LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG NUÔI CẤY MÔ SẸO CÂY KIM NGÂN (Lonicera japonica Thunb.)

Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo MỤC LỤC CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 1.1.Đặt vấn đề 1 1.2.Mục đích và nội dung nghiên cứu 1 1.2.1.Mục đích 1 1.2.2.Nội dung nghiên cứu 1 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 2.1.Khái niệm chung về các hợp chất tự nhiên 2 2.1.1.Khái niệm 2 2.1.2.Phân loại 2 2.2.Khái niệm chung về Thin layer chromatography (TLC) 14 2.2.1.Tổng quát về TLC 14 2.3.Nuôi cấy mô tế bào thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp 22 2.3.1.Khái niệm 22 2.3.2.Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật 23 2.3.3.Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học 27 Bảng 2.2 Các hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuôi cấy mô và tế bào thực vật (Mulbagal and Tsay 2004) 30 2.4.Giới thiệu chung về Kim ngân hoa 33 2.4.1.Mô tả cây 33 2.4.2.Phân bố, thu hái và chế biến 34 2.4.3.Thành phần hóa học 34 2.4.4.Tác dụng dược lý 35 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 37 3.1.Thời gian và địa điểm thí nghiệm 37 3.2.Vật liệu 37 3.2.1.Đối tượng nghiên cứu 37 3.2.2.Trang thiết bị và dụng cụ 38 3.2.3.Các loại hóa chất sử dụng 38 3.3.Phương pháp thí nghiệm 38 i Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 3.3.1.Thí nghiệm 1:cảm ứng tạo mô sẹo 38 3.3.1.1.Khử trùng mẫu lá 38 3.3.1.2.Cảm ứng tạo mô sẹo 39 3.3.2.Chuẩn bị mẫu 39 3.3.3.Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid trong cây Kim ngân bằng phương pháp thử nghiệm sinh hóa 40 3.3.4.Thí nghiệm 3: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 40 3.3.5.Thí nghiệm 4: khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân 42 3.3.5.1.Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân bằng phương pháp khuếch tán qua vòng giấy lọc 42 3.3.5.2.Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch 43 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 4.1.Thí nghiệm 1: cảm ứng mô sẹo 45 4.2. Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và sapoin triterpenoid bằng phương pháp trắc nghiệm sinh hóa 48 4.2.1.Khảo sát sự hiện diện của flavonoid 48 4.2.1.1.Tác dụng với H2SO4 đậm đặc 48 4.2.1.2.Tác dụng với FeCl3 5% trong ethanol 49 4.2.1.3.Phản ứng Cyanidin của Wilstatter 50 4.2.1.4.Kết luận sơ bộ 52 4.2.2.Khảo sát sự hiện diện của triterpenoid saponin bằng phản ứng Liebermann-Burchard 53 4.3.Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 55 4.3.1.Khảo sát sự hiện diện flavonoid 55 4.3.2.Khảo sát sự hiện diện triterpenoid 58 4.4. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân 61 ii Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 4.4.1.Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân bằng phương pháp khuếch tán qua vòng giấy lọc 61 4.4.2.Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch 62 4.4.2.1.Đối với E.coli 63 4.4.2.2.Đối với Samonela 64 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 5.1.Kết luận 66 5.2. Kiến nghị 67 CHƯƠNG 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 ii Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ra một bước tiến xa trong khoa học thực vật. Việc phát triển và sử dụng các công cụ di truyền cũng như sự hiểu biết ngày càng sâu sắc hơn về bản chất của tế bào và các phương thức điều hòa quá trình chuyển hóa trao đổi chất là cơ sở cho việc sản xuất chúng ở quy mô thương mại. Do nhu cầu sử dụng các sản phẩm tự nhiên trong y dược ngày càng tăng nhưng sản lượng của chúng ở cây trồng tự nhiên lại rất thấp đã thúc đẩy sự phát triển không ngừng của công nghệ nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn. Tuy nhiên, các con đường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn trong thực vật cũng như trong nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn là rất phức tạp. Vì vậy, các thông tin ở mức độ tế bào và phân tử của các quá trình chuyển hóa là rất cần thiết cho sự phát triển của sản xuất công nghiệp. Nhiều nghiên cứu được đã thực hiện ở các điều kiện khác nhau để giải thích các hiện tượng xuất hiện trong quá trình sản xuất các chất trao đổi thứ cấp từ các tế bào thực vật nuôi cấy in vitro. Các kết quả này cũng cho thấy các hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật có tiềm năng rất lớn cho việc khai thác thương mại các chất trao đổi thứ cấp. 1.2. Mục đích và nội dung nghiên cứu 1.2.1. Mục đích Bước đầu khảo sát một vài hợp chất có hoạt tính sinh học có trong mẫu mô sẹo, hoa, cành lá của Kim ngân hoa và thử hoạt tính của chúng lên hai chủng vi khuẩn E.coli và Samonella. Từ đó tạo tiền đề cho những nghiên cứu tách chiết và phân lập các chất có giá trị dược lý trong mô sẹo, hoa, cành lá Kim ngân làm nguyên liệu phục vụ cho nghành công nghiệp dược. 1.2.2. Nội dung nghiên cứu 1 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Bước đầu khảo sát hai hợp chất có hoạt tính sinh học được biết nhiều trong Kim ngân hoa là saponin triterpenoid và flavonoid bằng hai phương pháp: trắc nghiệm sinh hóa và sắc ký lớp mỏng (TLC). Thử hoạt tính dịch chiết của mô sẹo, hoa đối với hai chủng vi khuẩn E.coli và Samonella. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Khái niệm chung về các hợp chất tự nhiên 2.1.1. Khái niệm Hợp chất tự nhiên, là chất biến dưỡng thứ cấp, có trọng lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bởi cơ thể của một sinh vật. Chất biến dưỡng thứ cấp có thể cần thiết hoặc nhiều khi không cần thiết cho sự sống của sinh vật, điều này khác với những hợp chất đại phân tử như protein, acid nucleic, polysacchride là những hợp chất căn bản cần thiết đối với sự sống của mỗi sinh vật. (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh). 2.1.2. Phân loại 2 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Các chất biến dưỡng thứ cấp bao gồm nhiều loại hợp chất và được sắp xếp thành những nhóm khác nhau. Việc phân loại các hợp chất thành một nhóm thường không phải bởi một định nghĩa duy nhất, cũng như ranh giới của một nhóm thường không rõ ràng. 2.1.2.1. Alkaloid Alkaloid là những hợp chất có tính base yếu, do sự có mặt của nguyên tử nitơ. Tính base của các alkaloid cũng khác nhau tùy theo sự hiện diện của các nhóm thế R (mang các nhóm chức khác nhau) gắn trên nguyên tử nito. Các alkaloid chia thành ba loại:  Alkaloid thật: là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính base, thường được sinh tổng hợp từ amino acid, phân bố giới hạn trong thực vật và hiện diện trong cây dưới dạng muối của một acid hữu cơ.  Protoalkaloid được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả mescalin và N, N–dimetyltryptamin. Chúng là những amin đơn giản, được tổng hợp từ các amino acid, trong đó nguyên tử nitơ không ở trong vòng dị hoàn.  Giả alkaloid là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino acid, bao gồm hai nhóm hợp chất lớn là alkaloid steroid và alkaloid terpenoid. 2.1.2.2. Flavonoid  Khái niệm Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật. Hơn một nữa rau quả thường dùng có chứa flavonoid. Flavonoid cũng là thành phần hay gặp trong dược liệu có nguồn gốc từ thực vật. Cho đến nay có khoảng 4.000 chất đã được xác định cấu trúc. Chỉ riêng 2 nhóm flavon và flavonol và với nhóm thế là -OH và / hoặc -OCH 3 thì theo lý thuyết có thể gặp 38.627 chất. Phần lớn các chất flavonoid có màu vàng (flavonoid do từ flavus có nghĩa là màu vàng). Tuy nhiên một số có màu xanh, tím, đỏ, một số khác lại không có màu cũng thuộc nhóm flavonoid. Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác không thuộc flavonoid nhưng lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon.  Cấu trúc hóa học Người ta xếp vào nhóm flavonoid những chất có cấu tạo khung theo kiểu C 6 – C 3 –C 6 hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon. 3 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Hình 2.1: khung cơ bản của flavonoid Người ta xem cấu trúc này gồm hai phần (được theo dõi bằng chất đồng vị): + C 6 – C 3 (tức là vòng B + 3C) phần này xuất phát từ acid shikimic dẫn đến các dẫn chất phenylpropanoid Hình 2.2: sơ đồ hình thành phenylpropanoid + C 6 hay là (vòng A) xuất phát từ 3 đơn vị acetat dẫn đến acid triacetic. Sau đó 2 phần được ghép lại tạo thành chalcone 4 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Hình 2.3: cấu tạo cơ bản của chalcone Phần lớn các flavonoid có thể xem là các dẫn chất có gốc phenyl của các nhân trên. Đánh số thứ tự bắt đầu từ dị vòng, số 1 từ dị tố oxy rồi tiếp đến vòng A, vòng B đánh số phụ. Trường hợp không có vòng C (nghĩa là mạch 3C hở) ví dụ trường hợp chalcon thì đánh số bắt đầu từ vòng B, vòng A đánh số phụ. Hình 2.4: cấu tạo cơ bản của flavan  Phân loại flavonoid Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hóa của mạch 3C. Người ta chia ra: Euflavonoid là các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C – 2, isoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C – 3, neoflavonoid có gốc ary ở vị trí C – 4. Người ta còn phân biệt biflavanoid là những flavonoid dimer, triflavonoid cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid, flavolignan là những flavonoid mà phân tử có một phần cấu trúc ligan.  Euflavonoid: bao gồm các nhóm: anthocyanidin, flavan, flavan 3–ol flavan 4– ol, 3,4–diol, flavanon, 3–hydroxy flavanon, flavon, flavonol, dihydrochalcon, chalcon, auron.  Isoflavonoid: bao gồm nhiều nhóm khác nhau: isoflavan, isoflav-3–ene, isoflavan – 4 –ol, isoflavanon, isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3– arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, dihyroisochalcon, homoisoflavon. Isoflavonoid thường gặp trong họ Đậu – Fabaceac. 5 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo  Neoflavonoid chỉ có giới hạn trong một số loài thực vật, bao gồm: 4– arylchrroman, 4–arylcoumarin, dalbergion.  Biflavonoid và triflavonoid: những flavonoid dimer và trimer. Những hợp chất này được gọi là proanthocyanidin. Ở đây những biflavonoid tạo thành từ flavon, flavanon, dihydroflavonol–chalcon, dihydro chalcon, auron, isoflavon.  Sự phân bố flavnoid trong thực vật Trong thực vật bậc thấp flavonoid ít được gặp. Trong ngành rêu chỉ phát hiện được rất ít chất. Trong dương xỉ số lượng flavonoid ít nhưng đều có mặt các nhóm anthocyanin, flavanon, flavon, flavonol, chalcon, dihydrochalcon. Ngành hạt trần có khoảng 700 loài, 20 họ, số lượng flavnoid cũng không nhiều nhưng cũng đủ các nhóm anthocyanidin, leucoanthocyanidin, flavanon, flavon, flavonol, isoflavon. Nét đặc trưng của nghành hạt trần có khác thực vật bậc thấp và ngành hạt kín ở chỗ sự hiện diện của nhiều dẫn chất biflavonoid. Flavonoid tập trung chủ yếu vào ngành hạt kín ở lớp 2 lá mầm. Có rất nhiều họ chứa flavonoid và đủ các loại flavonoid. Tuy nhiên cũng có một vài nét đặc trưng cho một số họ ví dụ họ Asteraceae là một họ lớn với 15.000 loài, 1000 chi, có rất nhiều dẫn xuất thuộc các nhóm khác nhau. Tuy nhiên, một số chi có nét đặc trưng riêng của nó, ví dụ trong các chi Carthamus, Coreopsis, Cosmos, Dahlia thì hay gặp các dẫn chất chalcon và auron. Chi Gymnosperma, Ageratum thì gặp các dẫn chất flavon và flavonol có nhiều nhóm thế có oxy (có thể đến 8 nhóm). Họ Fabaceae thì hay gặp các chất thuộc nhóm isoflavonoid. Họ Rutaceae thường gặp các flavon và flavonol có nhiều nhóm methoxy. Họ Theaceae hay gặp các flavan–3–ol. Họ Ranunculaceae và Paeoniaceae hay gặp dẫn chất flavonol 3,7 diglycosid. Họ Rosaceae chi Rubrus và Prunus ở trong quả hay gặp anthocyanin có mạch đường phân nhánh. Họ Polygonaceae ở chi Hydropiper hay gặp các flavon và flavonol sulfat. Lớp một lá mầm có 53 họ nhưng cho đến nay chỉ khoảng trên 10 họ tìm thấy có flavonoid: Amaryllidaceae, Araceae, Cannaceae, Commelinaceae, Iridaceae, Lemnaceae, Liliaceae, Musaceae, Oridaceae, Poaceae. 6 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Hàm lượng và cả thành phần flavonoid trong cây phụ thuộc vào nơi mọc. Cây mọc ở vùng nhiệt đới và núi cao thì hàm lượng cao hơn ở nơi cây thiếu ánh sáng. Hình 2.5: sơ đồ sinh tổng hợp flavonoid  Tính chất Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt có khi không có màu (trường hợp các nhóm OH đã methyl hóa), flavonol vàng nhạt đến vàng, chalcon và auron vàng đậm, đến đỏ cam. Các chất thuộc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanon, flavanonol, leuco–anthocyanidin, flavan–3–ol do không có nối đôi liên hiệp giữa vòng B với nhóm carbonyl nên không màu. Các dẫn chất anthocyanidin thì màu thay đổi tùy theo pH của môi trường. Tuy nhiên khi các flavonoid ở trong các bộ phận của cây thì còn phụ thuộc vào hỗn hợp với các sắc tố khác. Độ tan không giống nhau, thường flavonoid glycosid và flavonoid sulfat là những hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan được trong nước tốt nhất là cồn. Các aglycon flavonoid thì tan được trong dung môi hữu 7 [...]... cam thảo, thiên môn, mạch môn,… Một số dược liệu chưa saponin có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải, - thiên môn, mạch môn,… Saponin có mặt trong một số vị thuốc bổ như nhân sâm, tam thất và một số - cây thuộc họ nhân sâm khác Saponin làm tăng sự thấm của tế bào: sự có mặt của saponin sẽ làm cho các - hoạt chất khác dễ hòa tan và hấp thu Một số saponin có tác dụng chống viêm Một số có tác dụng kháng... cryptotanshinone trong nuôi cấy mô sẹo S.miltiorrhiza đã được khảo sát Mô sẹo sơ cấp được tạo ra từ nuôi cấy mảnh lá ở trong tối trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D Mô sẹo sau đó phát triển nhanh hơn trên môi trường có 1,0 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA Kết quả phân tích HPLC cho thấy mô sẹo chứa một lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối lượng khô) Loại bỏ 2,4-D khỏi môi trường nuôi cấy cho kết quả là... phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất Sử dụng các elicitor sinh học và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thích 26 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo hình thành các hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao (DiCosmo và Tallevi, 1985) 2.3.3 Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong. .. nuôi cấy ở điều kiện 25 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo tối ưu Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có thể gần như là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy • Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao Các tế bào thực vật trong nuôi cấy là một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong nuôi. .. sau 3 tuần nuôi cấy và lượng berberin đạt tới 1,2 g/L • Cung cấp tiền chất (precursor feeding) Bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp nội bào vào môi trường nuôi cấy cũng có thể tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số hợp chất trung gian nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng lượng sản phẩm cuối cùng Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành... chấm mẫu chất lên mỗi bản; mỗi bản giải ly với một hệ dung môi giải ly khác nhau, cần phải dò tìm mới có thể chọn ra được một hệ dung môi phù hợp làm rải các hợp chất ra trên cùng một bản mỏng Nhìn số lượng các vết hiện trên bản để đoán biết mẫu ban đầu có chứa bao nhiêu hợp chất Lưu ý: do bản mỏng có độ phân giải thấp cho nên nhìn thấy một vết trên bản mỏng không có nghĩa đó là một chất, mà đó có thể... do mẫu nuôi cấy tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ xung quanh dẫn đến việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật vì có thể duy trì và thao tác tương tự với các hệ thống lên men vi sinh vật ngập chìm trong môi trường lỏng 2.3.2 Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật 23 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Sự tiến bộ vượt bậc của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô và... nhiều phương pháp khác nhau trong nỗ lực tập trung vào việc kích thích hoạt động sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy (Rao, 2000; Dixon, 1999) Tế bào nuôi cấy tích lũy một lượng lớn hợp chất thứ cấp chỉ khi ở những điều kiện đặc biệt như: + Chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp + Chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao + Bổ sung tiền chất nuôi cấy và các chất kích kháng bảo vệ thực... thế kỷ 20 như là một công cụ hữu ích để nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật Kỹ thuật này được phát triển với mục tiêu cải thiện hiệu suất các sản phẩm có hoạt tính sinh học Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên những lý do sau: + Tổng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với... nuôi cấy phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi thành phần môi trường (Misawa, 1994) Bên cạnh nuôi cấy huyền phù tế bào, nuôi cấy mô sẹo (trên môi trường rắn) có ưu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu nhưng nhược điểm là thể tích nuôi cấy ít nên khó phát triển ở quy mô công nghiệp, mẫu nuôi cấy chỉ tiếp xúc được một mặt với nguồn dinh