khảo sát một số hợp chất có hoạt tính sinh học trong nuôi cấy mô sẹo cây kim ngân (lonicera japonica thumb)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH o0o ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG NUÔI CẤY MÔ SẸO CÂY KIM NGÂN (Lonicera japonica Thunb.) Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số ngành : 111 GVHD: CN. BÙI VĂN THẾ VINH SVTH : NGUYỄN THỊ THU THẢO Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐẠI HỌC KTCN ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC KHOA: MT và CNSH NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC HỌ VÀ TÊN: NGUYỄN THỊ THU THẢO MSSV: 106111032 NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP: 06DSH 1. Đầu đề Đồ án tốt nghiệp: KHẢO SÁT MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG NUÔI CẤY MÔ SẸO CÂY KIM NGÂN (Lonicera japonica Thunb.) 2. Nhiệm vụ Đồ án tốt nghiệp:  Bước đầu khảo sát hai hợp chất có hoạt tính sinh học được biết nhiều trong Kim ngân hoa là saponin triterpenoid và flavonoid bằng hai phương pháp: trắc nghiệm sinh hóa và sắc ký lớp mỏng (TLC).  Thử hoạt tính dịch chiết của mô sẹo, hoa đối với hai chủng vi khuẩn E.coli và Samonella. 3. Ngày giao Đồ án tốt nghiệp: 05/04/2010 4. Ngày hoàn thành Đồ án tốt nghiệp: 28/06/2010 5. Họ và tên người hướng dẫn CN. Bùi Văn Thế Vinh Nội dung và yêu cầu LVTN đã được thông qua Bộ môn. Ngày……. Tháng…… năm 2010 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN (Ký và ghi rõ họ tên) PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN Người duyệt (chấm sơ bộ): ……………………………………… Đơn vị: …………………………… ……………………………… Ngày bảo vệ: …………………………………………………… Điển tổng kết: …………………………………………………… Nơi lưu trữ Đồ án tốt nghiệp: …………………………………… Phần hướng dẫn Toàn bộ NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH (Ký và ghi rõ họ tên) Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo Lời cảm ơn Em xin chân thành cảm ơn:  Ban giám hiệu nhà trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả các quý thầy cô đã truyền đạt kiến cho em trong suốt quá trình học tập.  Thầy Bùi Văn Thế Vinh đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.  Các thầy cô tại Phòng Thí nghiệm khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh học thuộc trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành đồ án.  Cha mẹ đã suốt đời tận tụy để con có được ngày hôm nay.  Tập thể lớp 06DSH và bạn Mỹ lớp 07DSH đã gắn bó, giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm đại học. Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thu Thảo Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo i MỤC LỤC CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích và nội dung nghiên cứu 1 1.2.1. Mục đích 1 1.2.2. Nội dung nghiên cứu 2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Khái niệm chung về các hợp chất tự nhiên 3 2.1.1. Khái niệm 3 2.1.2. Phân loại 3 2.2. Khái niệm chung về Thin layer chromatography (TLC) 15 2.2.1. Tổng quát về TLC 15 2.3. Nuôi cấy mô tế bào thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp 25 2.3.1. Khái niệm 25 2.3.2. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật 26 2.3.3. Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học 29 2.4. Giới thiệu chung về Kim ngân hoa 37 2.4.1. Mô tả cây 37 2.4.2. Phân bố, thu hái và chế biến 37 2.4.3. Thành phần hóa học 38 2.4.4. Tác dụng dược lý 39 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 41 3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm 41 3.2. Vật liệu 41 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu 41 3.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ 41 3.2.3. Các loại hóa chất sử dụng 41 3.3. Phương pháp thí nghiệm 42 3.3.1. Thí nghiệm 1:cảm ứng tạo mô sẹo 42 3.3.1.1.Khử trùng mẫu lá 42 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo ii 3.3.1.2.Cảm ứng tạo mô sẹo 42 3.3.2. Chuẩn bị mẫu 43 3.3.3. Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid trong cây Kim ngân bằng phương pháp thử nghiệm sinh hóa 43 3.3.4. Thí nghiệm 3: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 44 3.3.5. Thí nghiệm 4: khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân 45 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 4.1. Thí nghiệm 1: cảm ứng mô sẹo 49 4.2. Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và sapoin triterpenoid bằng phương pháp trắc nghiệm sinh hóa 51 4.2.1. Khảo sát sự hiện diện của flavonoid 51 4.2.2. Khảo sát sự hiện diện của triterpenoid saponin 57 4.3. Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 59 4.3.1. Khảo sát sự hiện diện flavonoid 59 4.3.2. Khảo sát sự hiện diện triterpenoid 62 4.4. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân 65 4.4.1. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân bằng phương pháp khuếch tán qua vòng giấy lọc 65 4.4.2. Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch 67 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 5.1. Kết luận 71 5.2. Kiến nghị 72 CHƯƠNG 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 1 CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ra một bước tiến xa trong khoa học thực vật. Việc phát triển và sử dụng các công cụ di truyền cũng như sự hiểu biết ngày càng sâu sắc hơn về bản chất của tế bào và các phương thức điều hòa quá trình chuyển hóa trao đổi chất là cơ sở cho việc sản xuất chúng ở quy mô thương mại. Do nhu cầu sử dụng các sản phẩm tự nhiên trong y dược ngày càng tăng nhưng sản lượng của chúng ở cây trồng tự nhiên lại rất thấp đã thúc đẩy sự phát triển không ngừng của công nghệ nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn. Tuy nhiên, các con đường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn trong thực vật cũng như trong nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn là rất phức tạp. Vì vậy, các thông tin ở mức độ tế bào và phân tử của các quá trình chuyển hóa là rất cần thiết cho sự phát triển của sản xuất công nghiệp. Nhiều nghiên cứu được đã thực hiện ở các điều kiện khác nhau để giải thích các hiện tượng xuất hiện trong quá trình sản xuất các chất trao đổi thứ cấp từ các tế bào thực vật nuôi cấy in vitro. Các kết quả này cũng cho thấy các hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật có tiềm năng rất lớn cho việc khai thác thương mại các chất trao đổi thứ cấp. 1.2. Mục đích và nội dung nghiên cứu 1.2.1. Mục đích Bước đầu khảo sát một vài hợp chất có hoạt tính sinh học có trong mẫu mô sẹo, hoa, cành lá của Kim ngân hoa và thử hoạt tính của chúng lên hai chủng vi khuẩn E.coli và Samonella. Từ đó tạo tiền đề cho những nghiên cứu tách chiết và phân lập các chất có giá trị dược lý trong mô sẹo, hoa, cành lá Kim ngân làm nguyên liệu phục vụ cho nghành công nghiệp dược. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 2 1.2.2. Nội dung nghiên cứu Bước đầu khảo sát hai hợp chất có hoạt tính sinh học được biết nhiều trong Kim ngân hoa là saponin triterpenoid và flavonoid bằng hai phương pháp: trắc nghiệm sinh hóa và sắc ký lớp mỏng (TLC). Thử hoạt tính dịch chiết của mô sẹo, hoa đối với hai chủng vi khuẩn E.coli và Samonella. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 3 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Khái niệm chung về các hợp chất tự nhiên 2.1.1. Khái niệm Hợp chất tự nhiên, là chất biến dưỡng thứ cấp, có trọng lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bởi cơ thể của một sinh vật. Chất biến dưỡng thứ cấp có thể cần thiết hoặc nhiều khi không cần thiết cho sự sống của sinh vật, điều này khác với những hợp chất đại phân tử như protein, acid nucleic, polysacchride là những hợp chất căn bản cần thiết đối với sự sống của mỗi sinh vật. (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh). 2.1.2. Phân loại Các chất biến dưỡng thứ cấp bao gồm nhiều loại hợp chất và được sắp xếp thành những nhóm khác nhau. Việc phân loại các hợp chất thành một nhóm thường không phải bởi một định nghĩa duy nhất, cũng như ranh giới của một nhóm thường không rõ ràng. 2.1.2.1. Alkaloid Alkaloid là những hợp chất có tính base yếu, do sự có mặt của nguyên tử nitơ. Tính base của các alkaloid cũng khác nhau tùy theo sự hiện diện của các nhóm thế R (mang các nhóm chức khác nhau) gắn trên nguyên tử nito. Các alkaloid chia thành ba loại:  Alkaloid thật: là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính base, thường được sinh tổng hợp từ amino acid, phân bố giới hạn trong thực vật và hiện diện trong cây dưới dạng muối của một acid hữu cơ.  Protoalkaloid được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả mescalin và N, N–dimetyltryptamin. Chúng là những amin đơn giản, được tổng hợp từ các amino acid, trong đó nguyên tử nitơ không ở trong vòng dị hoàn.  Giả alkaloid là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino acid, bao gồm hai nhóm hợp chất lớn là alkaloid steroid và alkaloid terpenoid. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 4 2.1.2.2. Flavonoid  Khái niệm Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật. Hơn một nữa rau quả thường dùng có chứa flavonoid. Flavonoid cũng là thành phần hay gặp trong dược liệu có nguồn gốc từ thực vật. Cho đến nay có khoảng 4.000 chất đã được xác định cấu trúc. Chỉ riêng 2 nhóm flavon và flavonol và với nhóm thế là -OH và / hoặc -OCH 3 thì theo lý thuyết có thể gặp 38.627 chất. Phần lớn các chất flavonoid có màu vàng (flavonoid do từ flavus có nghĩa là màu vàng). Tuy nhiên một số có màu xanh, tím, đỏ, một số khác lại không có màu cũng thuộc nhóm flavonoid. Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác không thuộc flavonoid nhưng lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon.  Cấu trúc hóa học Người ta xếp vào nhóm flavonoid những chất có cấu tạo khung theo kiểu C 6 – C 3 –C 6 hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon. Hình 2.1: khung cơ bản của flavonoid Người ta xem cấu trúc này gồm hai phần (được theo dõi bằng chất đồng vị): + C 6 – C 3 (tức là vòng B + 3C) phần này xuất phát từ acid shikimic dẫn đến các dẫn chất phenylpropanoid Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo 5 Hình 2.2: sơ đồ hình thành phenylpropanoid + C 6 hay là (vòng A) xuất phát từ 3 đơn vị acetat dẫn đến acid triacetic. Sau đó 2 phần được ghép lại tạo thành chalcone Hình 2.3: cấu tạo cơ bản của chalcone Phần lớn các flavonoid có thể xem là các dẫn chất có gốc phenyl của các nhân trên. Đánh số thứ tự bắt đầu từ dị vòng, số 1 từ dị tố oxy rồi tiếp đến vòng A, vòng B đánh số phụ. Trường hợp không có vòng C (nghĩa là mạch 3C hở) ví dụ trường hợp chalcon thì đánh số bắt đầu từ vòng B, vòng A đánh số phụ. [...]... thảo, thiên môn, mạch môn,… - Một số dược liệu chưa saponin có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải, thiên môn, mạch môn,… - Saponin có mặt trong một số vị thuốc bổ như nhân sâm, tam thất và một số cây thuộc họ nhân sâm khác - Saponin làm tăng sự thấm của tế bào: sự có mặt của saponin sẽ làm cho các hoạt chất khác dễ hòa tan và hấp thu - Một số saponin có tác dụng chống viêm Một số có tác dụng kháng... tự nhiên khi được nuôi cấy ở điều kiện tối ưu Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có thể gần như là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy  Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao Các tế bào thực vật trong nuôi cấy là một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong nuôi cấy đã được Berlin và... mẫu nuôi cấy tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ xung quanh dẫn đến việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật vì có thể duy trì và thao tác tương tự với các hệ thống lên men vi sinh vật ngập chìm trong môi trường lỏng 2.3.2 Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật Sự tiến bộ vượt bậc của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật giúp nhân giống các cây trồng có. .. tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi thành phần môi trường (Misawa, 1994) Bên cạnh nuôi cấy huyền phù tế bào, nuôi cấy mô sẹo (trên môi trường rắn) có ưu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu nhưng nhược điểm là thể tích nuôi cấy ít nên khó phát triển ở quy mô công nghiệp, mẫu nuôi cấy chỉ tiếp xúc được một mặt... các hợp chất thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ chống lại các yếu tố gây bệnh Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp Sử dụng các elicitor của bộ máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất Sử dụng các elicitor sinh học và phi sinh học. .. tiền chất của quá trình sinh tổng hợp nội bào vào môi trường nuôi cấy cũng có thể tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số hợp chất trung gian nhanh chóng bắt đầu sinh 28 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng lượng sản phẩm cuối cùng Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành rẻ Tăng cường kích thích hoặc bổ sung tiền chất hoặc các hợp. .. nhiều phương pháp khác nhau trong nỗ lực tập trung vào việc kích thích hoạt động sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy (Rao, 2000; Dixon, 1999) Tế bào nuôi cấy tích lũy một lượng lớn hợp chất thứ cấp chỉ khi ở những điều kiện đặc biệt như: + Chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp + Chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao + Bổ sung tiền chất nuôi cấy và các chất kích kháng bảo vệ thực... tốt Có thể, Rất tốt định tính Hiệu quả Có thể tách chất định lượng Khả năng Có thể tách lượng nhưng rất lớn mẫu khó 2.2.1.2 Ưu điểm của TLC Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng, trong cùng điều kiện phân tích Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng; trong khi so với HPLC: những hợp chất có tính. .. trình nuôi cấy Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối có sự tiếp xúc với môi trường khác với các tế bào ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối tế bào để tạo thành các chất thứ cấp (Lee, 2001) Nuôi cấy huyền phù tế bào thường khởi đầu bằng cách đặt các khối mô sẹo dễ vỡ vụn trong môi... thế kỷ 20 như là một công cụ hữu ích để nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật Kỹ thuật này được phát triển với mục tiêu cải thiện hiệu suất các sản phẩm có hoạt tính sinh học Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên những lý do sau: + Tổng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với . KHẢO SÁT MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG NUÔI CẤY MÔ SẸO CÂY KIM NGÂN (Lonicera japonica Thunb.) 2. Nhiệm vụ Đồ án tốt nghiệp:  Bước đầu khảo sát hai hợp chất có hoạt tính sinh. TẠO ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH o0o ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG NUÔI CẤY MÔ SẸO CÂY KIM NGÂN (Lonicera japonica. mại các chất trao đổi thứ cấp. 1.2. Mục đích và nội dung nghiên cứu 1.2.1. Mục đích Bước đầu khảo sát một vài hợp chất có hoạt tính sinh học có trong mẫu mô sẹo, hoa, cành lá của Kim ngân hoa