2.3.2.1. Phân lập và thuần khiết giống
Để phân lập được các chủng vi khuẩn lactic từ các nguồn mẫu trước tiên cần nuôi cấy mẫu trên môi trường chọn lọc của vi khuẩn lactic, đó là môi trường MRS bằng phương pháp cấy gạt, sau đó dựa vào sự khác nhau về hình dạng, kích thước của khuẩn lạc hình thành trên đĩa thạch mà chọn ra được các chủng khác nhau. Cấy gạt mẫu được thực hiện theo phương pháp: cấy gạt hiếu khí.
Tiến hành:
- Lấy 1ml mẫu đem pha loãng đến nồng độ 10-4 .
- Dùng pipet hút 0.05 ml dịch mẫu ở nồng độ 10-4 nhỏ lên đĩa petri chứa môi trường MRS đặc.
- Dùng que gạt, gạt đều cho dịch mẫu chải đều trên mặt thạch, khi gạt tuyệt đối không làm cày mặt thạch.
- Đĩa thạch sau khi được cấy gạt, quấn prafilm và để trong tủ ấm ở 37OC trong 48 giờ.
Tinh sạch khuẩn lạc
Các đĩa petri đã cấy mẫu đặt trong tủ ấm sau 48 giờ đem ra kiểm tra, quan sát sự xuất hiện cỏc vũng khuẩn lạc. tuyển chọn những khuẩn lạc mọc riêng rẽ, hình thành tròn, có màu trắng đục, nhẵn và có vòng phân giải CaCO3, tiến hành dùng que cấy vô trùng bắt lấy một khuẩn lạc trên cấy sang đĩa thạch MRS khác, khi cấy cần cấy theo đường zich zăc nhằm làm các khuẩn lạc mọc tách rời nhau.
Các đĩa vừa cấy riêng mỗi loại khuẩn lạc được đánh ký hiệu khác nhau, càng tinh sạch được nhiều khuẩn lạc càng phân lập được nhiều chủng vi khuẩn lactic phục vụ cho các nghiên cứu về sau. Các đĩa thạch này cũng được quấn parafilm và để trong tủ ấm 37OC, sau 48 giờ đem ra kiểm tra sự xuất hiện khuẩn lạc. Vì mật độ tế bào giảm dần theo vết cấy cho nên sau khi ủ các khuẩn lạc xuất hiện thưa dần. Những khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên vết cấy cuối có nhiều khẳ năng
được hình thành từ một tế bào riêng rẽ, cần phân biệt được các khuẩn lạc được hình thành do các tế bào tạp nhiễm.
Sau đó tiếp tục dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc mọc riêng rẽ cấy chuyển sang ống thạch nghiêng chứa môi trường MRS, để vào tủ ấm 37OC, sau 48 giờ thì chuyển sang để trong tủ lạnh bảo quản ở 4OC để dùng cho những nghiên cứu tiếp theo.