Nghiên cứu chiết xuất và phân lập một số flavonolignan từ hạt cúc gai (silybum marianum (l ) gaertn )

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Nghiên cứu chiết xuất và phân lập một số flavonolignan từ hạt cúc gai (Silybum marianum (L.) Gaertn.) Mã số: Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Ngơ Thị Thanh Diệp Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2019 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Nghiên cứu chiết xuất và phân lập một số flavonolignan từ hạt cúc gai (Silybum marianum (L.) Gaertn.) Mã số: Chủ nhiệm đề tài: Ngô Thị Thanh Diệp Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2019 Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu đề tài đơn vị phối hợp chính: PGS.TS Ngơ Thị Thanh Diệp, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM; ThS La Hoàng Anh, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM; Hà Quốc Huấn, Sinh viên lớp D2015; Tạ Công Minh Huy, Sinh viên lớp D2015; MỤC LỤC Trang Bìa Bìa phụ Danh sách thành viên tham gia đề tài Mục lục Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục hình, sơ đờ Danh mục bảng CHƯƠNG Mở đầu CHƯƠNG Đối tượng phương pháp nghiên cứu 11 2.1 Đối tượng nghiên cứu 11 2.2 Phương pháp nghiên cứu 12 CHƯƠNG Kết quả nghiên cứu 17 3.1 Phân lập tinh chế 17 3.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 28 CHƯƠNG Kết luận đề nghị 36 Tài liệu tham khảo 37 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu cao UV – Vis (Ultraviolet – Visible): Tử ngoại – Khả kiến TB: Trung bình SD (Standard deviation): Độ lệch chuẩn RSD (Relative standard deviation): Độ lệch chuẩn tương đối EtOH: Ethanol MeOH: Methanol EtOAc: Ethyl acetat d Doublet Đỉnh đôi* DMSO Dimethyl sulfoxid J Hằng số ghép* MHz Mega Hertz* MS Mass Spectroscopy Khối phổ NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân* PDA Photodiode array Dãy diod quang Rf Hệ số lưu Rs Độ phân giải Δ Chemical shift Độ chuyển dịch hóa học* *: Được sử dụng phổ NMR DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ Sơ đồ chiết xuất dược liệu hạt Cúc gai 13 Hình Kết quả thăm dị pha động hệ 17 Hình Sắc ký đờ phân đoạn chứa SA 19 Hình Sắc ký đờ phân đoạn chứa NS 20 Hình Sắc ký đờ khảo sát tách NS phân đoạn XII HPLC 20 Hình Sắc ký đờ tồn phân đoạn chứa NS máy HPLC điều chế 21 Hình Sắc ký lớp mỏng SA hệ dung mơi 22 Hình Sắc ký lớp mỏng NS hệ dung môi 22 Hình Sắc ký đờ (HPLC) SA 23 Hình Phổ hấp thu UV pic hỗn hợp SA 23 Hình 10 Sắc ký đờ 3D SA 24 Hình.11 Độ tinh khiết pic hỗn hợp SA 24 Hình 12 Sắc ký đờ (HPLC) chuẩn Silybin -VKN 25 Hình 13 Phổ hấp thu UV chuẩn Silybin - VKN 25 Hình 14 Sắc ký đờ 3D chuẩn Silybin - VKN 26 Hình 15 Sắc ký đờ (HPLC) NS 26 Hình 16 Phổ hấp thu UV NS 27 Hình 17 Sắc ký đờ 3D NS 27 Hình 18 Độ tinh khiết pic NS 27 Hình 19 Phổ IR Silybin chuẩn VKN 28 Hình 20 Phổ IR SA 29 Hình 21 Phổ IR NS 29 Hình 22 Phổ MS NS 30 Hình 23 Kết quả tính số khối NS máy đo MS 30 Hình 24 Phổ 13C (125 MHz) NS 31 Hình 25 Phổ 1H (500 MHz) NS 31 Hình 26 Phổ HMBC NS 32 Hình 27 Phổ HSQC NS 33 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng Kết quả tách phân đoạn từ cao khơ tồn phần SKC 18 Bảng Kết quả tính % diện tích pic pic hỗn hợp SA HPLC 25 Bảng Kết quả tính % diện tích pic pic hỗn hợp chuẩn Silybin 26 VKN HPLC Bảng Kết quả tính % diện tích pic NS 28 Bảng Bảng so sánh liệu phổ 13C (125 MHz) phổ 1H (500 34 MHz) NS so với Silychristin CHƯƠNG MỞ ĐẦU Từ thời xa xưa người biết dựa vào thiên nhiên để tờn phát triển, có việc bảo vệ sức khỏe Tổ tiên chúng ta biết sử dụng loại cỏ có sẵn tự nhiên để chống lại bệnh tật Những kỷ gần đây, nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu loại dược liệu để tìm thêm chứng khoa học, đờng thời tìm phương pháp sử dụng mới kết hợp Đông - Tây y mang lại hiệu quả điều trị tốt Trong thể, gan đóng vai trị máy chuyển hóa chất Một chức gan tham gia trình giải độc chất nội sinh ngoại sinh Trong trường hợp bệnh lý tải chất độc gan, tế bào gan bị hủy hoại làm tổn thương gan, tổn thương không hồi phục dẫn đến xơ gan, ung thư gan Bệnh gan chiếm tỉ lệ lớn cộng đờng, viêm gan siêu vi bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất giới Khoảng tỷ người giới nhiễm virus viêm gan B, tập trung châu Á châu Phi Theo Tổ chức Y tế giới, viêm gan B 10 nguyên nhân gây tử vong hàng đầu Việt Nam nước có tỉ lệ nhiễm viêm gan B cao Người bị viêm gan mãn tính có nguy ung thư gan cao gấp 20 lần so với người bình thường 40 % số tử vong ung thư gan Cúc gai (Silybum marianum (L.) Gaertn.) loại dược liệu có ng̀n gốc từ Địa Trung Hải, di thực vào nước ta trồng phát triển tốt nơi có khí hậu mát mẻ Sapa, Lào Cai, Tam Đảo Thành phần hóa học Cúc gai chứa flavonolignan, đặc biệt silymarin, chứng minh có tác dụng tốt điều trị bệnh gan in vitro in vivo Cúc gai sử dụng rộng rãi phương thuốc dân gian điều trị bệnh hiểm nghèo gan, thận phổ biến nước ta Bên cạnh đó, loại thực phẩm chức từ Cúc gai bắt đầu xuất thị trường với tác dụng hỗ trợ điều trị trường hợp bệnh gan xơ gan, viêm gan siêu vi, Việc tiêu chuẩn hóa dược liệu Cúc gai tạo ng̀n ngun liệu cho sản xuất chế phẩm thuốc điều trị bệnh gan thận, đồng thời kiểm tra chất lượng chế phẩm có ng̀n gốc từ Cúc gai lưu hành thị trường, góp phần nâng cao sức khỏe người dân vấn đề quan tâm rất cấp thiết Trong vòng nửa kỷ qua, nhà khoa học thành cơng việc xác định hoạt chất có cúc gai, đáng chú ý nhất nhóm hợp chất chiết xuất từ hạt cúc gai có tên silymarin gờm flavonolignan (chiếm khoảng 70-80% hoạt chất hạt cúc gai) Tuy tác dụng cúc gai chế phẩm từ cúc gai chứng minh sử dụng phổ biến Để xây dựng tiêu chuẩn đại cho phép đánh giá chất lượng dược liệu hạt Cúc gai chế phẩm từ hạt Cúc gai, thành phần hoạt flavonolignan, điều quan trọng phải có chất đối chiếu Do đó, chúng tiến hành đề tài “Nghiên cứu chiết xuất phân lập số flavonolignan từ cúc gai (Silybum marianum (L.) Gaertn.) 10 Hình 18 Sắc ký đồ 3D SA Bảng 0.2 Kết tính % diện tích pic Pic tR (phút) Diện tích pic % Diện tích pic 16,631 1039347 17,33 18,947 2079344 34,66 25,703 1955374 32,60 28,180 924570 15,41 Từ kết quả HPLC cho thấy hỗn hợp SA có chứa đồng phân So sánh với chuẩn Silybin của Viện Kiểm nghiệm thuốc Hình 19 Đợ tinh khiết pic hỗn hợp SA 24 Bảng Kết tính % diện tích pic pic hỗn hợp SA HPLC Pic tR (phút) Diện tích pic % Diện tích pic 16,631 1039347 17,33 18,947 2079344 34,66 25,703 1955374 32,60 28,180 924570 15,41 Từ kết quả HPLC cho thấy hỗn hợp SA có chứa đờng phân So sánh với ch̉n silybin Viện Kiểm nghiệm Hình 20 Sắc ký đồ (HPLC) chuẩn Silybin -VKN Hình 21 Phổ hấp thu UV chuẩn Silybin - VKN 25 Hình 22 Sắc ký đồ 3D chuẩn Silybin - VKN Bảng Kết tính % diện tích pic pic hỗn hợp chuẩn Silybin VKN HPLC Pic tR (phút) Diện tích pic % Diện tích pic 16,594 2708534 49,11 % 18,881 2806160 50,89 % Kết quả từ hình 3.8, 3.9, 3.10, 3.11, 3.12, 3.13, 3.14, bảng 3.2, 3.3 cho thấy SA hỗn hợp Silybin A Silybin B, có lẫn thêm đờng phân Isosilybin A Isosilybin B (dựa vào thời gian lưu tương đối tham khảo DĐVN USP 40) Kiểm tra độ tinh khiết của NS Hình 23 Sắc ký đồ (HPLC) NS 26 Hình 24 Phổ hấp thu UV NS Hình 25 Sắc ký đồ 3D NS Hình 26 Đợ tinh khiết pic NS 27 Bảng Kết tính % diện tích pic NS Pic tR (phút) Diện tích pic % Diện tích pic 7,225 1852773 100 % Kết quả từ hình 15, 16, 17, 18 bảng cho thấy NS tinh khiết kiểm tra HPLC 3.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập Sau kiểm tra độ tinh khiết SKLM, HPLC: - SA đem đo phổ IR, so sánh phổ UV với chuẩn silybin VKN - NS đem đo phổ UV, IR, MS, NMR Xác định cấu trúc SA Phổ UV - Phổ UV SA có đỉnh hấp thu cực đại 288 nm, đồng thời so với phổ chuẩn Silybin Phổ IR Kết quả đo phổ IR Silybin chuẩn, SA trình bày hình 19, 20 Hình 27 Phổ IR Silybin chuẩn 28 Hình 28 Phổ IR SA Khi chồng phổ phần mềm máy IR, thấy hai phổ khớp 78,2 % Theo kết quả HPLC, giải thich điều do SA hỗn hợp có chứa cặp đồng phân Silybin A, B; lẫn cặp đồng phân Isosilybin A, B Xác định cấu trúc NS Phổ UV - Phổ UV NS có đỉnh hấp thu cực đại 288 nm Phổ IR - Kết quả đo phổ IR NS trình bày hình 3.21 Hình 29 Phổ IR NS Phổ IR NS có nhiều đỉnh hấp thu vùng từ 600-900 cm-1 nên NS có nhiều nhân thơm Đỉnh hấp thu vùng 3400 cm-1 đặc trưng cho nhóm –OH phenol Tín hiệu mạnh 1633,7 cm-1 đặc trưng cho nhóm chức ceton Tín hiệu 29 1340 1157 cm-1 đặc trưng cho có mặt liên kết C–O–C cơng thức cấu tạo Phổ MS Hình 30 Phổ MS NS Hình 31 Kết tính số khối NS máy đo MS Trên phổ MS (ES-) NS cho thấy đỉnh m/z: 481,1062 [M-H]-, suy khối lượng phân tử NS 482,12 (g/mol) Phổ NMR của NS Phổ 13C 1H NS thể hình 24, 25, phổ HMBC thể hình 26 30 Hình 24 Phổ 13C (125 MHz) NS Hình 25 Phổ 1H (500 MHz) NS 31 Hình 26 Phổ HMBC NS 32 Hình 27 Phổ HSQC NS 33 Các liệu phổ 13C 1H NS hoàn toàn phù hợp với liệu tương ứng công bố Silychristin DMSO) 13 DMSO) 13 [13] Bảng so sánh liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, C-NMR (125 MHz, DMSO) NS với phổ 1H-NMR (500 MHz, C-NMR (125 MHz, DMSO) Silychristin (Bảng 5) khẳng định điều Bảng Bảng so sánh liệu phổ 13C (125 MHz) và phổ 1H (500 MHz) NS so với Silychristin [13] C (ppm) C δH (ppm), m (J, Hz) HSQC HMBC DEPT NS Silychristin NS 5,00 m CH 83,22 83,2 CH 71,68 71,7 C-IV 197,63 197,5 C-IV 163,24 163,3 CH 95,98 96,1 C-IV 166,77 167,2 CH 94,93 95,0 C-IV 162,48 162,5 10 C-IV 100,39 100,3 1’ C-IV 129,88 129,9 2’ CH 115,59 115,6 3’ C-IV 146,34 146,3 4’ C-IV 140,68 140,7 5’ C-IV 129,00 129,0 4,51 dd Silychristin 4,99 d (11.4) C1’, C2’ 4,51 dd (11.3, 4.8) (11.5, 6) 5,91 d (2.5) 6,81 m C2, C4, C1’ 5,90 d (1.9) (2.5) 5,86 d C3, C4, C5, C7, C10 5,85 d (2.0) 6,83 br s C6, C7 C9, C10 C3’, C6’ 34 6’ CH 115,27 115,3 1’’ C-IV 132,40 132,4 2’’ CH 110,45 110,4 3’’ C-IV 147,51 147,5 4’’ C-IV 147,04 147,0 5’’ CH 115,27 115,3 6’’ CH 118,65 118,7 -O CH3 55,66 55,6 α CH 86,96 87,0 6,87 s 6,87 br s 6,96 d (2) 6,96 d (1.7) 6,76 d (8.1) 6,8 s 6,76 d (8.1) 6,87 dd (8.9, 2.2) 3,75 m, (6.5) C3’’, C6’’ C1’’, C4’’ Cα, C2’’, C5’’ C3’’, C4’’ 3H 5,46 d C2’ C1’’, C2’’, 5,46 d (6,9) C3’’, C6’’, C, Cγ C1’’, C4’,  CH 53,30 53,3 3,47 d (6) 3,47 dd (12.5, 6.4) C5’,C6’, Cα, Cγ γ CH2 62,95 62,9 3,73 m 3,72 m 3,63 dd (10.6, 6.8) Cα Như vậy, từ tính chất vật lý, tính chất hóa học, liệu phổ UV, IR, MS, NMR so sánh với tài liệu tham khảo [16] khẳng định NS Silychristin (C25H22O10 = 482,12) 35 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ - Quá trình phân lập chất từ hạt cúc gai phức tạp hạt Cúc gai chứa hỗn hợp rất nhiều flavonolignan đờng phân, có cấu trúc hóa học tính chất lý hóa gần giống nhau, để phân lập đồng phân tinh khiết phải sử dụng HPLC điều chế, hiệu suất phân lập chưa tốt, khoảng 0,01 % đối với NS 0,027 % đối với SA - Xử lý hạt Cúc gai quy trình chiết khó khăn mẫu có chứa lượng dầu béo rất cao, khoảng 30 % Do đó, trước chiết flavonolignan phải tiến hành loại dầu béo nhiều lần dung môi phân cực petroleum ether, n-hexan - SA phân lập kiểm tra SKLM cho vết nhất hệ dung mơi có độ phân cực khác Tuy nhiên phân tích HPLC cột Knauer C18 (5 àm, 250 mm ì 4,6 mm) thỡ thõy SA hỗn hợp đồng phân: Silybin A, Silybin B, Isosilybin A, Isosilybin B - Trong giới hạn thời gian nghiên cứu phương pháp sắc ký điều chế phân lập 52 mg SA hỗn hợp Silybin A, Silybin B Isosilybin A, Isosilybin B; 19 mg NS Silychristin 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Tập 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr 1129-1130 Nguyễn Thị Quy (2015), “Nghiên cứu kỹ thuật tách chiết Silymarin từ hạt kế sữa acid amin từ đậu tương làm nguyên liệu cho thực phẩm chức tăng cường chức gan”, Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Sinh học, Trường Đại học Thái Nguyên Viện Dược liệu (2006), Nghiên cứu phát triển dược liệu đông dược Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 93 Viện Dược liệu (2010), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Tập III, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 254-270 Võ Văn Chi, Trần Hợp (1999), Cây cỏ có ích Việt Nam, Tập 1, Nhà x́t bản Giáo dục, Hà Nội, tr 47 Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, Tập 1, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr 670-671 TIẾNG ANH Ahlam Elwekeel, Ahlam Elfishawy, Sameh Abouzid (2013), “Silymarin content in Silybum marianum fruits at different maturity stages”, Journal of Medicinal Plants Research, Vol (23), pp 1665-1669 Britist Pharmacopoeia CD-ROM (2013), Milk-thistle Fruit monograph, pp 1860 Dixit Nitin, Baboota Sanjula, Kohli Kanchan, Ahmad S., Ali Javed (2007), “Silymarin: A review of pharmacological aspects and bioavailability enhancement approaches”, Indian Journal of Pharmacology, Vol 39, Issue 4, pp 172-179 10 European Medicines Agency (2015), Assessment report on Silybum marianum (L.) Gaertn., fructus, pp 4-45 37 11 Mahaveer Dhobi, Vivekananda Mandal, Siva Hemalatha (2010), “Optimization of microwave assisted extration of bioactive flavonolignan – silybinin”, Journal of Chemical Metrology 3:1, pp 13-23 12 Minakhmetov R A., Onuchak L A et al (2001), “Analysis of flavonoids in Silybum marianum fruit by HPLC”, Chemistry of natural compounds, 37 (4), pp 318-321 13 Nam-Cheol Kim, Tyler N Graf, Charles M Sparacino, Mansukh C Wani, Monroe E Wall (2003), “Complete isolation and characterization of silybins and isosilybins from milk thistle (Silybum marianum)”, Organic & biomolecular chemistry, (10), pp 1684-1689 14 Nitin Dixit, Sanjula Baboota, Kanchan Kohli, S Ahmad, Javed Ali (2007), “Silymarin: A review of pharmacological aspects and bioavailability enhancement approaches”, Indian Journal of Pharmacology, Vol 39, Issue 4, pp 172-179 15 Peter F Surai (2015), “Silymarin as a natural antioxidant: An overview of the current evidence and perspectives”, Antioxidants, Vol 4, pp 204-247 16 Radjabian T (2008), “Analysis of silymarin components in the seed extracts of some milk thistle ecotypes from Iran by HPLC”, Iranian Journal of Science and Technology, 32 (2), pp 141-146 17 Venketeshwer Rao (2012), Phytochemicals – A global perspective of their role in nutrition and health, Intech, pp 255-268 18 Wen Z., Dumas T E et al (2008), “Pharmacokinetics and metabolic profile of free, conjugated and total silymarin flavonolignans in human plasma after oral administration of milk thistle extract”, Drug metabolism and disposition, 36, pp 65-72 38 ... ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Nghiên cứu chiết xuất và phân lập một số flavonolignan từ hạt cúc gai (Silybum marianum (L. ) Gaertn .) Mã số: Chủ nhiệm đề tài: Ngô Thị Thanh... flavonolignan từ cúc gai (Silybum marianum (L. ) Gaertn .) 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: Các flavonolignan có dược liệu Cúc gai Nguyên... nhất nhóm hợp chất chiết xuất từ hạt cúc gai có tên silymarin gồm flavonolignan (chiếm khoảng 70-80% hoạt chất hạt cúc gai) Tuy tác dụng cúc gai chế phẩm từ cúc gai chứng minh sử dụng phổ