1→4)]--Dglucopyranosyl}-(25S)-5-spirostan-3-ol] Hơn nữa, tương tác HMBC từ H-1 (δH 5,41) đến C-2 (δC 82,2), từ H-1′′′ (δH 5,16) đến C-4 (δC 81,6) cho phép thiết lập trật tự liên kết đơn vị đường [β-D-glucopyranosyl(1→2)][β-D-glucopyranosyl(1→4)]-β-D- glucopyranosyl Ngoài ra, tương tác HMBC H-1′ (δH 4,86) với C-3 (δC 89,4) H-3 (δH 3,38) với C-1′ (δC 105,1) khẳng định vị trí phần đường C-3 khung cycloartane Từ chứng trên, cấu trúc hóa học hợp chất AP10 thiết lập dihydroxycycloart-24-ene (3,16,20R,22S)-16-acetoxy-20,223-O-[-D-glucopyranosyl-(1→2)][-D- glucopyranosyl-(1→4)]--D-glucopyranoside (Hình 4.32) Đây saponin mới, đặt tên anopanin A 17 Hình 4.32 Cấu trúc hóa học hợp chất AP10 Hình 4.33 Tương tác HMBC COSY hợp chất AP10 Hình 4.34 Tương tác ROESY hợp chất AP10 18 Bảng 4.11 Số liệu phổ NMR phần aglycone hợp chất AP10 C 10 11 12 13 14 15 δCa, b 32,5 30,3 89,4 41,7 48,1 21,5 26,9 47,9 19,6 26,8 27,5 34,2 48,2 48,2 46,2 DEPT CH2 CH2 CH C CH CH2 CH2 CH C C CH2 CH2 C C CH2 16 16-OAc 17 18 19 77,2 171,2 22,0 56,5 21,2 30,7 CH C CH3 CH CH3 CH2 20 20-OH 21 22 22-OH 23 24 25 26 27 28 29 30 76,7 – 21,7 79,0# – 31,0 125,1 132,5 26,4 18,6 26,2 15,8 20,7 C – CH3 CH – CH2 CH C CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 δHa, c (J, Hz) 1,10 m; 1,43 m 1,84 m; 2,27 m 3,38 dd (11,4; 4,2) – 1,26* 0,68 q (12,6); 1,51* 1,07*; 1,23* 1,52* – 1,12*; 2,06* 1,91*; 1,92* – – 1,62 br.d (13,8) 2,17 dd (14,4; 8,4) 6,20 dd (7,8; 7,2) – 2,06 s 3,19 d (6,6) 1,57 s 0,22 d (4,2) 0,49 d (4,2) – 5,61 s 1,69 s 3,92* 5,64* 2,58 m; 2,93 m 5,65* – 1,67 s 1,66 s 1,30 s 1,13 s 1,25 s HMBC (H→C) 2, 5, 10 11, 13, 14, 18 13, 14, 16, 30 13, 14, CH3COOCH3COO13, 14, 16 12, 13, 14, 17 1, 11 10, 11 17, 20 17, 20, 22 17, 23, 24 26, 27 24, 25, 27 24, 25, 26 3, 4, 29 3, 4, 5, 28 8, 13, 14, 15 đo C5D5N, b150 MHz, c600 MHz, *tín hiệu chập; #tín hiệu không xuất phổ 13CNMR a 19 Bảng 4.12 Số liệu phổ NMR phần đường hợp chất AP10 C δCa,b DEPT δHa,c (J, Hz) HMBC (HC) 3-Glc 1′ 105,1 CH 4,86 d (7,2) * 2′ 82,2 CH 4,29 3′ 77,1 CH 4,30* 4′ 81,6 CH 4,25* 5′ 76,5 CH 3,83 m 6′ 62,6 CH2 4,49*; 4,53* 2-Glc 1′′ 106,0 CH 5,41 d (7,8) 2, 2′′ 2′′ 77,6 CH 4,10* 3′′ 78,6 CH 4,23* 4′′ 72,4 CH 4,32* 5′′ 78,7 CH 3,93* 6′′ 63,3 CH2 4,48*; 4,52* 4-Glc 1′′′ 105,4 CH 5,16 d (7,8) 4 2′′′ 75,3 CH 4,09* 3′′′ 78,4 CH 4,25* 4′′′ 71,9 CH 4,24* 5′′′ 78,9 CH 4,00 m 6′′′ 62,7 CH2 4,31*; 4,54* ađo C5D5N, b150 MHz, c600 MHz, glc: -D-glucopyranosyl, *tín hiệu chập 4.2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro hợp chất tinh khiết Hoạt tính gây độc tế bào in vitro 17/20 hợp chất tinh khiết phân lập thử nghiệm trước với hai dòng tế bào LU-1 MKN-7 Việc lựa chọn hai dòng tế bào dựa kết sàng lọc sơ cao chiết MeOH Những hợp chất cịn lại lượng mẫu khơng đủ (AP1, AP2) cấu trúc quen thuộc nghiên cứu nhiều (AP6) nên không đưa vào thử nghiệm Các saponin (AP10–AP12) ưu tiên thử nhiều dòng tế bào nhằm phát 20 hoạt tính chúng Trong khi, glycolipid có cấu trúc tương tự (AP16–AP19) thử dòng tế bào ung thư (LU-1, Hep-G2, KB, MKN-7, SW-480) nhằm nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư lớp chất glycolipid Kết thử nghiệm trình bày bảng 3.1 Kết thu cho thấy hợp chất desmosterol (AP4) có tác dụng ức chế mức trung bình với dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 khoảng 28,11±1,95 đến 41,41±2,31 µg/mL Hợp chất ursolic acid (AP5) thể hoạt tính ức chế trung bình với hai dòng tế bào LU-1, MKN-7 với giá trị IC50 44,37±5,40, 30,89±3,60 µg/mL Trong đó, hợp chất (2R)1-O-palmitoyl-3-O-α-D-(6-sulfoquinovopyranosyl)glycerol (AP20) cho tác dụng yếu hai dịng tế bào (IC50: 66,66±5,85 µg/mL dịng tế bào LU-1; 72,42±8,05 µg/mL dịng tế bào MKN-7) Các hợp chất cịn lại khơng thể hoạt tính với giá trị IC50 > 100 µg/mL KẾT LUẬN Sau trình thực hiện, đề tài đạt hai mục tiêu đề ra, cụ thể: Thành phần hóa học Từ phần mặt đất lồi Anodendron paniculatum, 20 hợp chất phân lập xác định cấu trúc hóa học Trong có hợp chất mới, 14 hợp chất lần phân lập từ chi Anodendron  Bốn hợp chất bao gồm: anopaniester, anopanin A–C  Mười bốn hợp chất lần phân lập từ chi Anodendron bao gồm: cycloartenol, (E)-phytol, desmosterol, esculentic acid, kaempferol-3-O-rutinoside, rutin, sargentol, 3-prenyl4-O-β-D-glucopyranosybenzoic acid, 21 inugalactolipid A, gingerglycolipid A–C, (2S)-1-O-palmitoyl-3-O-[-D- galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]glycerol, (2R)-1-Opalmitoyl-3-O-α-D-(6-sulfoquinovopyranosyl)glycerol  Hai hợp chất biết lại ursolic acid vanillin Hoạt tính sinh học  17/20 hợp chất phân lập thử nghiệm hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư (LU-1, MKN-7, Hep-G2, KB, SW-480, HL-60, LNCaP, MCF-7)  Desmosterol có tác dụng ức chế mức trung bình với dịng tế bào LU-1, MKN-7, Hep-G2, KB, SW-480 với giá trị IC50 khoảng 28,11±1,95 đến 41,41±2,31 µg/mL  Ursolic acid thể hoạt tính ức chế trung bình với dịng tế bào LU-1 MKN-7 với giá trị IC50 44,37±5,40, 30,89±3,60 µg/mL  (2R)-1-O-palmitoyl-3-O-α-D-(6-sulfoquinovopyranosyl)glycerol cho tác dụng yếu hai dòng tế bào LU-1 MKN-7 với giá trị IC50 66,66±5,85 µg/mL, 72,42±8,05 µg/mL KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi Anodendron paniculatum Việt Nam, kiến nghị: - Cần tiếp tục tìm kiếm chất có hoạt tính kháng ung thư từ phân đoạn khác loài - Đối với hợp chất phân lập, cần nghiên cứu thêm hoạt tính sinh học khác, góp phần tạo sản phẩm phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng 22 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Duc Viet Ho, Hanh Nhu Thi Hoang, Hung Quoc Vo, Hien Minh Nguyen, Ain Raal, Hoai Thi Nguyen (2018), A new triterpene ester and other chemical constituents from the aerial parts of Anodendron paniculatum and their cytotoxic activity, Journal of Asian Natural Products Research, 20 (2), 188-194 Viet Duc Ho, Thi Nhu Hanh Hoang, Quoc Hung Vo, Van Kiem Phan, Tuan Anh Le, Viet Ty Pham, Minh Hien Nguyen, Takeshi Kodama, Takuya Ito, Hiroyuki Morita, Ain Raal, Thi Hoai Nguyen (2017), Cycloartane-type triterpene glycosides anopanins A–C with monoacyldigalactosylglycerols from Anodendron paniculatum, Phytochemistry, 144, 113-118 Hoang Thi Nhu Hanh, Ho Viet Duc, Tran Thi Thuy Linh, Vo Quoc Hung, Nguyen Thi Hoai (2016), Flavonoid and phenylpropanoid glycoside compounds isolated from Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC., Vietnam Journal of Medicinal Materials, 21 (5), 304-309 Hoang Thi Nhu Hanh, Vu Duc Canh, Ho Viet Duc, Nguyen Thi Hoai (2017), Triterpene and sterol compounds isolated from Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC., Hue University Journal of Science: Natural Science, 126 (1B), 155-163 Hoàng Thị Như Hạnh, Hồ Việt Đức, Phạm Việt Tý, Nguyễn Thị Hồng Anh, Nguyễn Chí Bảo, Nguyễn Thị Hoài (2017), Các hợp chất glycoglycerolipid dẫn xuất prenylbenzoic acid từ Tốc thằng cáng, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Đại học Khoa học Huế, 10 (1), 85-96 23 ... cáng (Anodendron paniculatum (Wall ex Roxb. ) A. DC .)? ?? đề xuất với mục tiêu: Nghiên cứu để làm rõ thành phần h? ?a học loài Anodendron paniculatum (Roxb. ) A. DC Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung. .. ( 3) ( 4) ( 5) ( 6) Pha tĩnh Silica gel Silica gel Silica gel YMC RP-18 Silica gel Silica gel Pha động Gradient CHCl3–MeOH (100:00:100, v/v) Gradient n-hexan–acetone (100:04:1, v/v) n-hexan–EtOAc... the aerial parts of Anodendron paniculatum and their cytotoxic activity, Journal of Asian Natural Products Research, 20 ( 2), 188-194 Viet Duc Ho, Thi Nhu Hanh Hoang, Quoc Hung Vo, Van Kiem Phan,