khuẩn lactic.
Xác định khả năng sinh axit lactic
Nguyên tắc: Để khẳng định được những chủng đã phân lập được là vi
khuẩn lactic cần tiến hành nuôi lắc ổn nhiệt trong môi trường chọn lọc đó là môi trường MRS dịch thể, nếu là vi khuẩn lactic, chúng sẽ sống trong môi trường MRS và tạo sinh khối tế bào làm môi trường sau khi nuôi lắc bị vẩn đục.
Tiến hành: Phương pháp được tiến hành theo các bước sau:
- Dùng que cấy vô trùng lấy một đầu que cấy sinh khối tế bào trong ống giống thạch nghiêng hoặc trong đĩa thạch, cấy vào môi trường MRS dịch thể trong bình tam giác nhỏ (50ml).
- Nuôi lắc trong tủ ấm 37OC, tốc độ lắc 200 vũng/phỳt, trong thời gian 48 giờ.
- Sau 48 giờ nuôi lắc đem ra kiểm tra, nếu bình môi trường bị vẩn đục tức là đó cú chứa sinh khối của chủng vi khuẩn lactic cấy vào, ngược lại nếu bình môi trường không thấy thay đổi màu sắc tức là chủng vi khuẩn nuôi cấy trong đó không phải là vi khuẩn lactic.
- Thu lấy dịch ly tâm và bảo quản ở 4OC để sử dụng cho các thí nghiệm sau. Khẳ năng sinh axit lactic mạnh hay yếu của các chủng vi khuẩn lactic được xác định bằng phướng pháp chuẩn độ Therner. Phương pháp này được tiến hành như sau:
- Lấy 10ml dịch nuôi lắc đã ly tâm cho vào ống nghiệm, bổ sung thêm 20ml nước cất và 1- 2 giọt Phenolphtalein (nồng độ 1% trong cồn 90O).
- Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi dung dịch trong ống nghiệm xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giõy thỡ dừng lại.
- Ghi lại thể tích dung dịch NaOH 0,1N đó dựng để chuẩn độ. Độ axit được tính theo độ Therner theo công thức:
OT = VNaOH tiêu tốn x 10 % axit lactic = OT x 0,009
Trong đó: OT là độ Therner, 1OT tương ứng với 9 mg axit.
Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, cellulose, protease)
Trong quá trình sống, vi khuẩn lactic thực hiện trao đổi chất với môi trường nuôi cấy và sẽ tiết ra môi trường các loại enzyme ngoại bào. Dựa vào đặc điểm đó, để chọn lọc được các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh một số enzyme ngoại bào (amylase, cellulase, protease), dựa theo sự xuất hiện vòng phân giải cơ chất trên môi trường thạch có chứa cơ chất hay còn gọi là phương pháp đục lỗ thạch. Nếu trong dịch nuôi cấy của chủng nào có chứa enzyme ngoại bào (amylase, cellulase, protease), chúng sẽ khuếch tán vào môi trường thạch có chứa cơ chất, làm cắt đứt các liên kết của hợp chất cao phân tử làm cho môi trường thạch có chứa cơ chất không còn khả năng bắt màu dung dịch thuốc
nhuộm và tạo thành một vòng tròn màu trắng xung quanh lỗ thạch và ta gọi đó là vòng phân giải.
Các bước tiến hành thử hoạt tính của một số enzyme ngoại bào (amylase, cellulase, protease) của vi khuẩn lactic như sau:
- Dựng nút khoan bằng ống nhựa đã được đo đường kính trước, đục lỗ thạch trên đĩa petri của 3 loại môi trường: môi trường tinh bột, môi trường CMC, môi trường Casein.
- Với mỗi chủng vi khuẩn lactic tiến hành nhỏ 0,1 ml dịch ly tâm đã thu vào lỗ thạch.
- Sau khi nhỏ lỗ để đĩa thạch trong tủ lạnh ở 4OC khoảng 2 giờ nhằm mục đích để dịch ly tâm khuếch tán đều vào trong thạch.
- Để vào tủ ấm 37OC sau 48 giờ để cho lượng dịch trong lỗ thạch khuếch tán hết. Với đĩa thạch thử hoạt tính amylase và cellulase tiến hành đổ dung dịch Lugol nhuộm màu để quan sát vòng phân giải tinh bột và vòng phân giải CMC. Khác với phương pháp xác định hoạt tính của hai enzyme amylase và cellulase, phương pháp xác định hoạt tính của enzyme protease có vài điểm khác biệt như sau:
- Sau 48 giờ nuôi lắc các chủng vi khuẩn lactic trên môi trường MRS không bổ xung cơ chất, tiến hành nhỏ trực tiếp dịch vi khuẩn lactic vào lỗ thạch và để trong tủ ấm 37OC trong 48 giờ ( không cần ly tâm để loại bỏ cặn tế bào).
- Đĩa thạch thử hoạt tính protease không cần dùng đến thuốc nhuộm mà có thể trực tiếp quan sát vòng phân giải cơ chất trên môi trường thạch. Hoạt tính của các enzyme ngoại bào được xác định bằng cách đo đường
Trong đó: D là đường kính vòng ngoài cùng của vòng phân giải (mm) d là đường kính lỗ thạch (mm)