NGHIÊN cứu PHÂN lập một số POLYPHENOL GIÚP CHO VIỆC TIÊU CHUẨN HÓA dược LIỆU ACTISÔ

Cùng với xu hướng phát triển của đất nước, ngành Dược Việt Nam đang trên con đường tìm cho mình một lối đi riêng để không chỉ đáp ứng được nhu cầu trong nước mà còn vươn xa hơn vào thị trường quốc tế. Mặc dù cũng có nhiều bước tiến trong lĩnh vực tổng hợp nguyên liệu làm thuốc, nhưng đa phần các xí nghiệp Dược Việt Nam chủ yếu sản xuất thuốc generic và thuốc nhượng quyền nên đây chưa thể là lợi thế cho chúng ta. Với nguồn dược liệu phong phú, những bài thuốc dân gian lâu đời độc đáo thì phát triển các chế phẩm thuốc từ dược liệu là thế mạnh giúp chúng ta sản xuất được những thuốc hiệu quả, an toàn và kinh tế. Hiện nay, nhiều công ty, xí nghiệp đã và đang thực hiện chiến lược trên nhiều cây thuốc quý, bài thuốc hay đã được chọn để nghiên cứu. Tuy nhiên phần lớn các sản phẩm này chỉ được lưu thông trong nước, chưa thể xuất hiện ở những thị trường lớn như Âu, Mỹ vì bị giới hạn trong vấn đề kiểm soát chất lượng. Do không được tiêu chuẩn hóa và kiểm định nên các cây thuốc và chế phẩm từ dược liệu có chất lượng không ổn định, có khi chứa rất ít hoặc không có chứa hoạt chất. Vì vậy việc tiêu chuẩn hóa là một vấn đề đáng được quan tâm. Việc tiêu chuẩn hóa dược liệu cũng như các chế phẩm từ dược liệu đòi hỏi phải phân lập ra những hoạt chất hoặc chất đánh dấu có trong cây để tiến hành kiểm nghiệm. Đây là một vấn đề khó khăn và phức tạp. Một số nơi cũng đã bước đầu tiến hành phân lập và tinh chế một số chất chuẩn từ dược liệu. Actisô là một cây trồng đã được biết đến từ rất lâu ở vùng Địa Trung Hải và được người Pháp di thực vào Việt Nam. Loại cây này đã trở nên phổ biến ở Việt Nam không chỉ nhờ vào tác dụng trị liệu như lợi mật, chữa ăn không tiêu, giúp ăn ngon miệng, lợi tiểu, hạ lipid máu mà còn được biết đến như một loại rau có thể chế biến nhiều món ăn, nấu nước mát, và là một đặc sản của thành phố Đà Lạt. Một số xí nghiệp trong nước đã có chế phẩm từ Actisô như Chophytol, Artichol, Hepachaut, Hepatonic, Actisamin, viên Actisô… và Cynaraphytol. Hiện nay, việc định lượng hoạt chất trong Actisô chỉ dựa trên những phương pháp đơn giản như định lượng các hợp chất phenol bằng mật độ kế trên các vết sau khi đã tách bằng sắc ký giấy. Với những phương pháp hiện đại ngày nay như quang phổ từ ngoạikhả kiến, quang phổ hồng ngoại, đặc biệt là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao thì chất chuẩn là một yêu cầu hàng đầu. Những chất có tác dụng chính trong cây chủ yếu là các polyphenol đã được xác định như cynarin, các sản phẩm phân huỷ của nó như acid caffeic, acid chlorogenic và các flavonoid, trong đó cynarin là chất có tác dụng quan trọng nhất. Vì vậy, đề tài này được thực hiện nhằm mục tiêu : • Chiết xuất, phân lập luteolin • Chiết xuất, phân lập các polyphenol khác. • Bước đầu nghiên cứu chiết xuất, phân lập cynarin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TÊ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HỒ NGUYỄN CAO NGUYÊN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ POLYPHENOL GIÚP CHO VIỆC TIÊU CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU ACTISÔ (Cynara scolymus L Asteraceae) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Thành phớ Hờ Chí Minh – 2007 BỢ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TÊ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HỒ NGUYỄN CAO NGUYÊN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ POLYPHENOL GIÚP CHO VIỆC TIÊU CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU ACTISÔ (Cynara scolymus L.Asteraceae) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Thầy hướng dẫn: ThS Phạm Đông Phương Thành phố Hồ Chí Minh – 2007 Lời cảm ơn  Em xin gởi đến Thầy ThS.Phạm Đông Phương lòng biết ơn sâu sắc Cảm ơn Thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm, đã lo lắng, quan tâm, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn này  Em rất biết ơn cô ThS Hùynh Ngọc Thụy đã dành thời gian đọc và góp ý để khóa luận của em được hoàn chỉnh  Em xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS Trần Hùng, thầy ThS Võ Văn Lẹo đã dành thời gian quý báu chỉ bảo, hướng dẫn, cung cấp một số tài liệu để em hòan thành luận văn được tốt  Em xin chân thành cảm ơn chị DS.Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, người đã bên cạnh giúp đỡ, dộng viên em những lúc khó khăn Cảm ơn Chị đã dành thời gian, tâm huyết để chỉ dạy cho em nhiều kinh nghiệm quý báu  Em bày tỏ lòng biết ơn đến các Thầy Cô, Anh Chị của bộ môn Dược Liệu đã tạo môi trường, điều kiện làm việc tốt nhất cho em suốt thời gian làm luận văn  Cảm ơn Ba Mẹ, Cậu Mợ và các Cô, là những người đã âm thầm hy sinh, lo lắng, bên cạnh động viên suốt những năm tháng Đại Học  Các bạn Ngọc Anh, Tú, Thanh, Hoa, Yến, Hạnh, Mai, Phượng, Lan, Giang, Thành, Loan, Thơ, các em Monitor, cảm ơn các bạn rất nhiều vì đã chia sẻ cùng mình những vui buồn MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐÊ TỔNG QUAN Tổng quan về thực vật 1.1 Vị trí phân loại của chi Cynara 1.2 Giới thiệu về Actisô Phân bố và cách trồng trọt .6 2.1 Phân bố .6 2.2 Cách trồng Thu hái và chế biến Bộ phận dùng Thành phần hoá học 5.1Hợp chất polyphenol 5.1.1 Acid hữu 5.1.2 Flavonoid .8 5.2 Sesquiterpenlacton 5.3Thành phần khác 11 Tác dụng và công dụng 11 6.1Tác dụng dược lý .11 6.1.1 Tác dụng tăng bài tiết mật 11 6.1.2 Tác dụng chống oxy hóa 12 6.1.3 Tác dụng làm giảm cholesterol 12 6.1.4 Tác dụng lợi tiểu 12 6.1.5 Tác dụng kháng khuẩn .12 6.1.6 Tác dụng khác 12 6.2Công dụng 13 6.2.1 Công dụng y học hiện đại .13 6.2.2 Công dụng y học cổ truyền 13 6.3Một số chế phẩm có Actisô thị trường 13 ĐỘC TÍNH 15 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 Đối tượng nghiên cứu .16 1.1 Nguyên liệu .16 i 1.2 Dung môi hóa chất 16 1.3 Trang thiết bị nghiên cứu 16 Phương pháp nghiên cứu .17 2.1 Nghiên cứu vi học 17 2.1.1 Vi phẫu 17 2.1.2 Soi bột 17 2.2Nghiên cứu hóa học 17 2.2.1 Chiết xuất cao toàn phần từ dược liệu tươi 17 2.2.2 Tách các phân đoạn bằng dung môi 17 2.2.3 Tách các chất bằng sắc ký cột pha thuận 17 2.2.4 Tinh khiết hóa bằng phương pháp kết tinh 17 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18 Nghiên cứu vi học 18 1.1Vi Phẫu .18 1.2Soi bột 19 Nghiên cứu hoá học 20 2.1 Định tính 20 2.1.1 Chiết xuất 20 2.1.2 Định tính hóa học .21 2.1.3 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 21 2.2Chiết xuất và phân lập luteolin 24 2.2.1 Chiết xuất 24 2.2.2 Phân lập luteolin 25 2.3Chiết xuất, phân lập cynarin và các polyphenol khác .34 2.3.1 Chiết xuất 34 2.3.2 Phân lập cynarin và các polyphenol khác 35 KẾT LUẬN VÀ ĐÊ NGHI 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIÊT TẮT Thdm Bz Benzen EtOAc Ethylacetat ace Aceton MeOH Methanol a.for Acid formic CHCl3 Chloroform a.ace Acid acetic n-BuOH n-butanol ButOAc Butylacetat n6 n-hexan TT Thuốc thư VS Vanilin-sulfuric V Thể tích dung môi P Khối lượng SKLM Sắc ký lớp mỏng CHLBĐ Cộng hòa liên bang Đức Thu hồi dung môi SKCCĐ Sắc ký cột cổ điển iii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Trang Bảng 4.1 Định tính hoá học AL, AT .21 Bảng 4.2 Kết quả định tính sắc ký lớp mỏng AL1, AL2 21 Bảng 4.3 Kết quả định tính sắc ký lớp mỏng AL1, AL2 22 Bảng 4.4 Kết quả định tính sắc ký lớp mỏng AL, AL3, AL4, AL5 23 Bảng 4.5 Kết quả phân tích AL, AL3, AL4, AL5 23 Bảng 4.6.Kết quả thăm dò sắc ký lớp mỏng hệ dung môi khai triển cột .25 Bảng 4.7 Kết quả phân lập cột 26 Bảng 4.8.Tóm tắt kết quả phân lập các hợp chất từ cột 29 Bảng 4.9.Kết quả thăm dò sắc ký lớp mỏng hệ dung môi khai triển cột .35 Bảng 4.10.Kết quả phân lập cột 37 Bảng 4.11 Tóm tắt kết quả phân lập các hợp chất từ cột 38 Bảng 4.12 Kết quả thăm dò sắc ký lớp mỏng hệ dung môi lên cột .40 Bảng 4.13 Kết quả thăm dò sắc ký lớp mỏng hệ dung môi lên cột .42 Bảng 5.14 Các chất kết tinh và khối lượng tương ứng 44 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 4.1 Quy trình chiết luteolin 24 Sơ đồ 4.2 Sơ đồ phân bố các phân đoạn của cột 27 Sơ đồ 4.3 Quy trình chiết polyphenol khác 34 Sơ đồ 4.4 Sơ đồ phân bố các phân đoạn của cột 37 iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 2.1 Lá và hoa của Cynara cardunculus L .4 Hình 2.2 Lá và hoa của Cynara humilis L .4 Hình2.3 Lá và hoa của Cynara scolymus L .5 Hình 2.4 Vườn và Actisô Hình 3.5 Dược liệu Actisô 16 Hình 4.6 Vi phẫu lá Actisô 18 Hình 4.7 Các cấu tư của bột Actisô 19 Hình 4.8 Sắc ký đồ so sánh AT và AL 20 Hình 4.9 Sắc ký đồ của nhóm hợp chất thuỷ phân .23 Hình 4.10 Sắc ký đồ của nhóm hợp chất không thuỷ phân 23 Hình 4.11 Sắc ký đồ so sánh AL1, AL2 với luteolin 25 Hình 4.12 Sắc ký đồ hệ dung môi lên cột 26 Hình 4.13 Sắc ký đồ các phân đoạn cột 28 Hình 4.14 Sắc ký đồ các chất kết tinh cột 1, hệ Bz-ace-a.for (7:3:0,05) 29 Hình 4.15 Sắc ký đồ các chất kết tinh cột 1, hệ Bz-EtOAc-a.for (5:3:0,05) 30 Hình 4.16 Sắc ký đồ các chất kết tinh cột 1, hệ CHCl3-EtOAc-a.for (7:3:0,05) 31 Hình 4.17 Sắc ký đồ so sánh các chất kết tinh với luteolin 32 Hình 4.18 Sắc ký đồ so sánh chất K và luteolin, hệ Bz-ace-a.for (7:3:0,05) .32 Hình 4.19 Sắc ký đồ so sánh chất K và luteolin, hệ Bz-EtOAc-a.for (5:3:0,05) 33 Hình 4.20 Sắc ký đồ so sánh chất K và luteolin, hệ CHCl3-EtOAc-a.for (5:5:1) 33 Hình 4.21 Sắc ký đồ so sánh AL4, AL5 với cynarin .35 Hình 4.22 Sắc ký đồ hệ dung môi lên cột 36 Hình 4.23 Sắc ký đồ các phân đoạn cột 38 Hình 4.24 Sắc ký đồ chất kết tinh cột 2, hệ A.ace-a.for-H2O-EtOAc (5:5:10:100) .39 Hình 4.25 Sắc ký đồ chất kết tinh cột 2, hệ EtOAc-a.for (8,5:1,5) 40 Hình 4.26 Sắc ký đồ hệ dung môi lên cột phân đoạn 41 Hình 4.27 Sắc ký đồ hệ dung môi lên cột 42 Hình 4.28 Sắc ký đồ so sánh phân đoạn cột với cynarin 43 v vi vii Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2007 Hồ Nguyễn Cao Nguyên 1.3.2.Nghiên cứu phân lập cynarin và các polyphenol khác Chấm sắc ky AL4, AL5 so với cynarin chuẩn (CHLBĐ) nhận thấy A L4, AL5 đều có vết cùng màu ( màu xanh với thuốc thư FeCl 10%, màu hồng với thuốc thư NaNO 10%+NaOH 10%) và có cùng giá trịRf với cynarin chuẩn, nhiên hàm lượng vết cynarin ở A L4 nhiều nên tiến hành phân lập AL4 TT FeCl3 10% TT NaNO210%+NaOH10% Hình 4.21 Sắc ký đồ so sánh AL4, AL5 với cynarin Thăm dò hệ dung môi lên cột cho AL4 bằng sắc ký lớp mỏng; Kết quả Bảng 4.9 Kết quả thăm dò sắc ky lớp mỏng khai triển sắc ky cột STT Hệ dung môi Khả tách vết Rf (vết cao nhất) CHCl3-EtOAc-a.for (2:8:0,5) vết, kéo đuôi 1/2 CHCl3-EtOAc-a.for (3:7:0,5) vết, kéo đuôi 1/3 MeOH-Ace-H2O (18:1:1) Không tách vết EtOAc-a.for-H2O (8:1:1) Không tách vết EtOAc-MeOH (4:1) Không tách vết EtOAc-Ace (9:1) Không tách vết n-BuOH-EtOAc-a.for (6:2:0,5) vết, kéo đuôi 3/4 EtOAc-a.for (8,5:1,5) vết 2/3 ButOAc-a.for (15:1) vết, kéo đuôi 3/4 10 Bz-EtOAc-a.for (7:3:0,5) Không tách vết 11 n6-EtOAc-a.for (5:4:1) Không tách vết 12 EtOAc-Ace-a.for (30:1:1) Không tách vết 13 ButOAc-Ace-a.for (30:1:1) vết, kéo đuôi 1/3 Ghi chú: Rf là tỉ lệ giữa đường của vết cao nhất và đường của dung môi 35 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2007 Hồ Nguyễn Cao Nguyên Kết quả Chọn hệ dung môi butylacetat-aceton-acid formic (30:1:1) làm hệ khai triển sắc ký cột Dưới UV 365nm phát hiện ít nhất vết, dưới UV 254nm phát hiện ít nhất vết Phun thuốc thư FeCl3 10% phát hiện ít nhất vết Phun thuốc thư NaNO 10%/ cồn sau đó phút phun thuốc thư NaOH 10%/MeOH phát hiện ít nhất vết UV 365 nm UV 254 nm TT FeCl3 10% Hình 4.22 Sắc ký đồ hệ dung môi lên cột Điều kiện tiến hành: Chất mẫu: 15 g AL2 Cợt sắc ký: 4×80 cm, rưa sạch, sấy khô Chất hấp phụ silicagel của Merk cỡ hạt 0.015-0.040 mm, khối lượng 400 g Phương pháp nhồi cột ướt với 1,5l dung môi nền butylacetat, đánh siêu âm phút, sau đó tiến hành nhồi cột Phương pháp nạp mẫu: mẫu được hòa tan với 5ml ethylacetat, lọc và nạp mẫu Tốc độ chảy: 68 giọt/ phút, thể tích hứng 22 ml/ống Dung môi khai triển: Butylacetat-aceton-acid formic (30:1:1) Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi butylacetat-aceton-acid formic (30:2:1), phát hiện bằng cách soi UV 365 nm, UV 254 nm, TT FeCl3 10% Kết quả: Sau khai triển sắc ký cột thu được phân đoạn 36 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2007 Hồ Nguyễn Cao Nguyên Bảng 4.10 Kết quả phân lập cột PĐ ButOAcace-a.for Dung môi P (g) Thành phần các chất V (ml) 342 0.1338 A B1 C1 260 0,3244 B1 C1 D1 E1 238 0.8022 B1 C1 D1 E1 F1 260 1,2726 C1 D1 E1 F1 G1 740 1,5662 D1 E1 F1 G1 H1 2038 3,6547 (30:1:1) G1 H1 K1 Ghi chú: Ký hiệu các chất được sắp xếp theo thứ tự độ phân cực tăng dần từ A1 đến K1 A1 B1 C1 D1 E1 F1 G1 H1 K1 Sơ đồ 4.4 Sơ đồ phân bố các phân đoạn của cột UV 365 nm UV 254 nm 37 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2007 Hồ Nguyễn Cao Nguyên TT NaNO2 10%+ NaOH 10% TT FeCl3 10% Hình 4.23 Sắc ký đồ các phân đoạn cột Nhận xét Sau gộp phân đoạn và cô quay dưới áp suất giảm thu được kết quả sau: Phân đoạn (0.4999 g ) có ít nhất vết polyphenol đó có một vết có hàm lượng lớn, nên hoà tan phân đoạn vào 10ml ethylacetat, dịch lọc để vào tủ lạnh, cho bay dung môi từ từ, lọc, thu được tinh thể màu trắng Tiến hành kiểm tra tinh thể qua hai hệ dung môi acid acetic-acid formic-nước-ethylacetat (5:5:10:100), ethylacetat-acid formic (8,5:1,5) so với AL4 thấy là một hợp chất tinh khiết, đặt tên là chất A1 (16,7 mg) Phân đoạn (1.0930 g), có rất nhiều chất, nhiên sau cô quay bình cầu thấy có kết tinh, nên tiến hành hòa tan kết tinh lại dung môi methanol, cho vào tủ lạnh, để dung môi bay từ từ, lọc và rưa tinh thể bằng dung môi ethylacetat lạnh thu được tinh thể màu trắng Cũng tiến hành kiểm tra và đặt tên là chất P1 (133,5 mg) Chất P1 tan dung môi hữu chloroform, ethylacetat, methanol không phát quang dưới UV, không hiện màu với thuốc thư VS, thuốc thư NaOH 10%/ MeOH, chỉ xuất hiện vết màu hồng dưới thuốc thư FeCl3 10% Phân đoạn (3,6547 g), có ít nhất vết polyphenol đó có một vết có hàm lượng lớn, nên hoà tan phân đoạn vào 15ml methanol, dịch lọc để vào tủ lạnh, cho bay dung môi từ từ, không thấy xuất hiện kết tinh Phân đoạn (1,5662 g) có chứa vết cynarin, cô thu hồi dung môi, tiếp tục nghiên cứu phân lập Bảng 4.11 Tóm tắt kết quả phân lập các hợp chất từ cột Chất tinh khiết Khối lượng (mg) PĐ1 A1 16.7 mg PĐ P1 133.5 mg Q1(kết tinh quá trình chiết xuất AL EtOAc) 125 mg 38 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2007 Hồ Nguyễn Cao Nguyên UV 254 nm UV 365 nm TT NaNO2 10% + NaOH 10% TT FeCl3 10% Hình 4.24 Sắc ký đồ các chất kết tinh cột 2, hệ acid acetic-acid formic-nước-ethylacetat (5:5:10:100) Dưới UV 254 nm Dưới UV 365 nm 39 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2007 Hồ Nguyễn Cao Nguyên TT NaNO2 10% + NaOH 10% TT FeCl3 10% Hình 4.25 Sắc ký đồ các chất kết tinh cột 2, hệ ethylacetat-acid formic (8,5 :1,5) Tiến hành nghiên cứu phân lập phân đoạn Thăm dò hệ dung môi lên cột phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng Kết quả: Bảng 4.12 Kết quả thăm dò hệ dung môi lên cột (với FeCl3) STT Hệ dung môi Khả tách vết ButOAc-ace-a.for (30:2:1) Tách tốt EtOAc-a.for (8:2) Không tách CHCl3-MeOH-H2O (6:2:1) Không tách Rf (vết cao nhất) 1/3 Ghi chú: Rf là tỉ lệ đường của vết cao nhất và đường của dung môi Kết quả Chọn hệ dung môi butylacetat-aceton-acid formic (30:2:1) làm hệ dung môi khai triển sắc ký cột vì khả tách tốt và có Rf thích hợp 40 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2007 UV 254 nm Hồ Nguyễn Cao Nguyên TT FeCl3 10% TT NaNO2 10%+NaOH 10% Hình 4.26 Sắc ký đồ hệ dung môi lên cột Điều kiện tiến hành: Chất mẫu: 1,5 g phân đoạn Cợt sắc ký: 3×40 cm, rưa sạch, sấy khô Chất hấp phụ silicagel của Merk cỡ hạt 0.015-0.040 mm, khối lượng 200 g Phương pháp nhồi cột ướt với 1l dung môi nền butylacetat, đánh siêu âm phút, sau đó tiến hành nhồi cột Phương pháp nạp mẫu: mẫu được hòa tan với 5ml ethylacetat, lọc và nạp mẫu Tốc độ chảy: 90 giọt/ phút, thể tích hứng 22 ml/ống Dung môi khai triển: Butylacetat-aceton-acid formic (30:2:1) Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi Butylacetat-aceton-acid formic (30:2:1), phát hiện bằng cách soi UV 365 nm, UV 254 nm, TT FeCl3 10% Kết quả Sau khai triển sắc ký cột vẫn không tách được cynarin Qua sắc ký đồ hình 4.21 nhận thấy AL5 có vết trùng với cynarin chuẩn nên tiến hành phân lập AL5 Thăm dò hệ dung môi khai triển sắc ký cột 41 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2007 Hồ Nguyễn Cao Nguyên Kết quả Bảng 4.13 Kết quả thăm dò hệ dung môi lên cột STT Hệ dung môi Khả tách vết ButOAc-ace-a.for (30 :2 :1) Không tách EtOAc-MeOH-H2O (7 :3 :2) Không tách n-bu-ace-a.for (6 :4 :1) Không tách A.ace-a.for-H2O-EtOAc (5 :5 :10 :100) Tách tốt A.for-H2O-EtOAc (5 :10 :100) Không tách Rf (vết cao nhất) 1/3 Kết quả Chọn hệ dung môi acid acetic-acid formic-nước-ethylacetat (5 :5 :10 :100) khai triển sắc ký cột vì khả tách tốt và có Rf thích hợp UV 254 nm TT FeCl310% TT NaNO210%+NaOH10% Hình 4.27 Sắc ký đồ hệ dung môi lên cột Điều kiện tiến hành: Chất mẫu: g AL5 Cợt sắc ký: 4×80 cm, rưa sạch, sấy khô Chất hấp phụ silicagel của Merk cỡ hạt 0.015-0.040 mm, khối lượng 300 g Phương pháp nhồi cột ướt với 1,5l dung môi nền ethylacetat, đánh siêu âm phút, sau đó tiến hành nhồi cột Phương pháp nạp mẫu: mẫu được hòa tan với 5ml n-butanol, lọc và nạp mẫu Tốc độ chảy của cột là 90 giọt/ phút, thể tích hứng 10 ml/ống Dung môi khai triển là Butylacetat-aceton-acid formic (30:2:1) Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi acid acetic-acid formic-nướcethylacetat (5 :5 :10 :100), phát hiện bằng cách soi UV 365 nm, UV 254 nm, TT FeCl3 10% 42 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2007 Hồ Nguyễn Cao Nguyên Kết quả Thu được phân đoạn có chứa cynarin UV 254 nm TT FeCl3 10% TT NaNO210%+ NaOH 10% Hình 4.28 Sắc ký đồ so sánh phân đoạn cột với cynarin Vì không còn thời gian nên phân đọan chứa cynarin vẫn chờ kết tinh 43 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2007 Hồ Nguyễn Cao Nguyên CHƯƠNG KÊT LUẬN VÀ ĐỀ NGHI Sau tháng thực hiện đề tài « Nghiên cứu phân lập một số polyphenol giúp cho việc tiêu chuẩn hoá dược liệu Actisô » đã được một số kết quả sau : Từ 20kg lá tươi Actisô thu hái ở khu Thái Phiên, Đà Lạt, ổn định, cắt nhỏ, phơi khô, xay thành bột, chiết ngấm kiệt bằng 30l cồn 96 0, cô quay thu hồi dung môi được 500g cao lỏng Số lượng cao thu được ít và không còn mùa thu hoạch Actisô nên không tiến hành đển phân lập Phân lập luteolin (cột 1) Từ 500g cao AL của Xí nghiệp Dược Lâm Đồng qua thuỷ phân với H 2SO4 1N, lắc phân bố với các dung môi chloroform, ethylacetat, thu hồi dung môi được 10g cao AL1, 20g cao AL2 Từ 20g cao AL2, qua sắc ký cột cổ điển thu được chất kết tinh H (167,8mg), K (193mg), và L (34,8mg) Trong đó chất K trùng với luteolin AL (500 g) H2SO41N Dịch acid CHCl3 Dịch CHCl3 Dịch acid EtOAc thdm Cao AL1(10g) Dịch acid Dịch EtOAc thdm Cao AL2 (20 g) SKCCĐ H (167,8mg) K (193mg) L (34,8mg) Sơ đồ 5.5 Tóm tắt quy trình chiết xuất và phân lập luteolin 44 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2007 Hồ Nguyễn Cao Nguyên Nghiên cứu phân lập cynarin và các polyphenol khác (cột 2, cột 3, cột 4) Từ 500g cao AL hoà vào cồn 300, sau đó lắc phân bố với các dung môi chloroform, butylacetat, methanol, thu hồi dung môi được 10g cao AL3, 25g cao AL4, 20g cao AL5, chất kết tinh Q1(125 mg) Từ 15g cao AL4, qua sắc ký cột cổ điển thu được chất kết tinh A1 (16,7mg), P1 (133,5mg), Từ 5g cao AL5, qua sắc ký cột cổ điển thu được phân đoạn có chứa cynarin AL (500 g) Cồn 30% Dịch cồn Dịch cồn Dịch CHCl3 ButOAc thdm Cao AL3 (10 g) Dịch cồn Dịch ButOAc MeOH thdm Cao AL4 (25 g) Dịch cồn Dịch MeOH SKCCĐ thdm Cao AL5 (20 g) A1 (16,7 mg) SKCCĐ Phân đọan có chứa cynarin 45 P1(133,5 mg) Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2007 Hồ Nguyễn Cao Nguyên Bảng 5.14 Các chất kết tinh và khối lượng tương ứng STT Chất kết tinh Khối lượng H 167,8 mg K (luteolin) 193,0 mg L 34,8 mg A1 16,7 mg P1 133,5 mg Q1 125,0 mg Phân đọan có chứa cynarin Đang chờ kết tinh Trong thời gian tới đề nghị tiếp tục Xác định cấu trúc và khảo sát tính chất lý hoá các chất H, L, P1, Q1 Làm giàu phân đoạn của cao AL4 để phân lập cynarin 46 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2007 Hồ Nguyễn Cao Nguyên TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Ngô Văn Thu, Bài giảng Dược Liệu, tập 1, ĐH Y Dược TPHCM, 1998, trang 307-311 http://fr.wikipedia.org/wiki/Artichaut Trương Thị Đẹp, Liêu Hồ Mỹ Trang, Bài giảng phân loại thực vật, Bộ môn thực vật, Khoa Dược, ĐH Y Dược TPHCM, 2004 Mabberley D.J, The plant Book.A portable dictionary of the higher plants, Cambrige university press, Cambrige.706 p, 1987 Robbin, W.W ; M.K.Bellue, and W.S Ball, Weeds of California, State of California Dept.of Agriculture.547 p, 1970 Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 1, Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật Trần Thị Tuyết Châu, Bào chế viên nang Actisô, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại Học, Đại học Y Dược TPHCM, 2000 Nguyễn Viết Thân, Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi, Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật, 2003 Nguyễn Thanh Sinh, Actisô thuốc đặc sản Đà Lạt,ĐH Đà Lạt (theo http://www.lamdong.gov.vn) Mingfu Wang, James E.Simon, Irma Fabiola Aviles, Kan He, Qun-Yi Zheng, and Yaakov Tadmor, Analysis of Antioxidative Phenolic Compounds in Artichoke (Cynara scolymus L.), Agricultural and food chemistry, 2003 Katrin Schutz, Dietmar Kammerer, Reinhold Carle, and Andreas Schieber, Identification and Quantification of Caffeoylquinic Acids and flavonoids from Artichoke (Cynara scolymus L.) heads, juice and pomace by HPLC-DAD-ESI/MS , Agricultural and food chemistry, 2004 The review of natural products, the most complete source of natural product information, second edition, Facts and Comparisons, 2002 Hiroshi Shimoda, Kiyofumi Ninomiya, Norihisa Nishida, Tomoe Yoshino, Toshio Morikawa, Hisashi Matsuda, and Masayuki Yoshikawa, Anti-Hyperlipidemic Sesquiterpens and new Sesquiterpen Glycosides from the Leaves ò Artichoke (Cynara scolymus L.) : Structure Requirement and Mode of Action, Bioorganic and Medicinal Chemistry Lettre 13, 2003 Goknur Aktay, Didem Deliorman, Ender Ergun, Fatma Ergun, Erdem Yesilada, Cemal Cevik, Hepatoprotective effects of Turkish folk remedies on experimental liver injury, Journal of Ethnopharmacology 73, 2000 Đỗ Tất Lợi, Những thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Y Học, 2000 T Saen Rodriguez, D.Garcia Giménez, and R de la Puerta Vazquez, Choleretic activity and biliary elimination of lipid and bile acids induced by an artichoke leaf extract in rats, Phytomedicine 9, 2002 Xianfeng Zhu, Hongxun Zhang, and Raymond Lo, Phenolic Compounds from the Leaf extract of Artichoke (cynara scolymus L.) and their Antimicrobial Actives, Agricultural and food chemistry, 2004 Michele Luciane Dickel, Stela Maris Kuze Rates, Mara Rejane Ritter, Plants popularly useds for loosing weight purposes in Porto Alegre, South Brazil, Journal of Ethnopharmacology 109,2007 19 Vidal, Ấn bản đặc biệt Việt Ngữ, 1995 20 Bộ Y Tế,Dược Điển Việt Nam III, NXB Y Học, Hà Nội, 2002,trang 307 47 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2007 Hồ Nguyễn Cao Nguyên PHỤ LỤC Phụ lục Phổ NMR của Cynarosid [9,10] Đo phổ 1H NMR (DMSO, 400 MHz) δ 7.44 (1H, dd, j= 8.0, 2.0 Hz, H-6’), 7.41 (1H, s, H2’), 6.88 (1H, d, J=8.0, H-5’), 6.80 (1H, d, J= 2.0 Hz, H-8), 6.75 (1H, s, H-3), 6.44 (1H, d, J= 2.0 Hz, H-6), 5.08 (1H, d, J= 6.6 Hz, glc-1), 3.10-3.70 (m); 13C NMR (DMSO, 100 MHz) δ 181.9 (s, C-4), 164.6 (s, C-2), 162.9 (s, C-7), 161.1 (s, C-5), 157.0 (s, C-9), 150.6 (s, C-5’), 113.3 (d, C-2’), 105.3 (s, C-10), 103.0 (d, C-3), 99.8 (d, glc-1), 99.5 (d, C-6), 94.7 (d, C-8), 77.1 (d, glc-5), 76.4 (d, glc-3), 73.1 (d, glc-2), 69.5 (d, glc-4), 60.6 (t, glc-6) Phụ lục Phổ NMR của Scolymosid [9,10] Scolymoside (luteolin 7- rutinoside), dạng bột màu vàng Đo phổ NMR sau 1H NMR (DMSO, 400 MHz) δ 7.44 (1H,dd, J= 8.0, 2.0 Hz, H-6’), 7.41 (1H,d, J= 2.0 Hz, H-2’), 6.89 (1H,d, J= 8.0 Hz, H-5’), 6.74 (1H, d, H-3), 6.73 (1H, d, J= 2.0 Hz, H-8), 6.45 (1H, d, J= 2.0 Hz, H-6), 5.08 (1H,d, J= 6.6 Hz, glc-1), 4.53 (1H, br s, rham-1), 3.10-3.85 ( m, proton của đường), 1.07 (3H, d, J= 6.4 Hz, rham-6); 13C NMR (DMSO, 100 MHz) δ 181.9 (s, C-4), 164.7 (s, C-2), 162.9 (s, C-7), 161.2 (s, C-5), 157.0 (s, C-9), 150.5 (s, C-4’), 146.0 (s, C-3’), 121.0 (s, C-1’), 119.3 (d, C-6’), 100.6 (d, rham-1), 99.9 (d, glc-1), 99.5 (d, C-6), 94.8 (d, C-8), 76.2 (d, glc-3), 75.6 (d, glc-5), 73.1 (d, glc-2), 72.0 (d, rham-4), 70.7 (d, rham-3), 70.3 (rham-2), 69.5 (d, glc-4), 68.4 (d, rham-5), 66.0 (t, glc-6), 17.9 (q, rham-6) Phụ lục Phổ NMR của Apigenin 7-rutinosid [9,10] Ngoài còn có apigenin 7-rutinoside, dạng bột màu vàng Đo phổ 1H NMR (DMSO, 400 MHz) δ 7.95 (2,d, J= 8.0 Hz, H-2’ và 6’), 6.96 (2H,d, J= 8.0 Hz, H-3’ và H-5’), 6.87 (1H, s, H-3), 6.77 (1H, br s, h-8), 6.45 (1h, br s, h-6), 5.07 (1H,d, J= 6.8 Hz), 4.54 (1H, brs, rham-1), 3.0-3.84 (proton của đường), 1.07 (d, J= 6.0 hz, rham-6); 13C NMR (DMSO, 100 MHz) δ 182.1 (s, C-4), 164.4 (s, C-2), 162.9 (s, C-4’), 119.3 (d, C-6’), 116.1 (d, C-5’ và C-3’), 105.4 (s, C-10), 103.1 (d, C-3), 100.6 (d, rham-1), 99.9 (d, C-6), 99.5 (d, glu-1), 94.8 (d, C-8), 76.3 (d, glc-3), 75.6 (d, glc-5), 73.1 (d, glc-2), 72.0 (d, rham-4), 70.7 (d, rham-3), 70.3 (rham-2), 69.5 (d, glc-4), 68.4 (d, rham-5), 66.0 (t, glc-6), 17.9 (q, rham-6) Phụ lục Phổ NMR của Narirutin [9,10] Narirutin ở dạng bột màu vàng Đo phổ 1H NMR (DMSO, 400 MHz) δ 7.34 (d, J= 8.8 Hz, h2’ và 6’), 7.33 (d, J= 8.8 MHz), 6.79 (2H, d, J= 8.8 Hz, H-3’ và H-5’), 6.13 (2H, m H-6 và H8), 5.50 (m, H-2), 4.99 (d, j= 7.2 Hz), 4.98 (d, J= 7.2 Hz), 4.54 (1H, br s, rham-1), 3.0-3.84 (proton của đường), 2.74 (dd, J= 17.2, 3.2 Hz, H-3), 2.72 (đ, J= 17.2, 3.2 Hz, H-3), 3.26 (1H, m, H-3), 1.07 (d, J= 6.0 Hz, rham-6); 13C NMR (DMSO, 100 Hz) δ 197.3 (s, C-4), 163.1 (s, C-5), 162.7 (s, C-9), 157.8 (s, C-4’), 128.6 (d, C-2’ và6’), 128.4 (s, C-1’), 115.2 (d, C-5’ và C3’, 103.3 (s, C-10), 103.1 (d, C-3), 100.6 (d, rham-1), 99.4 (d-glc-1), 96.4 (d, C-6), 95.4 (d, C8), 78.7 (d, C-2), 78.6 (d, C-2), 76.3 (d, glc-3), 75.5 (d, glc-5), 73.0 (d, glc-2), 72.0 (d, rham4), 70.7 (d, rham-3), 70.3(rham-2), 69.6 (d, glc-4), 68.3 (d, rham-5), 66.0 (t, glc-6), 42.2 (t, C3), 41.9 (t, C-3), 17.9 (q, rham-6) Phụ lục Phổ NMR của Cynarin [9,10] Đo phổ 1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 7.46 (1H, d, J= 16.0 Hz), 7.42 (1H, d, J= 16.0 Hz), 7.07 (2H, d, J=1.6 Hz), 6.96 (2H, m), 6.76 (2H, d, J= 8.0 Hz), 6.24 (1H, d, J= 16.0 Hz), 6.18 (1H, d, J= 16.0 Hz), 5.43 (1H, m), 4.23 (1H, m), 3.71 (1H, dd, J= 9.6, 3.2 Hz), 2.67 (2H, m), 2.24 (1H, dd, J= 15.6, 3.6 Hz); 13C NMR (CD3OD, 100 MHz) δ 178.2 (s), 169.2 (s), 168.3 (s), 149.7 (s), 149.3 (s), 146.9 (d), 146.8 (d), 146.7 (s), 146.2 (s), 128.1 (s), 127.7 (s), 123.0 (d), 122.8 (d), 116.8 (d), 116.5 (d), 115.4 (d), 115.0 (d), 115.0 (d), 115.0 (d), 84.0 (s), 74.5 (d), 71.8 (d), 71.0 (d), 38.4 (t), 36.8 (t) Phụ lục Phổ NMR của Cynarascolosid A và cynarascolid [9,10] Đo phổ 1H NMR và 13C NMR của cynarascolosid A và cynarascolid cho thấy có sự xuất hiện 48 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2007 Hồ Nguyễn Cao Nguyên của nhóm methyl [1: δ 1.47 (d, J=6.7 Hz, 15-H3), 1.85 (d, J = 7.0 Hz,13-H3), 1a: δ1.50 (d,J=6.7 Hz,15-H3), 1.70 (d, J=7.0 Hz,13-H3)], nhóm methylen [1: δ 1.90 (br dd,J=10.7, 13.1 Hz, 2β-H), 2.06 (br dd, J=7.0,13.1 Hz, 2α-H),2.31-2.37 (m, 9α-H),3.52 (dd, J= 4.0,12.3 Hz, 9β-H), 1a : δ 1.94 (br dd, J= 10.7, 13.1 Hz, 2β-H), 2.11 (br đ, J=7.0,13.1 Hz, 2α-H),2.41 (br d,J=12.1 Hz, 9α-H), 3.02 (đ, J= 4.1, 12.1 Hz, 9β-H)], một exo-methylen [1: δ 4.99, 5.23 (cả hai, 14- H2), 1a: δ 4.97, 5.00 (cả hai, 14-H2), năm nhóm methyl [1: δ 2.12 (m, 4-H), 2.31-2.37 (m, 5, 7-H),2.98 (qd, J=7.0,11.0 Hz,11-H),3.43 (br dd, J=7.0,10.7 Hz, 1-H),1a: δ 2.13 (m, 4H),2.22 (br dd, J=9.8, 10.4 Hz, 7-H), 2.38 (m,5-H), 2.8 (qd, J=7.0, 11.3 Hz,11-H), 3.49 (1H, br dd, J=7.0, 10.7 Hz, 1-H)], và nhóm methoxy [1: δ 3.90 (dd, J=10.1, 10.1 Hz, 6-H), 3.96 (br dd, J=4.0,10.1 Hz, 8-H), 4.31 (br s, 3-H), 1a: δ 3.85 (br d, J= 9.8 Hz, 8-H), 3.88 (dd, J= 10.1, 10.4 Hz, 6-H), 4.33 (br s, 3-H),] cùng với một nhóm β-D-glucopyranosyl { δ [ 4.40 (dd, J= 5.5, 11.6 Hz), 4.59 (dd, J= 2.1, 11.6 Hz), 6’- H2], 5.07 (d, J= 7.6 Hz, 1’-H)} Cấu trúc chiều của phần aglycon và vị trí của nhóm glucosid lien hợp của cynarascolosid A được xây dựng dựa cái nền của 1H-1H COSY và HMBC, chỉ sự tương quan một diện rộng giữa proton và carbon sau: 13-H3 và 7,11,12-C; 15-H3 và 3,4,5-C; 14-H2 và 1,9-C; 2-H2, 9-H2, 1-H và 10-C; 11-H và 12,13-C; 4,5-H và 15-C; 7-H và 13-C; 8-H và 1’-C; 1’-H và 8-C Mối liên quan cấu trúc không gian chiều của aglycon được xác định bởi thư nghiệm NOESY, tương quan NOE được quan sát giữa các proton sau: 3-H và 2β,4-H; 6-H và 4,11-H; 8-H và 9β,11-H; 5-H và 1,11-H, 15-H3; 1-H và 2α-H; 7-H và 13-H3 Phụ lục Phổ NMR của Cynarascolosid B [9,10] Cynarascolosid B (2) được phân lập có điểm chảy là 236-239 0C với góc quay cực âm [α]27D -9.70C) và đo phổ IR có đỉnh hấp thu tương tự chất Công thức phân tư cũng là C21H32O9 Thủy phân bằng HCl 1M cũng cho D-glucose, sesquiterpen isolipidiol (2a) đã được biết đến thu đươc nhờ thủy phân bằng enzyme Đo phổ 1H NMR (C5D5N) và 13C NMR của cynarascolosid B dưới dạng thủy phân (isolipidol) sau [ δ 1.42 (d, J= 6.7 Hz, 15-H3), 1.85 (d, J= 7.0 Hz, 13-H3), 1.92-2.02 (m, 2β, 5-H), 2.17 (m, 4-H), 2.20 (br dd, J= 6.4, 12.5 Hz, 2α-H), 2.31 (ddd, J=9.8,10.1, 10.7 Hz, 7-H), 2.36 (dd,J=4.0,12.4 Hz, 9β-H), 3.90 (br dd, j=6.4, 7.6 Hz, 3-H), 3.95 (ddd, J=4.0, 9.8, 10.1 Hz, 8-H), 3.99 (dd, J= 10.1, 10.1 Hz, 6-H), 5.11, 5.23 (cả hai, 14-H2)] và một nhóm β-D-glucopyranosyl { δ [4.40 (dd, J= 5.5, 11.6 Hz), 4.59 (dd, J= 1.8, 11.6 Hz), 6’-H2], 5.06 (d, J= 7.6 Hz, 1’-H)} Trong thư nghiệm HMBC, sự tương quan diện rộng giữa 1’proton của β-D-glucopyranosyl và 8-cacbon của phần aglycon và giữa 8-proton và 1’-cacbon, Hơn nữa còn có sự so sánh giữa dữ liệu 13C NMR của và 2a phát hiện thêm có sự thay đổi của gốc đường ở vị trí số Vì vậy mà cấu trúc của Cynarascolosid B được đề nghị là 8-O-β-D-glucopyranosid Phụ lục Phổ NMR của Cynarascolosid C [9,10] Đo phổ 1H NMR (C5D5N) và 13C NMR của sau [δ 1.29 (d, J= 7.3 Hz, 15-H3), 1.84 (d, J= 7.0 Hz, 13-H3), 2.15 (br dd, J= 9.2, 9.5 Hz, 5-H), 2.28 (m, 4-H), 2.43 (br d, J= 18.9 Hz, 2βH), 2.49 (br d, J= 12.7 Hz, 9α-h), 2.52 (dd, J= 8.8, 18.9 hz, 2α-H), 2.59 (ddd, J= 9.5, 10.1, 10.1 Hz, 7-H), 3.04 (dd-like, 1-H), 3.15 (qd, J= 7.0, 10.1 Hz, 11-H), 3.42 (dd, J= 5.3, 12.7 Hz, 9β-H), 3.91 (dd, J= 9.2, 9.5 Hz, 6-H), 4.02 (m, 8-H), 4.68, 5.06 (cả hai, 14-H2)] và một β-Dglucospyranosyl { δ [4.41 (dd, J= 5.5, 11.4 Hz), 4.60 (dd, J=1.5, 11.4 Hz), 6’-H2], 5.06 (d, J= 7.6 Hz, 1’-H)} Thư nghiệm HMBC chỉ tương quan diện rộng giữa proton của nhóm glucopyranosyl và 8-cacbon và 8-proton và 1’-cacbon của nhóm glucopyranosyl tách biệt Về mặt quang phổ cũng cho rằng glucopyranosyl được gắn vào nhóm 8-hydroxyl của chất 3a Cynarascolosid C được cho là isoamberboin 8-O-β-D-glucopyranosid 49 ... HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HỒ NGUYỄN CAO NGUYÊN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ POLYPHENOL GIÚP CHO VIỆC TIÊU CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU ACTISÔ (Cynara scolymus L.Asteraceae) KHÓA... 6. 3Một số chế phẩm có Actisô thị trường 13 ĐỘC TÍNH 15 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 Đối tượng nghiên cứu .16 1.1 Nguyên liệu. .. được cho là cynaropicrin và một số sesquiterpen lacton khác gây Một nghiên cứu tiến hành chuột lang cho rằng không có hiện tượng viêm mắt hay viêm da với những chế phẩm của Actisô