TÓM TẮT NỘI DUNG ĐỒ ÁN- Tìm hiểu dịch chiết enzyme tiêu hóa của cá Tra. -Khảo sát mức độ thuỷ phân Phosphorus của dịch chiết enzyme lên nguyên liệu (bột cá 55% đạm, bột mì, bã đậu nành, cám gạo) và thức ăn nuôi cá tra (22% protein thô, 24% protein thô, 32% protein thô).-Đánh giá mức độ thuỷ phân Phosphorus của enzyme phytase thương mại với các nồng độ 0,015U, 0,03U, 0,06U, 0,09U, 0,12U lên nguyên liệu (bột cá 55% đạm, bột mì, bã đậu nành, cám gạo) và thức ăn nuôi cá tra (22% protein thô, 24% protein thô, 32% protein thô).-Đánh giá mức độ thuỷ phân Phosphorus của enzyme phytase thương mại kết hợp với dịch chiết enzyme lên nguyên liệu (bột cá 55% đạm, bột mì, bã đậu nành, cám gạo) và thức ăn nuôi cá tra (22% protein thô, 24% protein thô, 32% protein thô).-Đánh giá hiệu quả quá trình thuỷ phân phosphorus của dịch chiết enzyme kết hợp với enzyme phytase thương mại.-Xác định nồng độ enzyme phytase thương mại để bổ sung vào thức ăn nuôi cá tra
Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU Phosphorus là khoáng chất đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng thức ăn vật nuôi. Phosphorus và cũng như các nguyên tố khoáng cần thiết khác được cung cấp chủ yếu qua con đường thức ăn. Đa số thức ăn cho gia súc có nguồn gốc từ các hạt thực vật đặc biệt là ngũ cốc và các loại hạt đều có chứa sẵn Phosphorus. Tuy nhiên, Phosphorus có chứa trong nguyên liệu hạt này có tới 80% nằm dưới dạng phân tử phytate hoặc axit phytic. Phosphorus tồn tại ở dạng này rất khó tiêu hoá đối với các loài động vật có dạ dày đơn như gia cầm, lợn, cá … Axit phytic khi kết hợp với các ion kim loại như Fe 3+ , Mg 2+ , Ca 2+ , Zn 2+ … sẽ ngăn cản khả năng kết hợp của các ion kim loại này với các axit béo không no làm giảm khả năng tiêu hoá thức ăn của động vật, gây ra hiệu ứng kháng dinh dưỡng. Ngoài ra do không hấp thu được lượng Phosphorus có sẵn trong axit phytic nên thức ăn cho động vật dạ dày đơn (ví dụ: cá, gia cầm, heo…) thường phải bổ sung thêm Phosphorus dẫn đến lượng Phosphorus thừa không được tiêu hoá bị thải ra ngoài theo phân của chúng đã làm ô nhiễm môi trường gây nên hiện tượng tảo nở hoa bùng phát, ảnh hưởng đến sự phát triển của các loài thuỷ sản… Chính vì vậy, để tận dụng nguồn Phosphorus có sẵn trong thành phần của các nguyên liệu thực vật, tăng hệ số sử dụng thức ăn của vật nuôi, giảm lượng axit phytic thải ra ngoài môi trường thì việc các hợp chất Phosphorus ở dạng khó phân giải thành này thành các chất đơn giản và dễ phân giải hơn là rất quan trọng. Để đạt được điều này, người ta đã sử dụng phytase để thuỷ phân axit phytic. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành khảo sát mức độ thuỷ phân của dịch chiết enzyme tiêu hoá cá tra kết hợp với enzyme phytase trên thức ăn nuôi cá tra để nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn nuôi cá tra. Bằng cách ứng dựng phương pháp nghiên cứu in vitro – là phương pháp phân tích hiện nay đang được quan tâm đề xuất đánh giá khả năng tiêu hoá của thức ăn thủy sản là kỹ thuật enzym tiêu hoá in vitro bởi vì kỹ thuật đưa ra ý nghĩa làm giảm yêu cầu về chi phí và thời gian nhằm đánh giá khả năng tiêu hoá của thức ăn. SVTH: Võ Thị Tố Nga 1 Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1. Vai trò của enzym khi bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi [3, 30] 2.1.1. Cơ chế tác động của enzyme Enzyme được sử dụng như là thức ăn bổ sung được gọi là enzyme ngoại sinh để phân biệt với enzyme nội sinh - là những enzyme sinh ra trong cơ thể. Enzyme ngoại sinh làm tăng tỷ lệ tiêu hoá thức ăn theo hai cơ chế: - Một là, kết hợp với enzyme nội sinh phân giải các hợp chất thành những chất có kích thước đủ nhỏ để hấp thụ. Như vậy việc lựa chọn enzyme thức ăn sao cho có tác dụng hỗ trợ cho enzyme nội sinh trong việc phân giải chất dinh dưỡng của thức ăn là cần thiết. - Hai là, enzyme thức ăn phải giảm được độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hoá thức ăn, vì chính độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hoá cản trở sự hấp thu thức ăn. Một vài hợp chất khi giải phóng khỏi vách tế bào đã hình thành các gel làm tăng độ nhớt trong ruột. Thường các khẩu phần chứa nhiều polysaccharide không phải tinh bột (non – starch polysaccharides – NSP) gây ra hiện tượng này. Động vật mới sinh ra, đặc biệt là gia cầm rất nhạy cảm với sự biến đổi độ nhớt vốn được sinh ra trong quá trình tiêu hoá. Để tăng cường hai cơ chế trên, enzyme thức ăn thường được sản xuất dưới dạng những chế phẩm đa enzyme để phân giải đồng thời nhiều hợp chất. Ví dụ: nếu dùng β – glucanase thì chỉ phá vỡ được vách nội nhũ của hạt đại mạch mà không phân giải được protein chứa trong tế bào chất, vì vậy để phân giải protein trong lớp tế bào chất này phải cần thêm cả enzyme cellulase và pentosanase. 2.1.2. Bổ sung enzyme vào khẩu phần thức ăn của lợn, cá, gia cầm 2.1.2.1. Bổ sung enzyme vào khẩu phần thức ăn của gia cầm [30] Gà broiler nhạy cảm đối với các chất kháng dinh dưỡng, do vậy để đáp ứng tốt đối với việc bổ sung enzyme phù hợp vào khẩu phần (β – glucanase đối với khẩu phần lúa mạch, pentosanase đối với khẩu phần lúa mì, phytase đối với phytate). Bổ sung đa enzyme có lợi hơn bổ sung enzyme đơn. Hàm lượng enzyme bổ sung tuỳ thuộc vào tuổi và thành phần khẩu phần. Theo Schoner et al., (1993), gà broiler 44 ngày tuổi yêu cầu 570 U phytase để giải phóng 1g Phosphorus; gà 70 ngày tuổi số lượng enzym yêu cầu là 850 U. SVTH: Võ Thị Tố Nga 2 Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện Gà mái đẻ có nhu cầu bổ sung phytase kém hơn gà broiler tuy nhiên cũng có những tác dụng như tăng sản lượng trứng và hiệu quả chuyển hoá thức ăn thì cũng thấy rõ ở gà mái đẻ [3]. 2.1.2.2. Bổ sung enzyme vào khẩu phần thức ăn lợn So với gia cầm, hiệu quả của enzyme thức ăn trong khẩu phần lợn giữa các nghiên cứu không thống nhất [3]. Một tổng kết tập hợp kết quả 23 thí nghiệm bổ sung enzyme cho lợn tiến hành từ 1978 đến 1993 đã thấy rằng chỉ có 4 thí nghiệm trên lợn con là có kết quả rõ rệt (Officer, 1995); còn đối với lợn sinh trưởng- vỗ béo thì kết quả không rõ rệt (Chu et al., 1998). NSP hoà tan không làm giảm khả năng tiêu hoá thức ăn của lợn như ở gia cầm. Thacker et al. (1998) cho biết rằng sự chuyển hoá thức ăn và tăng trọng của lợn 20 kg ăn khẩu phần đại mạch giàu glucan không có sự khác nhau đáng kể nào khi bổ sung β- glucanase vào khẩu phần thức ăn. Không giống như gia cầm, pentosanase không làm tăng khả năng hấp thụ thức ăn của lợn con. Bổ sung pentosanase vào khẩu phần lúa mạch không cải thiện được sự tăng trưởng của lợn 20-25kg (Thacker et al. 1991). Bổ sung β-glucanase cho lợn 80kg làm tăng tỷ lệ tiêu hoá chất khô và protein nhưng sự cải thiện này quá nhỏ để nâng cao hiệu quả chuyển hoá thức ăn và tăng trọng. Tuy nhiên, đối với lợn việc bổ sung phytase thì có hiệu quả rõ rệt, phytase đã làm tăng tích luỹ khoáng và khả năng hấp thụ thức ăn của lợn, giảm được chi phí thức ăn. Cần chú ý rằng không có mức tiêu chuẩn bổ sung phytase cho tất cả các khẩu phần, mức phytase bổ sung phụ thuộc vào loài lợn và loại khẩu phần. Yi et al. (1996) cho thấy rằng số lượng phytase để giải phóng 1g Phosphorus khác nhau từ 785 U (đối với khẩu phần ngô-đỗ tương) đến 1146 U (đối với khẩu phần đỗ tương tinh chế). Mặt khác đối với Hoppe et al. (1993) cũng cho rằng với khẩu phần ngô- lúa mạch-đỗ tương cho lợn con thì để giải phóng 1g Phosphorus chỉ cần 380U. Ngoài ra các nguồn phytase khác nhau thì hoạt tính enzyme cũng khác nhau (hoạt tính enzyme phytase vi sinh vật lớn hơn phytase lúa mì và làm tăng khả năng hấp thụ Phosphorus, sự tích luỹ Canxi, Nitơ và giảm Phosphorus thải tiết ở phân). Hiệu quả của phytase còn chịu sự chi phối của khẩu phần, số bữa ăn, lượng thức ăn cho ăn cũng như chức năng sinh lý của lợn (bổ sung cùng một lượng phytase vào một khẩu phần thì hiệu quả nhất là đối với lợn nái tiết sữa sau đến lợn sinh trưởng-vỗ béo, lợn con và thấp nhất là lợn chửa giữa kỳ) [3]. SVTH: Võ Thị Tố Nga 3 Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện 2.1.2.3. Bổ sung enzyme vào thức ăn của cá Trong những năm gần đây nguồn protein động vật như bột cá ngày càng đắt đỏ cho nên protein thực vật đã được bổ sung vào trong các khẩu phần của cá. Tuy nhiên các nguồn protein thực vật thì nhiều xơ và chất kháng dinh dưỡng như axit phytic, chất ức chế trypsin, lecitins Vì vậy vai trò của enzyme ngoại sinh trong khẩu phần các loài thuỷ sản nuôi ngày càng quan trọng. Tuy nhiên nhu cầu bổ sung enzyme của cá khác nhau thì khác nhau. Nghiên cứu của Carter et al. 1992 với α-amylase trên cá hồi Atlantic (Salmon salar) không thấy có ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển hoá thức ăn. Tương tự Renitz (1983) cũng thấy rằng bổ sung enzyme phân giải protein trong khẩu phần cá hồi rainbow trout không cải thiện được sự tăng trưởng và hiệu quả chuyển hoá thức ăn. Tuy nhiên, những kết quả nghiên cứu trên cá hồi của Gorskova và Yu- Dvinen (1984) và của Carter et al. (1994) thì lại thấy có những cải thiện về khả năng tiêu hoá thức ăn của cá khi bổ sung enzyme. Nghiên cứu của Ye et al: bổ sung vào khẩu phần cá chép một hỗn hợp đa enzyme với liều 5 - 10g/kg đã làm cho tốc độ tăng trưởng của cá tăng hơn 12,3 - 27,5% so với đối chứng. Đối với cá cũng như các loài động vật dạ dày đơn, phytate là một chất kháng dinh dưỡng. Enzyme phytase có tác dụng giải phóng Phosphorus, cải thiện tỷ lệ tiêu hoá của Phosphorus (1000 U phytase/kg thức ăn của cá hồi rainbow trout làm tăng tỷ lệ tiêu hoá Phosphorus từ 58,6 lên 68,1% Lunari et al. 1998). Nhu cầu bổ sung phytase cũng phụ thuộc vào loài cá, khối lượng cá và khẩu phần. 2.1.3. Giảm mùi hôi và cải thiện môi trường chăn nuôi [29] Chất thải chăn nuôi có khả năng gây ô nhiễm môi trường không khí, đất, nước và đặc biệt là tầng mặt nước. Ở nước ta, tình trạng này có phần nghiêm trọng do nơi chăn nuôi thường nằm gần hoặc trong khu dân cư, đặc biệt là khi phần lớn các giếng cung cấp nước sinh hoạt lại khai thác nước ở tầng nước mặt bị ô nhiễm. Phosphorus thải ra trong phân của vật nuôi là chất gây ô nhiễm đất và nước ngầm. Phytase có khả năng làm giảm 30 – 50% lượng phosphorus thải ra môi trường do nó giúp làm giảm lượng Phosphorus bổ sung và hấp thu tối đa lượng Phosphorus sẵn có trong nguyên liệu. Phytase cũng giúp giải phóng đạm và axit amin, khiến chúng được tiêu hoá và hấp thu tốt hơn, qua đó làm giảm lượng thải nitơ và lưu huỳnh nên làm giảm mùi hôi và ô nhiễm nguồn nước. SVTH: Võ Thị Tố Nga 4 Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện 2.2. Sơ lược về axit phytic và enzym phytase 2.2.1. Sơ lược về axit phytic 2.2.1.1. Định nghĩa Axit phytic là axit hữu cơ, phân tử của nó có chứa các gốc phosphate, tồn tại chủ yếu trong hạt của các hạt ngũ cốc, đậu đỗ, hạt có dầu. Người ta đã xác định được rằng axit phytic giữ vai trò nhất định và có những tác động ảnh hưởng đến tính chất dinh dưỡng của các loại hạt trên. Axit phytic công thức phân tử C 6 H 18 O 24 P 6 và phân tử lượng là 660,04. Danh pháp quốc tế của axit phytic được gọi là myo – inositol 1,2,3,4,5,6 – hexakisdihydrogen phosphate. Thực tế, axit phytic thường tồn tại dưới dạng muối của các kim loại có hoá trị I, II (thường là K, Mg, Ca). Các muối kim loại này gọi là phytate và chúng được xem như là kho dự trữ Phosphorus lớn trong các hạt thực vật. 2.2.1.2. Cấu trúc hoá học của axit phytic Có nhiều nghiên cứu về mô hình cấu trúc phân tử của axit phytic nhưng các nghiên cứu này lại đưa đến những kết luận rất khác nhau. Trong số các nghiên cứu đó có hai nghiên cứu tiêu biểu của hai nhóm chuyên gia khác nhau được biết đến nhiều hơn cả. Đó là nhóm của Johnson & đtg nghiên cứu cấu trúc axit phytic bằng phương pháp cộng hưởng điện từ từ hạt nhân 31 P ( 31 P – NMR) và nhóm của Blank nghiên cứu bằng phương pháp nhiễu xạ tia X. Tuy nhiên hai nhóm nghiên cứu này lại đưa ra hai kết luận trái ngược nhau. Theo Jonhson thì trong cấu trúc của phân tử axit phytic có một gốc phosphate ở vị trí số 2 (gốc phosphate gắn với nguyên tử C số 2 nằm theo hướng trục thẳng đứng còn các gốc phosphate ở vị trí khác thì có hướng nghiêng một góc so với phương thẳng đứng). Ngược lại, kết luận của tác giả Blank lại cho rằng các gốc phosphate 1,3,4,5 và 6 nằm theo hướng trục thẳng đứng còn gốc phosphate nằm ở vị trí số 2 lại nghiêng theo gốc 1/4. Tuy nhiên, kết luận về cấu trúc phân tử của axit phytic theo phương pháp Johnson được sự tán đồng hơn. SVTH: Võ Thị Tố Nga 5 Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện Hình 2.1: Mô hình cấu trúc axit phytic. Hình 2.2: Công thức cấu tạo của phytate 2.2.1.3. Nguồn gốc và sự phân bố của axit phytic trong tự nhiên Axit phytic thường tồn tại ở dạng muối của các ion kim loại có hoá trị một hay nhiều hoặc có thể là hỗn hợp của chúng. Chẳng hạn như hỗn hợp muối Kali – Magiê trong gạo, hỗn hợp Canxi – Magiê – Kali trong các hạt đậu tương. Các muối này thường tập trung ở một số vùng nhất định trong các hạt thực vật như ngũ cốc, đậu đỗ. Axít phytic được tích luỹ dần trong hạt từ khi hạt còn non đến khi hạt trưởng thành, trong suốt quá trình chín cùng với các chất dự trữ khác trong hạt như tinh bột, lipid… Tuy nhiên, mức độ tập trung của axit phytic ở các hạt thực vật khác nhau là không giống nhau. Ví dụ như trong các loại ngũ cốc, axit phytic được tích luỹ nhiều trong hạt phấn còn đối với các loại đậu thì axit phytic được tích luỹ nhiều trong các hạt tinh thể của chúng. Nghiên cứu cho thấy rằng, ở cây một lá mầm như lúa, lúa mì… thì trong nội nhũ và nhân của hạt hầu như không chứa phytate mà lượng phytate lại được tìm thấy chủ yếu ở phôi và lớp tế bào hạt phấn. Ngược lại, như Ferguson đã chứng minh ở cây hai lá mầm thì lượng phytate chủ yếu lại nằm trong thành phần nội nhũ chiếm 99% và chỉ có khoảng 1% là ở trong phôi hay mầm của hạt. Hàm lượng phytate cao nhất ở hạt ngũ cốc được tìm thấy ở ngô (0,83-2,22%) và các hạt đậu là (5,92-9,1%). 2.2.1.4. Chức năng sinh lý của axit phytic Phosphorus là một thành phần cấu tạo nên phân tử axit phytic chính vì vậy axit phytic và các muối của chúng trong các hạt thực vật là một nguồn dự trữ Phosphorus khá dồi dào có thể tận dụng nhằm cung cấp khoáng chất cho cơ thể. Ngoài ra axit phytic còn là một nguồn dự trữ năng lượng, nguồn myo-inositol (thành phần cấu tạo nền vỏ ngoài của thành tế bào). Đối với các hạt thực vật, axit phytic cũng có những ảnh hưởng nhất định đến đặc tính sinh lý của hạt. Nó tác động đến trạng thái ngủ nghỉ của hạt do nó chống lại sự oxy hoá tự nhiên SVTH: Võ Thị Tố Nga 6 Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện (chống lại sự hô hấp) trong quá trình ngủ nghỉ của các hạt thực vật, vì vậy làm chậm sự phát triển và có thể làm mất khả năng nảy mầm của các hạt này. Vào cuối thập kỷ 80, đầu thập kỷ 90 người ta đã chứng minh được vai trò gián tiếp của inositol phosphate trong quá trình vận chuyển vật chất trong tế bào, đặc biệt là vai trò của inositol-triphosphate. Chúng là dấu hiệu của sự di truyền tính trạng và có liên quan rất lớn đến sự biến đổi chức năng của tế bào đối với cả tế bào động vật và thực vật. Bên cạnh những tác động sinh lý nêu trên, người ta dự đoán rằng axit phytic còn có thể có những chức năng chưa biết khác 2.2.1.5. Hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit phytic Một đặc tính bất lợi nổi bật nhất của axit phytic đối với cơ thể động vật là hiệu ứng kháng dinh dưỡng. Hiệu ứng này tạo nên do cấu trúc bất thường của axit phytic. Khi phân tử axit phytic ở dạng phân ly hoàn toàn, 6 nhóm phosphate của chúng sẽ mang tổng điện tích âm 12. Vì vậy, chúng có nhiều khả năng thích hợp với các ion dương hoá trị I, II, III hoặc hỗn hợp của các ion đó, hình thành nên các hợp chất không hoà tan, rất khó tiêu hoá. Sự hình thành các hợp chất vô cơ không tan trong đường ruột đã ngăn cản sự hấp thụ các khoáng chất của cơ thể động vật. Bởi vì axit phytic khi kết hợp với các ion kim loại như: Fe 3+ , Mg 2+ , Ca 2+ , Zn 2+ … sẽ ngăn cản khả năng kết hợp của các ion kim loại này với các axit béo không no làm giảm khả năng tiêu hoá thức ăn của động vật. Như vậy, yếu tố này làm giảm lượng khoáng cần thiết được đưa vào cơ thể động vật qua con đường thức ăn mà lẽ ra cơ thể động vật có thể hấp thu được, do đó làm giảm giá trị dinh dưỡng của nguồn thức ăn. Chính vì những nguyên nhân trên mà axit phytic được coi là yếu tố kháng dinh dưỡng ở động vật, đặc biệt là các động vật có dạ dày đơn ngăn như gia cầm, lợn, và cá. Với một số nguyên tố vi lượng, ví dụ như Zn thì giá trị dinh dưỡng của nó chịu ảnh hưởng rất lớn bởi axit phytic. Một vài thí nghiệm đã cho thấy việc bổ sung dần dần axit phytic vào trong khẩu phần thức ăn của vật nuôi đã gây ảnh hưởng đến sự hấp thụ Zn 2+ của cơ thể (cơ thể không hấp thụ Zn 2+ ) và tốc độ tăng trưởng trọng lượng của động vật thí nghiệm một cách rõ rệt. Axit phytic có khả năng kết hợp với protein tạo thành phức chất phytate – protein trong một khoảng pH rất rộng. Ở pH rất thấp, axit phytic mang điện tích âm lớn do sự phân ly của toàn bộ các gốc phosphate trong phân tử. Trong điều kiện này, axit phytic có thể làm hạn chế khả năng hoà tan của các protein bởi vì có sự liên kết ion giữa các gốc phosphate cơ bản với các gốc tự do của amino axit (lysine, histidine, arginine). Trong môi trường có tính SVTH: Võ Thị Tố Nga 7 Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện axit, axit phytic liên kết chặt chẽ với các protein thực vật do đó điểm đẳng điện (pI) của các protein thực vật lúc này nằm trong khoảng pH = 4 – 5, khoảng pH= 6 – 8 cả axit phytic và protein thực vật đều mang điện tích âm. Tuy nhiên, ở điều kiện này vẫn có thể hình thành phức chất giữa axit phytic và protein. Cơ chế xảy ra có thể là sự liên kết trực tiếp của axit phytic với proton của các nhóm cuối cùng α – NH 2 và ε – NH 2 của gốc lysine tự do hoặc liên kết qua nhân tố trung gian là một cation đa hoá trị. Cũng bởi liên kết với protein thực vật nên axit phytic làm giảm khả năng hoà tan và khả năng tiêu hoá của các protein này do đó làm giảm giá trị dinh dưỡng của chúng. Ngoài việc tạo phức chất với các khoáng chất và các protein, axit phytic còn tác động đến các enzyme như trypsine, pepsine, α – amylase, β – galactosidase và kết quả là làm giảm hoạt tính của các enzyme tiêu hoá quan trọng này. 2.2.2. Sơ lược về enzyme phytase [24, 25, 26] 2.2.2.1. Định nghĩa Phytase là enzyme xúc tác cho phản ứng thuỷ phân axit phytic (myo – inositol hexakisphosphate) thành các myo – inositol phosphate phân tử thấp và các monophosphate vô cơ. Khi phản ứng thuỷ phân xảy ra hoàn toàn sẽ giải phóng toàn bộ các gốc phosphate trong phân tử axit phytic và tạo thành các myo – inositol tự do. Phytase có tên gọi đầy đủ, theo quy ước quốc tế là: myo – inositol hexakisphosphat phosphohydrolase. Uỷ ban danh pháp enzyme thuộc Hội hoá sinh Quốc tế đã chia phytase thành hai loại là 3-phytase (EC 3.1.3.8) và 6-phytase (EC 3.1.3.26). Các định tên này dựa trên cơ sở nhóm phosphat đầu tiên được giải phóng khi axit phytic (hay hợp chất phytate) bị tấn công bởi enzyme. SVTH: Võ Thị Tố Nga 8 Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện 2.2.2.2. Đặc điểm cấu tạo của phytase [26] Hình 2.3: Cấu trúc toàn bộ của phytase từ vi khuẩn B.amyloliquefacience. Phytase cũng giống như mọi enzyme khác có bản chất là protein. Chúng là những phân tử có khối lượng 20kDa đến 100kDa. Kích thước phân tử protein của enzyme phytase sản sinh từ các nguồn khác nhau cũng khác nhau. Ba ion Canxi Ca1, Ca2 và Ca3 quyết định tính bền nhiệt của enzyme có màu sáng. Ba ion Caxi Ca4, Ca5 và Ca6 nằm ở phía trên của phân tử có màu đậm. Thêm một ion Canxi Ca7 cò màu đen nằm cạnh Ca4 và Ca6 không có mặt khi vắng mặt ion phosphat. Các nghiên cứu đã cho thấy rằng hầu hết các phytase thu được từ các chủng nấm mốc và vi khuẩn như E.coli, K.terrigena, B.subtilis (natto) cho đến nay đều là các enzyme được cấu tạo chỉ gồm một phần tử. Nhưng phytase ở một số động vật và thực vật thì protein của chúng lại được cấu tạo bởi nhiều phần nhỏ, các phần đó được gọi là các tiểu đơn vị. Ví dụ phytase tích luỹ trong các hạt ngô đang nảy mầm là enzyme mà phân tử protein của chúng bao gồm 2 tiểu đơn vị có trọng lượng phân tử bằng nhau là 38 kDa. Còn phytase được tách chiết từ ruột của một loài chuột lại được cấu tạo bởi 2 tiểu đơn vị là 2 băng protein có khối lượng được xác định bằng phương pháp điện ly trên gel polyacrylamid (SDS – PAGE) ước tính khoảng 70 và 90 kDa. Tuy nhiên người ta đã xác định được rằng chỉ có tiểu đơn vị có kích thước 90 kDa là có khả năng thuỷ phân axit phytic vì 2 băng protein này biểu hiện cho 2 loại enzyme khác nhau tương ứng là phosphatase kiềm và phytase. Theo tác giả Tambe, có một trường hợp đặc biệt đó là phytase thu được từ chủng vi khuẩn K.aerogenes lại gồm 2 dạng khác nhau. Dạng thứ nhất có thể coi là dạng enzyme gốc, có kích thước lớn một cách khác thường (700 kDa). Dạng thứ 2 có thể là một phân tử nhỏ của SVTH: Võ Thị Tố Nga 9 Luận văn tốt nghiệp GVHD: ThS. Nguyễn Văn Nguyện enzyme gốc, có khối lượng phân tử rất thấp chỉ khoảng 10 – 13 kDa nhưng nó lại mang đầy đủ hoạt tính của enzyme. Phytase của vi khuẩn nhìn chung có kích thước nhỏ hơn so với phytase của nấm mốc. Phân tử lượng của phytase từ nấm theo dự đoán khoảng 50 kDa và theo kết quả thí nghiệm xác định được là 65 – 70 kDa, điều này cho thấy có sự glycosyl hoá rất mạnh mẽ. Phytase được sinh ra từ chủng nấm mốc A.niger NRRL 3135 có 27% hàm lượng glycosyl, chúng bao gồm một tỷ lệ nhất định giữa đầu N của chuỗi manose và galactose. Các nghiên cứu đều cho thấy rằng sự glycosyl hoá của phytase tái tổ hợp rất cao. Ngược với sự glycosyl hoá một lượng vừa phải trong nấm mốc A.niger, chúng lại xảy ra rất đa dạng và với một lượng rất lớn trong nấm men Hansenula polymorpha và Saccharomyces cerevisiae. Điều đáng ngạc nhiên là hàm lượng glycosyl khác nhau không chỉ giữa các hệ được biểu hiện khác nhau mà còn giữa các nhóm phytase trong cùng một hệ biểu hiện. Khi phân tích mô hình glycosyl của phytase từ nấm mốc A.niger thì thấy rằng tính không đồng nhất của chúng đã dẫn đến sự thiếu hụt 2 trong 10 vị trí N-glycosyl. Nhìn chung hàm lượng glycosyl có thể có một vài tác động đến tính chất của enzyme. Thứ nhất, nó có thể ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác hoặc tác động đến tính bền của enzyme.Thứ hai, nó có thể ảnh hưởng đến tính đẳng điện (pI) của protein enzyme. Thứ ba, sự tổng hợp năng lượng trao đổi chất có thể thấp hơn mức biểu hiện của protein. Nhưng theo Wyss & đtg, có một điều đáng ngạc nhiên là glycosyl ở các mức độ khác nhau không ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác, khả năng chịu nhiệt hay khả năng phục hồi của phytase ở loài A.niger. Từ sự glycosyl hoá cấu trúc và chức năng của phytase đã dẫn đến câu hỏi liệu chỉ có 2 vị trí N-glycosyl hoá là bảo thủ ở phytase của nấm mốc hay còn ở vị trí nào khác. Han & đtg đã nghiên cứu vai trò của glycosyl trong việc biểu hiện phytase chức năng của nấm mốc A.niger trong nấm men Pichia pastoris. Các kết quả nghiên cứu trên đã cho thấy sự giống nhau trong việc thuỷ phân axit phytic và khả năng chịu nhiệt được cải thiện nhưng không đáng kể ở enzyme được glycosyl khi biểu hiện trong nấm men P. pastoris so với cùng với enzyme đó nhưng biểu hiện trong nấm mốc A.niger. Việc khử glycosyl của phytase có thể làm giảm 34 % khả năng chịu nhiệt của enzyme. Sự khử glycosyl bằng tunicamycin trong quá trình biểu hiện đã dẫn tới kết quả làm giảm đáng kể sự sản sinh phytase, điều này cho thấy rằng sự glycosyl hoá rất cần cho quá trình sinh tổng hợp của PhyA tái tổ hợp trong nấm P. pastoris. Tuy nhiên tunicamycin cũng có thể làm hỏng quá trình sản xuất vì chúng không tích luỹ phytase nội bào. Mặt khác những nghiên cứu của Wyss đã chỉ ra rằng sự glycosyl hoá SVTH: Võ Thị Tố Nga 10 [...]... thnh cỏc myo inositol t do Enzyme phytase thu phõn hp cht phosphorus dng khú phõn gii thnh cỏc cht n gin v d phõn gii hn Tn dng c ngun phosphorus cú sn trong thnh phn cỏc nguyờn liu thc vt, tng h s s dng thc n ca vt nuụi, gim lng axit phytic thi ra mụi trng [11] 3.2.2 S qui trỡnh nghiờn cu mc thy phõn ca enzyme Phytase Dch chit enzyme thụ ca cỏ tra Phytase thng mi Nng enzyme? Xỏc nh P tng Xỏc nh... thy phõn phospho khi b sung enzyme phytase thng mi kt hp vi dch chit enzyme thụ lờn nguyờn liu v thc n - Nng enzyme phytase thng mi s c chn dóy nng enzyme thớch hp t mc 3.2.2.2 - Dch chit enzym thụ s dng giai on cỏ 600gr - Thi gian thy phõn 4 gi v s ln lp li l 5 ln Bng 3.3: B trớ thớ nghim ỏnh giỏ mc thu phõn phosphorus khi b sung dch chit enzyme thụ kt hp vi enzyme phytase thng mi lờn nguyờn liu... phosphate vụ c Cũn i vi phytase ca vi khun v nm mc, phosphat vụ c li l nguyờn nhõn c ch cnh tranh ca phytate Florua cng c ch phytase kim t phn hoa loa kốn v c ch cnh tranh phytase t K terrigena Phytase ca K terrigena cng b c ch bi phosphate, molybdate v vanadate Molybdate v vanadate cng c bit l cht c ch phosphatase Nng c cht khong 300àM ó c ch mt enzyme ging phytase tỏch chit t Paramecium Phytase ca Klebsiella... cu Phosphorus ca vt nuụi thỡ phi gia tng hu dng ca Phosphorus trong thc n thụng qua s dng cỏc enzyme tiờu hoỏ l mt gii phỏp kh thi Phytase l mt enzyme cú kh nng thu phõn phytate gii phúng Phosphorus khi phc h phytate gia tng hu dng Phosphorus thc n Mt s thớ nghim ó chng minh rng vic b sung phytase trong thc n ó cú mt nh hng tớch cc n s tng trng, hiu qu s dng thc n cng nh kh nng s dng protein, Phosphorus, ... ca phytase t nm mc c kim tra Ngoi tr mt trng hp l phytase c biu hin trong nm men H polymorpha cú s thay i giỏ tr pI axit rt rừ rt Tt c cỏc phytase ca nm mc, vi khun v thc vt ó c nghiờn cu cho n nay u cú giỏ tr pI axit, tr phytase ca nm A fumigatus cú pI l baz Phytase ca vi khun dng nh cú tớnh axớt yu hn phytase t nm mc, pI ca chỳng thng ln hn 6 trong khi ú phytase ca nm mc li cú giỏ tr pI di 5,5 Phytase. .. cerevisiae ó giỳp nõng cao tớnh chu nhit ca sn phm enzyme 2.2.2.4.2 pH ti u cho s hot ng ca phytase pH ca mụi trng nh hng rừ rt n phn ng enzyme vỡ nú nh hng n mc ion hoỏ c cht, enzyme v bn ca protein enzyme a s cỏc enzyme bn trong gii hn pH t 5 9 bn c enzyme i vi pH mụi trng cng cú th tng lờn khi cú c cht, coenzyme v Ca2+ pH ti u cho hot ng ca phytase thu c t cỏc ngun khỏc nhau rt khỏc nhau pH... bự p s thiu ht Phosphorus trong thc n do kh nng tiờu hoỏ thp Phosphorus trong protein thc vt, cỏc nh mỏy thc n thng b sung 1 - 2% Dicalci phosphate (DCP) Hu qu l hm lng Phosphorus trong thc n rt cao lờn n 2 - 3 ln nhu cu Phosphorus ca vt nuụi iu ny dn n Phosphorus thi ra trong phõn tng cao a n lm gia tng hm lng Phosphorus trong mụi trng nc Hin tng n hoa ca to cú tỏc nhõn t s phỳ dng Phosphorus trong... t 50 60 0C, trong khi phytase ca Aerobacter aerogenes cú nhit ti u ch l 250C Bờn cnh ú vn cú nhng phytase cú tớnh chu nhit cao nh l phytase ca chng S castellii hot ng ti u 770C, nú cú th n nh hot tớnh trong 1 gi 740C v phytase ca chng A adeninivoans cú hot tớnh phytase ti u 750C Theo tỏc gi Nakamura, phytase ca nm men P spartinae cú tớnh chu nhit cao t 75 800C, ngc li phytase ca chng P rhodanensis... Nhng thụng tin liờn quan n s hp th phosphorus ca cỏ v cỏc loi giỏp xỏc thỡ khỏ hn ch S hp th phosphorus qua mụi trng nc ca cỏ ó c xỏc nh [18] mc dự s lng phosphorus ỏng k khụng c hp th theo cỏch ny bi vỡ trong nc bin v nc ngt hm lng phosphorus thp Nhỡn chung nng phosphorus trong nc cũn thp bi vỡ s hp thu phosphorus thụng qua thc n rut thỡ rt l cn thit tho món nhu cu trao i cht S d tr v thu nhn thc... trong nhng nm gn õy Nhng n lc ny tp trung vo vic s dng phosphorus trong thc n v / hoc hn ch s thi phosphorus trong quỏ trỡnh ỏp ng s trao i cht ca vi sinh vt[14] SVTH: Vừ Th T Nga 26 Lun vn tt nghip GVHD: ThS Nguyn Vn Nguyn CHNG 3: VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 3.1 Vt liu v thit b nghiờn cu 3.1.1 Vt liu nghiờn cu 3.1.1.1 Enzyme phytase thng mi - Enzyme phytase thuc hóng Sigma (M) vi nng 0,03 U/mg - c tớnh