Nguyên tắc: Nhộm Gram (phản ứng Gram) có vai trò đặc biệt trong việc
phân loại vi khuẩn. Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào trước hết được xử lý với dung dịch tím kết tinh và Iốt nờn cú sự tạo thành phức chất tím kết tinh – Iốt bên trong tế bào.
Nếu là vi khuẩn Gram âm, khi vi khuẩn Gram âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngoài bị hòa tan làm tăng tính thấm của màng dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím kết tinh – Iốt và làm cho vi khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc nhuộm này nên sẽ có màu hồng đỏ (đỏ vang với Safranin hay đỏ tía với Fuchsin).
Nếu là vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các lỗ trong peptidoglican co lại do đó phức chất tím kết tinh – Iốt bị giữ lại trong tế bào nên không còn khả năng bắt màu thuốc nhuộm bổ sung. Bởi vậy vi khuẩn Gram dương bắt màu tím khi nhuộm Gram.
Chuẩn bị dụng cụ:
- Dịch huyền phù tế bào của 5 chủng vi khuẩn lactic cần nhuộm - Đèn cồn
- Lam kính - Nước cất - Que cấy
- Dung dịch tím kết tinh - Dung dịch Iốt ( Lugol) - Cồn 95O
- Fuchsin
Tiến hành:
- Dùng que tăm vô trùng, chấm một đầu tăm nhỏ bằng sợi túc lờn khuẩn lạc, hòa tan tế bào trong giọt nước cất trên phiến lam kính.
- Cố định tiêu bản bằng ngọn lửa đèn cồn rồi nhuộm thuốc đầu bằng dung dịch tím kết tinh (Crystal violet) trong 1 phút.
- Rửa bằng nước cất.
- Nhuộm tiếp bằng dung dịch Iốt ( dung dịch Lugol) trong 1 phút. - Rửa bằng nước cất.
- Phủ lên vết bôi dung dịch etanol 95%: axeton tỉ lệ 1:1 trong 1 phút. - Rửa bằng nước cất.
- Nhuộm tiếp bằng thuốc nhuộm bổ sung màu đỏ (Safranin hay Fuchsin Ziehl) trong 30 – 60 giây.
- Rửa nước, để khô và soi dưới kính hiển vi.