luận văn công nghệ thực phẩm Xác định hoạt tính một số enzyme ngoại bào của vi khuẩn Lactic phân lập từ các sản phẩm lên men truyền thống tại Hà Nội

ĐẶT VẤN ĐỀ Tinh bột, protein cellulose sản phẩm tự nhiên có vai trị quan trọng, có nhiều ứng dụng sản xuất đời sống người Trong chế biến tinh bột, cellulose, protein, mục đích nhà máy hay sở sản xuất chế biến chuyển hóa chúng từ hợp chất có phân tử lượng cao hệ số hấp thu kém, giá trị thương phẩm thấp thành sản phẩm có hệ số hấp thu cao hơn, có giá trị thương phẩm cao, có khả ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành công nghiệp chế biến liên quan khác Công đoạn quan trọng để đạt mục đích thuỷ phõn chỳng thành hợp chất đơn giản, đường đơn, axit amin Tinh bột, cellulose, protein thủy phân nhờ vào ba nhóm enzyme chủ yếu amylase, cellulase protease, nhiên thực tế việc tách chiết enzyme từ nguồn nguyên liệu tương ứng khó khăn hiệu xuất thu khơng cao, vi dụ amylase tách chiết từ mầm loại ngũ cốc, cellulase tách chiết từ dịch chiết dày bò hay hạt ngũ cốc nảy mầm, protease tách chiết từ thực vật hay động vật (đu đủ, dày bờ,…) [2] Chúng ta thấy hai nguồn nguyên liệu thực vật động vật dùng để sản xuất chế phẩm enzyme với quy mô công nghiệp số nhược điểm như; chu kỳ sinh trưởng chúng dài, hai nguồn nguyên liệu khó cải tạo Trong ba loại enzyme sản sinh tế bào vi sinh vật, nguồn enzyme vi sinh vật vơ phong phú có hầu hết cỏc nhúm vi sinh vật vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, [3] Có thể nói vi sinh vật nguồn tài nguyên phong phú, thích hợp để sản xuất enzyme quy mô lớn dùng công nghiệp đời sống So với enzyme tách chiết từ động vật, thực vật, enzyme tách chiết từ vi sinh vật thể nhiều ưu điểm bật có tính chất độc đáo, khắc phục khó khăn hạn chế [3] Tuy nhiên, nghiên cứu ứng dụng tập trung vào đối tượng nấm men vi khuẩn Bacillus mà chưa nghiên cứu đến vi khuẩn lactic, dựa hiểu biết vi khuẩn lactic nguồn thu enzyme từ vi sinh vật có ưu ứng dụng vào lên men, lẽ vi khuẩn lactic vi khuẩn sinh axit lactic nên có khả sinh trưởng bình thường mơi trường có pH thấp, điều kiện môi trường axit cao hiệu suất lên men nhờ vi khuẩn lactic cao đảm bảo chất lượng sản phẩm lên men Những ưu điểm vi khuẩn lactic có lợi cho ngành sản xuất thực phẩm đồ uống lên men sản xuất bia, rượu từ hạt ngũ cốc hay việc sản xuất chế phẩm dùng chăn nuôi Xuất phát từ thực tế tiềm sẵn có nước, đồng thời để phát lưu giữ chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học quý, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định hoạt tính một số enzyme ngoại bào của vi khuẩn Lactic phân lập từ các sản phẩm lên men truyền thống tại Hà Nụ̣i” CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan vi khuẩn lactic 1.1.1 Lịch sử phát Qua nhiều kỷ, nhà khoa học giới khám phá bí ẩn vi khuẩn lactic Năm 1780, nhà bác học Thụy Điển Schaele lần đầu tiờn tỏch axit lactic từ sữa bị lên men chua Năm 1857, Louis Pasteur chứng minh sữa chua hoạt động nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi vi khuẩn lactic Đầu kỷ 20, Metchenikoff làm việc Viện Paster Paris bắt đầu nghiên cứu ông phát việc sử dụng sữa chua có tác dụng tốt tới sức khỏe người Ông chứng minh sở qua việc quan sát nông dân vùng Bungari sử dụng lượng lớn sữa chua sống lâu, ụng phân lập vi khuẩn gọi tên “vi khuẩn Bungari” Loài vi khuẩn sau xác định Lactobacillus delbrueckki, số vi khuẩn sử dụng sản xuất sữa chua [17] Ngày nay, hiểu biết vi khuẩn lactic khỏ đầy đủ Vi khuẩn lactic nhóm vi khuẩn sinh axit lactic phổ biến, có khả sinh enzyme, vitamin, chất kích thích sinh trưởng chất có khả ức chế tiêu diệt nhóm vi sinh vật gây bệnh, điều giúp cho chúng có khả tồn sinh trưởng tốt nhiều loại nguyên liệu đem lên men Loại chất mà vi khuẩn lactic chuyển hóa phong phú, protein, cellulose, glucose hay tinh bột nhờ vào hệ enzyme phong phú Vì ba hoạt tính sinh amylase, cellulase, protease vi khuẩn lactic tiêu chuẩn quan trọng để tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có đặc tính sinh học mong muốn sử dụng trình lên men Đây hướng nghiên cứu có triển vọng để nhằm phát ứng dụng nguồn enzyme tự nhiên làm tăng hiệu suất lên men sản xuất sản phẩm lên men, từ giúp giảm bớt tác hại chất hóa học giảm giá thành sản phẩm 1.1.2 Phân loại vi khuẩn lactic 1.1.2.1 Phân loại vi khuẩn lactic theo Orla-Jensen Orla-Jensen phân loại vi khuẩn lactic dựa vào đặc điểm hình thái học (cầu khuẩn trực khuẩn), kiểu lên men, khả phát triển nhiệt độ khác nhau, mức độ sử dụng đường Ông xếp chúng thành bốn giống: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus Streptococcus [17] Ngày người ta bổ sung thêm giống Bifidobacterium có hình dạng biến đổi INCLUDEPICTURE "http://i01.i.aliimg.com/photo/v1/111544661/Lactic_acid_bacillus.jpg" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://www.itqb.unl.pt/labs/lactic-acid-bacteria-and-in-vivonmr/streptococcus20pneumoniae.jpg" \* MERGEFORMATINET Hình 1.1: Một số hình ảnh vi khuẩn lactic - Lactobacillus: Trực khuẩn, kích thước từ 0,7-1,1àm đến 3-8àm xếp đơi, chuỗi đứng riêng rẽ Nhiệt độ tối ưu 30 - 45oC Lên men đường galactose, glucose, fructose…Gồm có ba nhóm với ba loài đặc trưng: L bulgaricus, L brevis, L casei - Leuconostoc: Cầu khuẩn, có hình ovan hình trứng đường kính từ 0,5-0,8àm chiều dài khoảng 1,6àm Lên men đường dextran, trioza, sản phẩm tạo thành axit D-lactic, etanol, CO2 Có lồi đặc trưng L mensenteroides L lactic - Pediococus: Trực khuẩn, tồn dạng bát cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn Lên men đường glucose theo đường EMP, axit tạo thành có dạng DL, D(-) hay D(+) Có ba lồi đặc trưng P acidilactici, P dextranicum, P halophilus - Streptococus Lactococus: Cầu khuẩn, đường kính khoảng 0,5-1,0àm, xếp riêng biệt, cặp đôi thành chuỗi dài xếp đôi Có khả lên men đường hexoza thành axit lactic loại đường khỏc Cú ba loài đặc trưng sử dụng sữa: S lactic, S cremoris, S thermophilus - Bifidobacterium: Trực khuẩn, gram dương, không chuyển động, không bào tử Phát triển nhiệt độ tối ưu từ 36 - 38 O, pH tối ưu 6,5 - Có khả lên men lactoza sản phẩm tạo thành axit lactic axit axetic [18] 1.1.2.2 Phân loại vi khuẩn lactic dựa vào trình lên men Lên men lactic trình sinh hố phổ biến thiên nhiên, q trình chuyển hoỏ cỏc chất gluxit thành axit lactic nhờ hoạt động sống trực tiếp hệ vi sinh vật lactic Trong thiên nhiên vi khuẩn lactic tồn hai dạng: • Nhóm vi khuẩn lactic đồng hình: có khả phân huỷ đường đơn giản tạo nên axit lactic, trình lên men lactic đồng hình C6H12O6 → 2CH3CH(OH)COOH + 22,5 Kcalo Do hệ enzyme vi sinh vật khác thường khác nên chế hố học q trình lên men lactic giống vi sinh vật thường không giống Ở vi khuẩn lactic đồng hình chuyển hố đường thành axit lactic theo đường lên men rượu đến giai đoạn tạo axit pyruvic, axit khử hai nguyên tử hidro nhờ hoạt động lacticodehydrogenase để trở thành axit lactic CH3COCOOH + 2H CH3CHOHCOOH • Nhóm vi khuẩn lactic dị hình: tạo q trình lên men phức tạp hơn, gọi lên men lactic dị hình, chúng tạo nên mơi trường ngồi axit lactic cịn có nhiều sản phẩm phụ: axit axetic, rượu etylic, CO 2, H2, số chất thơm diacetyl este C6H12O6→CH3CHOHCOOH +COOHCH2CH2COOH +CH3COOH + CH3CH2OH + CO2 + H2 Số lượng sản phẩm phụ hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng điều kiện ngoại cảnh Nói chung axit lactic thường chiếm 40% lượng đường phõn huỷ, axit succinic gần 20%, rượu etylic khoảng 10% cỏc khớ vào khoảng 20% Đơi lượng khí thay vào lượng axit formic Lên men lactic cần có lên men đồng thời vi khuẩn lactic đồng hình dị hình Vì trình lên men dị hình ngồi việc tạo thành axit lactic cịn tạo sản phẩm phụ axit rượu sinh este có mùi thơm làm cho sản phẩm có hương vị đặc trưng [14] 1.1.3 Đặc điểm chung vi khuẩn lactic Trong sinh giới có khoảng 400 – 500 chi vi khuẩn biết đến, đó cú 13 chi biết đến vi khuẩn lactic (xem bảng 1.1) Bảng 1.1: Các chi số loài vi khuẩn lactic biết đến Chi Lactobacillus Loài 75 Chi Lactococcus Loài Carnobacterium Vagococcus Lactosphaera 10 Leuconostos 10 Atopobium 11 Onenococcus Weissella 12 Pediococcus Streptococus 50 13 Tetragenococcus Enterococcus 19 Vi khuẩn lactic nhóm vi khuẩn sinh axit lactic phổ biến tự nhiên, loại chất mà vi khuẩn lactic tham gia chuyển hoá phong phú từ tinh bột, cellulose, protein, vi khuẩn lactic phân lập từ nhiều nguồn mẫu khác từ thịt chua, cỏ ủ chua, Nhìn chung vi khuẩn lactic cú cỏc đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa sau: - Thuộc vi khuẩn Gram dương - Khơng sinh bào tử, khơng có khả di động - Hình dạng tế bào hình cầu Streptococcus, Lactococcus, Leuconostos, Pediococcus, hình que Lactobacillus) Người ta phân biệt chúng khả lên men đồng hình hay dị hình - Phản ứng âm tính với catalase (đây dấu hiệu vi khuẩn kỵ khí) - Có khả lên men đường để tạo axit lactic - Cấu tạo tế bào mang đầy đủ cấu trúc tế bào nhân thật (thành tế bào, màng tế bào, tế bào chất, thể nhân, ) - Mỗi lồi vi khuẩn khác có nhu cầu dinh dưỡng khác Chúng cần cung cấp đủ chất dinh dưỡng: cacbon, nito, muối khống mà cịn cần chất kích thích sinh trưởng [12, 13] 1.1.4 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến vi khuẩn latic 1.1.4.1 Ảnh hưởng chất dinh dưỡng Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phỏt trỉờn cần đảm bảo yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, khơng có độc tố, cho hiệu suất thu hồi lớn giá thành rẻ Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không ảnh hưởng đến phát triển vi khuẩn q trình ni cấy mà cịn ảnh hưởng khơng nhỏ đến q trình thu hồi bảo quản chế phẩm sinh khối sau  Ảnh hưởng nguồn cacbon Vi khuẩn lactic sử dụng nhiều loại hydratcacbon, từ hexose (glucose, fructose, manose, galactose), đường đôi (saccarose, lactose, maltose) polysaccarit (tinh bột, dextrin) Glucose dạng D- glucose, loại monosaccarit hấp thụ dễ dàng Chúng vi sinh vật sử dụng đến loại khó chuyển hố Vì trình sản xuất người ta thường đưa loại đường cho vi sinh vật dễ sử dụng Nguồn lượng quan trọng cho vi khuẩn lactic monosaccrit disaccarit Các nguồn cacbon dùng để cung cấp lượng, xây dựng cấu trúc tế bào sinh axit hữu axit citric, malic, pyruvic, fumaric, axetic… Một vài loài vi khuẩn lactic lên men dị hình phân lập từ sản phẩm thực phẩm, sử dụng axit gluconic galacturonic tạo thành CO 2, axit axetic axit lactic Trong trình lên men chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic sử dụng axit amin axit glutamic, arginin, tirozin làm nguồn cung cấp lượng Khi tạo q trình đề cacboxyl tạo CO Các loại vi khuẩn khác địi hỏi nguồn cacbon khác Một số lồi vi khuẩn lactic sử dụng dextrin tinh bột Sự phát triển vi khuẩn lactic với loại đường khác tạo tế bào có đặc điểm hình thái sinh lý khác nhau, có khả chống chịu khác trước áp lực trình xử lý sau [15, 16]  Ảnh hưởng nguồn nitơ Mỗi loài vi khuẩn khác lại có nhu cầu nguồn nitơ khác Phần lớn vi khuẩn lactic sinh tổng hợp chất hữu phức tạp có chứa nitơ nờn chỳng địi hỏi nguồn nitơ có sẵn mơi trường Để sinh trưởng phát triển bình thường, ngồi nitơ dạng hỗn hợp axit amin, vi khuẩn lactic cần hợp chất hữu chứa nitơ sản phẩm thuỷ phân protein từ lactanbumin, casein, pepton, peptit, dịch nấm men thuỷ phân, dịch chiết thịt, trypton…Đõy nguồn nitơ thường xuyên sử dụng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy Tuy nhiên quy mô cơng nghiệp ta cần nghiên cứu nguồn nitơ thích hợp để sản xuất giúp giảm giá thành sản phẩm mà nâng cao hiệu sản xuất Trong dịch nấm men thuỷ phân sử dụng nhiều [15, 16]  Ảnh hưởng muối vô chất kích thích sinh trưởng Các muối vơ chất khoáng với lượng nhỏ lại có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển vi khuẩn Chẳng hạn Lactobacillus, Mn2+, Mg2+, Fe2+ làm tăng cường phát triển vi khuẩn lactic, hay Ca2+ tham gia vào cấu trúc protease thuỷ phân số protein nguồn dinh dưỡng ni tế bào Nhìn chung mangan magie chất cỏc vai trò chủ yếu như: tham gia cấu trúc đảm bảo chức hoạt động enzyme, giải độc cho tế bào khỏi có mặt oxy, ổn định cấu trúc tế bào Các chất chứa axit béo có mặt mơi trường có ảnh hưởng khơng nhỏ đến q trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn Chúng khơng kích thích sinh trưởng mà cịn đóng vai trị q trình lạnh đơng sau Ví 10 Hình 3.7: Hình thái khuẩn lạc hình dạng tế bào chủng M1-2 Hình 3.8: Hình thái khuẩn lạc hình dạng tế bào chủng M4-3 Hình 3.9: Hình thái khuẩn lạc hình dạng tế bào chủng D2-5 44 Hình 3.10: Hình thái khuẩn lạc hình dạng tế bào chủng B3-3 Hình 3.11: Hình thái khuẩn lạc hình dạng tế bào chủng B3-1 Hình 3.12: Hình thái khuẩn lạc hình dạng tế bào chủng D2-12 45 Quan sát hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn lactic, nhận thấy khuẩn lạc chúng có đặc điểm chung khuẩn lạc trịn, gọn, có màu trắng, bóng khơng bóng Bảng 3.5: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc hình dạng tế bào 10 chủng vi khuẩn lactic STT Kí hiệu chủng B3-1 Hình thái khuẩn lạc To, trịn, gọn, trắng sữa, Hình dạng tế bào Que dài, xếp thành 10 B3-3 D2-5 sữa, khơng bóng Nhỏ, trịn, gọn, trắng đám nhỏ Hình cầu, xếp thành D2-8 sữa, bóng, ướt To, trịn, gọn, trắng sữa, chuỗi đám lớn Hình ovan, xếp thành D2-10 khơng bóng Nhỏ, trịn, gọn, trắng đám lớn Hình que ngắn, xếp D2-12 sữa, bóng, ướt To, trịn, gọn, trắng thành đám lớn Hình ovan, xếp thành sữa, khơng bóng khơng bóng đám chuỗi dài Nhỏ, tròn, gọn, trắng Que ngắn, xếp thành chuỗi dài đám M1-2 To, tròn, lồi, gọn, lớn Que ngắn, que cặp đôi, M4-1 trắng đục, khơng bóng To, trịn, gọn, trắng xếp thành đám nhỏ Que ngắn, xếp thành M4-3 sữa, khơng bóng Nhỏ, tròn, gọn, trắng đám nhỏ Que ngắn, xếp thành M5-1 trong, bóng, ướt Nhỏ, lồi, khơng gọn, chuỗi dài Que ngắn, xếp thành 46 trắng đục, khơng bóng chuỗi lớn 3.5 Kết kiểm tra phản ứng catalase Sau làm thí nghiệm kiểm tra phản ứng catalase, với vi khuẩn đối chứng Bacillus Subtillis, nhận thấy tất chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu cho kết âm tính (vì khơng có tượng sủi bọt nhỏ trực tiếp vài giọt H2O2 lên bề mặt khuẩn lạc) Hình 3.13 hình 3.14 kết kiểm tra phản ứng catalase số chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu Phản ứng catalase chủng M1-2 Phản ứng catalase chủng M4-3 Hình 3.13: Hình ảnh phản ứng catalase hai chủng M1-2 M4-3 Phản ứng catalase chủng B3-3 Phản ứng catalase chủng D2-12 Hình 3.14: Hình ảnh phản ứng catalase hai chủng B3-3 D2-12 3.6 Kết đo sinh khối tế bào (đo OD) 47 Sau thực đo sinh khối tế bào máy đo quang phổ, bước sóng λ = 660nm thu kết bảng 3.6 Bảng 3.6 : Kết đo sinh khối tế bào 10 chủng vi khuẩn lactic STT 10 Ký hiệu chủng B3-1 B3-3 D2-5 D2-8 D2-10 D2-12 M1-2 M4-1 M4-3 M5-1 Giá trị OD 2,147 2,657 2,177 2,428 2,247 2,458 2,457 2,328 2,527 2,130 Qua bảng số liệu 3.6 giá trị OD 10 chủng vi khuẩn lactic đem kiểm tra, nhận thấy chủng đem kiểm tra thể tốc độ sinh trưởng mạnh (OD>2) Trong chủng B3-3 có giá trị OD cao (2,657) thể tốc độ sinh trưởng mạnh so với chủng cịn lại 3.7 Kết kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn chủng lactic Chúng tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu với ba chủng vi khuẩn kiểm định Salmonella typhymurium, E Coli, Shigella flexneri Đây ba chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột thường gặp người vật ni Kết đo vịng kháng khuẩn thể bảng 3.7 48 Bảng 3.7: Hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn lactic STT Ký hiệu 10 chủng B3-1 B3-3 D2-5 D2-8 D2-10 D2-12 M1-2 M4-1 M4-3 M5-1 Hoạt tính kháng khuẩn (K= D-d) (mm) Salmonella typhymurium Shigella flexneri E Coli 5,5 16 6,5 0 0 6,5 14 6 18 5,5 16 0 Hình 3.15: Khả kháng Shigella flexneri 10 chủng vi khuẩn lactic Ký hiệu chủng theo số ghi đĩa thạch: – M4-1; – D2-5; – M4-3; – B3-3; – M1-2; – D2-12 Kết hình 3.15 bảng 3.7 cho thấy chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn mức độ khác với loài vi khuẩn kiểm định 49 khả kháng chủng khác Chúng ta nhận thấy chủng B3-3, D2-12, M1-2, M4-3, có khả kháng ba loại vi khuẩn kiểm định mạnh cả, khả kháng với chủng Shigella flexneri mạnh so với hai chủng vi khuẩn kiểm định lại Các chủng vi khuẩn lại khả kháng khuẩn yếu phổ kháng khuẩn không rộng 3.8 Kết kiểm tra khả di động chủng vi khuẩn lactic Các chủng vi khuẩn lactic kiểm tra khả di động phương pháp nuôi cấy tĩnh môi trường MRS bán lỏng bổ sung 0,1% thạch, kết thu thể qua hình 3.16 Hình 3.16: Kết kiểm tra khả di động chủng vi khuẩn latic Kết cho thấy chủng vi khuẩn latic nghiên cứu khơng có khả di động, tế bào sinh trưởng mọc thẳng theo vạch que cấy, không mọc loang môi trường 3.9 Kết nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lờn cỏc chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn có hoạt tính enzyme ngoại bào 50 Sau tiến hành lặp lại thí nghiệm nhiều lần chúng tơi định chọn chủng có hai hoạt tính (amylase, cellulase) M1-2, M4-3 chủng D2-12 có hoạt tính protease để nghiên cứu sâu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính enzyme 3.9.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt tính enzyme ngoại bào (amylase, cellulase, protease) Sau nuôi cấy lắc chủng lactic D2-12, M1-2 M4-3 mơi trường MRS có chứa nguồn cacbon khác nhau:  Môi trường MRS I chứa glucose 2%  Môi trường MRS II chứa đồng thời 1% glucose 1% chất  Môi trường MRS III chứa 2% chất Tiến hành xác định hoạt tính enzyme ngoại bào (amylase, cellulase, protease) kết thu trình bày bảng 3.8 Bảng 3.8: Hoạt tính enzyme ngoại bào chủng D2-12, M1-2 M4-3, loại môi trường Ký hiệu Mơi trường Hoạt tính chủng ni cấy amylase (mm) MRS I 0 22 MRS II 0 MRS III 0 MRS I 18,5 12 MRS II 20 12,5 MRS III 22 14 MRS I 21 8,5 MRS II 21,5 8,5 D2-12 M1-2 M4-3 Hoạt tính 51 Hoạt tính cellulase (mm) protease(mm) MRS III 24 10 Số liệu thu bảng 3.8 cho thấy: môi trường MRS II MRS III mơi trường có bổ sung chất cảm ứng enzyme, khả sinh enzyme ngoại bào (amylase, cellulase) chủng M1-2 M4-3 cao ni mơi trường MRS I chứa hồn tồn nguồn cacbon glucose Nuôi khuẩn môi trường MRS III chứa 2% chất, hoạt tính enzyme thể mạnh (đường kính vịng phân giải lớn với chủng M1-2 hoạt tính amylase 22 mm cellulase 14 mm; chủng M4-3 hoạt tính amylase 24 mm cellulase 10 mm) Ngược lại, chủng D2-12 có hoạt tính protease mạnh ni khuẩn mơi trường MRS I với vịng phân giải chất 22 mm Trên mơi trường MRS II chủng D2-12 có hoạt tính protease yếu mơi trường MRS III chủng D2-12 khơng có hoạt tính protease 3.9.2 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh enzyme ngoại bào Ba chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn đem ni cấy mơi trường dịch thể thích hợp, lắc ổn nhiệt (220 vũng/phỳt) với nhiệt độ 30 O, 37O, 40O, 45O Sau 48 nuôi, xác định hoạt tính enzyme Bảng 3.9: Ảnh hưởng nhiệt độ ni cấy đến hoạt tính enzyme ngoại bào chủng D2-12, M1-2, M4-3 Ký hiệu Nhiệt độ (o chủng C) 30O 37O 40O Hoạt tính Hoạt tính Hoạt tính amylase (mm) 0 cellulase ( mm) 0 protease (mm) 22 20 52 45O 30O 37O 40O 45O 30O 37O 40O 45O 17 22 18 17 21 19 0 12 13 6,5 16 0 0 0 0 Kết bảng 3.10 cho thấy, khoảng nhiệt độ thích hợp cho khả tổng hợp amylase, cellulase, protease chủng vi khuẩn lactic D2-12, M1-2 M4-3 từ 30OC – 40OC, lượng enzyme cao nuôi cấy nhiệt độ 37OC Nuụi cõy nhiệt độ 45OC hai chủng vi khuẩn lactic M1-2 M4-3 khơng cịn hoạt tính amylase, cellulase; chủng D2-12 cịn hoạt tính protease hoạt tính yếu 3.9.3 Ảnh hưởng thời gian ni cấy đến khả sinh enzyme ngoại bào Các chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn nuụi cấy trờn mụi trường chứa nguồn cacbon thích hợp 37OC từ 24 đến 96 giờ, sau xác định hoạt tính enzyme ngoại bào thời gian ni cấy khác Kết thu trình bày bảng 3.10 Bảng 3.10: Ảnh hưởng thời gian ni cấy đến hoạt tính enzyme ngoại bào chủng D2-12, M1-2, M4-3 Ký hiệu Thời gian Hoạt tính Hoạt tính Hoạt tính chủng ni cấy 24 amylase (mm) cellulase (mm) protease (mm) D2-12 53 48 72 96 24 48 72 96 24 48 72 96 0 0 20,5 21 18 21 19 17 0 0 13,5 12 11 10 12 22 0 0 0 0 Kết từ bảng 3.10 cho thấy thời gian ni cấy thích hợp để hai chủng lactic M1-2 M4-3 có khả sinh enzyme (amylase, cellulase) enzyme có hoạt tính mạnh khoảng thời gian 48 – 72 giờ, thời gian ni cấy để amylase, cellulase có hoạt tính cao 48 ni (vịng phân giải chất amylase chủng M1-2 20,5 mm chủng M4-3 21 mm) Đối với chủng lactic D2-12 sinh protease thời gian nuôi để vi khuẩn sinh protease hoạt tính enzyme mạnh 72 (vịng phân giải chất protease 22 mm), thời gian ni cấy tăng lên 96 hàm lượng enzyme sinh hoạt tính enzyme giảm mạnh 3.10 Kết phân loại chủng D2-12, M1-2, M4-3, qua phân tích trình tự gen mó hoỏ cho ARN 16S Các chủng vi khuẩn tuyển chọn, thu sinh khối tế bào tách chiết ADN genom Sử dụng cặp mồi đặc hiệu p16S-R p16S-F để khuếch đại đoạn gen ARN 16S Kết sản phẩm PCR thu băng đặc hiệu có kích thước khoảng 1,5 kb Đoạn gen tinh gắn vào vector tỏch dũng xác định trình tự nucleotide Trình tự thu được, sử lý phần mềm Clustal X so sánh với ngân hàng liệu GeneBanhk công cụ Blast Search để xác định đến tên loài Kết thu sau: 54 - Mức độ tương đồng trình tự nucleotide rARN 16S chủng vi khuẩn lactic D2-12 so với chủng L pentosus subsp công bố ngân hàng GeneBanhk (NCBI) 99% Kết cho thấy chủng vi khuẩn lactic D2-12 chủng Lactobacillus pentosus - Mức độ tương đồng trình tự nucleotide rARN 16S chủng vi khuẩn lactic M1-2 so với chủng L plantarum công bố ngân hàng GeneBanhk (NCBI) 99% Kết cho thấy chủng vi khuẩn lactic M12 chủng Lactobacillus plantarum subsp - Mức độ tương đồng trình tự nucleotide rARN 16S chủng vi khuẩn lactic M4-3 so với chủng L fermentum công bố ngân hàng GeneBanhk (NCBI) 99% Kết cho thấy chủng vi khuẩn lactic M43 chủng Lactobacillus fermentum KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Đã phân lập 59 chủng vi khuẩn lactic từ loại dưa muối, cà muối, nước bún ủ chua mẫu nem chua thu thập chợ số gia đình làm bún thủ công Hà Nội Đã chọn 10 chủng vi khuẩn có hoạt tính axit lactic mạnh có khả lên men lactic đồng hình Đã chọn hai chủng M1-2 M4-3 có khả sinh đồng thời hai loại enzyme ngoại bào amylase cellulase cao ổn định Một chủng D2-12 có khả sinh protease ngoại bào cao ổn định Đã xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho chủng M1-2 M43 MRS III chủng D2-12 môi trường MRS I; nhiệt độ thích hợp cho 55 tiết enzyme ngoại bào chủng 37 OC; thời gian ni cấy thích hợp cho chủng M1-2 M4-3 48 cho chủng D2-12 72 Căn vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hố kết phõn tích trình tự rRNA16S chủng D2-12, M1-2, M4-3 so sánh trình tự rRNA16S công bố ngân hàng GenBank xác định được: chủng có ký hiệu D2-12 thuộc lồi Lactobacillus pentosus; chủng có ký hiệu M1-2 thuộc lồi Lactobacillus plantarum chủng có ký hiệu M4-3 thuộc lồi Lactobacillus fermentum Kiến nghị: Để góp phần làm cho đề tài nâng cao khả ứng dụng thực tiễn, đóng góp thêm số chủng vi khuẩn lactic có đặc tính sinh học quý vào việc sản xuất chế phẩm từ vi khuẩn lactic phục vụ cho đời sống người xã hội cần: Tiếp tục nghiên cứu sâu đặc điểm sinh lý, sinh hố, ảnh hưởng điều kiện ni cấy đến khả sinh enzyme ngoại bào (amylase, cellulase, protease) chủng M1-2, M4-3, D2-12 để lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu Nghiên cứu quy trình lên men quy mơ vừa chiết xuất suất enzyme bào (amylase, cellulase, protease) từ chủng M1-2, M4-3, D2-12 Tiếp tục nghiên cứu phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính enzyme ngoại bào khác từ nhiờự nguồn sản phẩm lên men khác 56 MỤC LỤC 57 ... hoạt tính một số enzyme ngoại bào của vi khuẩn Lactic phân lập từ các sản phẩm lên men truyền thống tại Hà Nụ̣i” CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan vi khuẩn lactic 1.1.1... suất lên men nhờ vi khuẩn lactic cao đảm bảo chất lượng sản phẩm lên men Những ưu điểm vi khuẩn lactic có lợi cho ngành sản xuất thực phẩm đồ uống lên men sản xuất bia, rượu từ hạt ngũ cốc hay vi? ??c... men vi khuẩn Bacillus mà chưa nghiên cứu đến vi khuẩn lactic, dựa hiểu biết vi khuẩn lactic nguồn thu enzyme từ vi sinh vật có ưu ứng dụng vào lên men, lẽ vi khuẩn lactic vi khuẩn sinh axit lactic