phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thích hình thành các hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao (DiCosmo và Tallevi, 1985).
2.3.3. Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học sinh học
Những năm gần đây, thuốc truyền thống trở thành một đề tài quan trọng mang tính toàn cầu. Mặc dù ở các nước phát triển người ta thường sử dụng tân dược trong điều trị nhưng các loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc vẫn được dùng phổ biến do yếu tố lịch sử và văn hóa. Theo các đánh giá về mặt khoa học, nhiều loài thảo mộc có thể ứng dụng trong y học. Vấn đề đặt ra là vùng sinh trưởng của cây thuốc đang biến mất nhanh chóng do sự không ổn định của điều kiện môi trường và các yếu tố khác. Như vậy, thật khó có một nguồn nguyên liệu đủ lớn để tách chiết các hợp chất thứ cấp dùng trong dược phẩm. Điều này cảnh báo cho ngành công nghiệp cũng như các nhà khoa học cần tính đến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật như một sự thay thế khác để cung cấp nguyên liệu cho nguồn dược phẩm này.
30
Ngay từ năm 1971, Wani và các cộng sự đã tìm ra một diterpene amide mới
có khả năng chống ung thư gọi là “taxol” chiết từ cây thông đỏ Pacific (Taxus brevifolia). Đến năm 1983, taxol được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa
Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư buồng trứng. Sau đó, FDA đã cho phép sử dụng taxol trong điều trị các trường hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú. Ngoài ra, taxol cũng có tác dụng đối với các bệnh nhân có khối u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu khác (Wickremesinhe và Arteca, 1993 và 1994), và nó được xem như là chất đầu tiên của một nhóm mới trong hóa trị liệu ung thư (Cragg và cs, 1993). Tuy nhiên, sử dụng taxol trong điều trị bị hạn chế do chỉ tách chiết được một lượng rất ít từ vỏ của cây thông đỏ tự nhiên. Lớp vỏ mỏng này chứa khoảng 0,001% taxol tính theo khối lượng khô. Ở cây 100 năm tuổi trung bình chỉ thu được 3 kg vỏ (khoảng 300 mg taxol), lượng này ứng với một liều trong toàn đợt điều trị ung thư. Sở dĩ nguồn taxol khan hiếm như vậy là do các cây tự nhiên sinh trưởng rất chậm (Cragg và cs 1993). Do đó, cần có những nguồn khác để thay thế mới đáp ứng được nhu cầu sử dụng ngày càng tăng trong y học.
Nuôi cấy tế bào các loài Taxus được xem như là một phương pháp ưu thế để
cung cấp ổn định nguồn taxol và dẫn xuất taxane của nó (Slichenmyer và Von Hoff,
1991). Hiện nay, việc sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào các loài Taxus đã trở thành
một trong những ứng dụng rộng rãi của nuôi cấy tế bào thực vật và đang tạo ra các giá trị thương mại to lớn. Fett-Neto và cs (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các
chất dinh dưỡng và một số yếu tố khác lên sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào T. cuspidata. Srinivasan và cs (1995) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào của T. baccata. Lee và cs (1995) đã nghiên cứu sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây T. mairei, một loài được tìm thấy tại Đài Loan ở độ cao
2000 m so với mực nước biển. Các dòng tế bào thu được từ mô sẹo có nguồn gốc thân và lá, và một trong những dòng này sau khi được bổ sung các tiền chất vào môi trường nuôi cấy, thì sau 6 tuần cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ có khoảng 200 mg taxol.
Tsay và cộng sự (1994) đã nghiên cứu sản xuất imperatorin từ nuôi cấy tế bào
31
lâu năm ở Đài Loan, được sử dụng để chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến. Imperatorin được xem là thành phần hoạt động chính trong điều trị các bệnh về da.
Nếu sản xuất cây Angelica dahurica var. formosana bằng phương pháp nhân giống
truyền thống sẽ mất một thời gian dài mới có thể đáp ứng được nhu cầu. Vì vậy, phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù sản xuất imperatorin đã được chọn lựa sử dụng. Nghiên cứu đã cho thấy trong chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù, sản phẩm imperatorin đạt giá trị cực đại trong khoảng giữa 10 và 14 ngày. Benzylamino purine ở nồng độ từ 0,5-1,0 mg/L đã kích thích tổng hợp imperatorin, một tỷ lệ thích hợp ammonium nitrate và nitrate (2:1) cũng như tăng nồng độ phosphate từ 1-2 mM sẽ làm tăng lượng impertatorin. Glucose là nguồn carbon tốt hơn saccharose và fructose về hiệu quả sản xuất imperatorin. Vai trò của elicitor cũng đã được khảo sát, bổ sung thêm vanadyl sulphate trong môi trường sẽ tăng tích lũy imperatorin, quyết định nồng độ và thời gian sinh trưởng của tế bào. Bổ sung vanadyl sulphate ở nồng độ 30 mg/L vào môi trường đã cho hiệu quả tốt nhất sau 10 ngày nuôi cấy. Hoặc bổ sung 20 g/L chất hấp phụ amberlite XAD-7 vào môi trường, quá trình tổng hợp imperatorin cũng tăng mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 10. Hàm lượng imperatorin sản xuất bởi phương thức này đạt 460 μg khối lượng tươi cao hơn đối chứng 140 lần.
Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong hệ rễ của cây Coptis japonica và vỏ của cây Phellondendron amurense. Berberine chloride được sử dụng để chữa bệnh rối loạn tiêu hóa. Để thu được nguyên liệu thô từ rễ cây Coptis phải mất 5-6
năm. Yamada và Sato (1980) đã chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất berberine
cao của loài (1981) C. japonica. Sau đó, công ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản) đã cải
thiện được năng suất bằng cách thêm 10-8 M gibberellic acid vào môi trường, hiệu xuất berberine đã tăng lên rất nhiều tới 1.66 g/l (Misawa 1994).
Rễ của cây Panax ginseng, một loại thảo dược lâu năm còn gọi là nhân sâm
được sử dụng rộng rãi như một vị thuốc bổ, một dược phẩm quý giá, có tác dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, bệnh đái đường, suy nhược cơ thể. Trong rễ của nó chứa nhiều loại saponin và sapogenin khác nhau. Trong đó, ginsenoside-Rb có hoạt tính an thần, còn Rg có hoạt tính kích thích. Từ 1973, Furuya và cs đã nuôi cấy mô mô
32
cứu nuôi cấy P. ginseng trên quy mô công nghiệp. Đến nay, đây là một trong các đối tượng được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất.
Merkli và cs (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum bằng cách gây nhiễm chủng A4 của Agrobacterium rhizogenes. Các rễ tơ này đã sản
xuất diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp (semi-synthesis) của các hormone steroid. Hàm lượng diosgenin thu được cao nhất là 0,040 % khối lượng khô gần gấp 2 lần so với các rễ không biến nạp chủng A4 8 tháng tuổi (0,024 %). Các tác giả này đã nghiên cứu ảnh hưởng của cholesterol, pH môi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin. Kết quả cho thấy bổ sung 40 mg/L chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ tăng hàm lượng diosgenin lên gấp 3 lần so với đối chứng.
Yeh và cs (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào huyền
phù của cây Dioscorea doryophora. Phương pháp này được sử dụng như một cách
thay thế quá trình tổng hợp steroid. Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lập bằng cách đưa mô sẹo vào môi trường có 0,2 mg/L 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4- D). Nồng độ saccharose tối thích cho tổng hợp diosgenin là 3%. Lượng diosgenin thu được trong trường hợp này đạt tới 3,2% khối lượng khô. Sản xuất diosgenin từ cây (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
D. doryophora bằng nuôi cấy tế bào huyền phù hiện nay đã được ứng dụng trên quy
mô công nghiệp.
Gentiana davidii var. formosana là thảo mộc bản địa sống lâu năm ở Đài
Loan. Từ xưa nó đã được sử dụng như một loại thuốc thô sơ trong y học cổ truyền Trung Quốc nhằm ngăn chặn béo phì và lão hóa, bảo vệ phổi khỏi các chất độc (Zheng và cs 1997). Secoiridoid glycoside là hợp chất chính với đặc tính y học ở
trong rễ của chi Gentiana (Skrzypczak và cs 1993). Chueh và cs (2000) nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù của G. davidii var. formosa để sản
xuất gentipicroside và swertiamarin, hai dược chất quan trọng. Tế bào huyền phù sinh trưởng tối ưu khi nuôi cấy mô sẹo trong môi trường bổ sung 1,2 mg/L kinetin và 3% saccharose, pH 4,2-5,2, tốc độ lắc 80-100 vòng/phút. Sự tích lũy cao nhất 2 hợp chất swertiamarin và gentipicroside trong tế bào được xác định lần lượt sau 12 và 24 ngày nuôi cấy.
33
Miyasaka và cs (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuôi cấy
mô sẹo cây Salvia miltiorrhiza. Salvia là một chi quan trọng của họ Lamiaceae và một vài loài của Salvia mọc hoang dại trên khắp thế giới dùng làm thuốc dân gian.
Hiệu quả của BA đối với việc hình thành cryptotanshinone trong nuôi cấy mô sẹo
S.miltiorrhiza đã được khảo sát. Mô sẹo sơ cấp được tạo ra từ nuôi cấy mảnh lá ở
trong tối trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D. Mô sẹo sau đó phát triển nhanh hơn trên môi trường có 1,0 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA. Kết quả phân tích HPLC cho thấy mô sẹo chứa một lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối lượng khô). Loại bỏ 2,4-D khỏi môi trường nuôi cấy cho kết quả là lượng cryptotanshinone trong mô sẹo tăng lên. Nồng độ cao nhất của cryptotanshione thu được trong mô sẹo nuôi cấy trên môi trường có 0,2 mg/L BA trong 6 ngày là 4,59 mg/g khối lượng khô (Wu và cs, 2003).
Bảng 2.2 Các hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuôi cấy mô và tế bào thực vật (Mulbagal and Tsay 2004)
Loài thực vật Hợp chất thứ cấp Dạng nuôi cấy
Tham khảo
Agave amaniensis Saponins Mô sẹo Andrijany và cs 1999
Ailanthus altissima Alkaloids Huyền phù Anderson và cs 1987
Ailanthus altissima Canthinone alkaloids Huyền phù Anderson và cs 1986
Allium sativum Alliin Mô sẹo Malpathak và David 1986
Aloe saponaria Tetrahydroanthracene Huyền phù Yagi và cs 1983
Ambrosia tenuifolia Altamisine Mô sẹo Goleniowski và Trippi 1999
34
và Ellis 1985
Brucea javanica Canthinone alkaloids Huyền phù Liu và cs 1990
Bupleurum falcatum Saikosaponins Mô sẹo Wang và Huang 1982
Camellia sinensis Theamine, dẫn xuất của γ- glutamyl
Huyền phù Orihara và Furuya 1990
Canavalia ensiformis L-Canavanine Mô sẹo Ramirez và cs 1992
Capsicum annuum Capsaicin Huyền phù Johnson và cs 1990
Cassia acutifolia Anthraquinones Huyền phù Nazif và cs 2000 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Catharanthus roseus Indole alkaloids Huyền phù Moreno và cs 1993
Catharanthus roseus Catharanthine Huyền phù Zhao và cs 2001
Choisya ternata Furoquinoline alkaloids Huyền phù Sejourne và cs 1981
Chrysanthemum cinerariaefolium
Pyrethrins Mô sẹo Rajasekaran
và cs 1991 Chrysanthemum cinerariaefolium Chrysanthemic acid và pyrethrins Huyền phù Kuel và cs 1985
Cinchona L. Alkaloids Huyền phù Koblitz và cs 1983
Cinchona robusta Robustaquinones Huyền phù Schripsema và cs 1999
35
cs 1985
Cinchona succirubra Anthraquinones Huyền phù Barthe và cs 1987
Citrus sp. Naringin, Limonin Mô sẹo Barthe và cs 1987
Coffea arabica Caffeine Mô sẹo Waller và cs 1983
Cornus kousa Polyphenols Huyền phù Ishimaru và cs 1993
Corydalis ophiocarpa Isoquinoline alkaloids Mô sẹo Iwasa và Takao 1982
Croton sublyratus Plaunotol Mô sẹo Morimoto và Murai 1989
Cruciata glabra Anthraquinones Huyền phù Dornenburg và Knorr 1996
Cryptolepis buchanani Cryptosin Mô sẹo Venkateswara và cs 1987
Digitalis purpurea Cardenolides Huyền phù Hagimori và cs 1982
Dioscorea deltoidea Diosgenin Huyền phù Heble và Staba 1980
Dioscorea doryophora Diosgenin Huyền phù Huang và cs 1993
Duboisia leichhardtii Tropane alkaloids Mô sẹo Yamada và Endo 1984
Ephedra spp. L-Ephedrine, D- pseudoephedrin
Huyền phù O’Dowd và cs 1993
36
Eriobotrya japonica Triterpenes Mô sẹo Taniguchi và cs 2002
Eucalyptus tereticornis Sterol và hợp chất phenolic
Mô sẹo Venkateswara và cs 1986
Eucommia ulmoides Chlorogenic acid Huyền phù Wang và cs 2003
Fumaria capreolata Isoquinoline alkaloids Huyền phù Tanahashi và Zenk 1985 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Gentiana sp. Secoiridoid glycosides Mô sẹo Skrzypczak và cs 1993
Ginkgo biloba Ginkogolide A Huyền phù Carrier và cs 1991
Glehnia littoralis Furanocoumarin Huyền phù Kitamura và cs 1998
Glycyrrhiza echinata Flavonoids Mô sẹo Ayabe và cs 1986
Glycyrrhiza glabra var. glandulifera
Triterpenes Mô sẹo Ayabe và cs
1990
Hyoscyamus niger Tropane alkaloids Mô sẹo Yamada và Hashimoto 1982
Isoplexis isabellina Anthraquinones Huyền phù Arrebola và cs 1999
Linum flavum 5-Methoxypodophyllo- toxin
Huyền phù Uden và cs 1990
Lithospermum erythrorhizon
Dẫn xuất của shikonin Huyền phù Fujita và cs 1990
Lycium chinense Cerebroside Huyền phù Jang và cs 1998
37 2.4.Giới thiệu chung về Kim ngân hoa
Vị trí phân loại Giới: Plantae Ngành: Tracheobionta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Dipsacales Họ: Caprifoliacea Chi: Lonicera L
Loài: Lonicera japonica Thunb
Hình 2.14: hoa Kim ngân 2.4.1. Mô tả cây
Kim ngân là một loại dây leo, thân có thể vươn dài tới 10m hay hơn. Cành lúc còn non màu lục nhạt, có phủ lông mịn, khi cành già chuyển màu nâu đỏ nhạt, nhẵn. Lá mọc đối, đôi khi mọc vòng ba lá một, hình trứng dài, đầu hơi tù, phía cuống tròn, cuống ngắn 2 – 3 mm, cả hai mặt đều phủ lông mịn. Vào các tháng 5 – 8, hoa mọc từng đôi ở kẽ lá, mỗi kẽ lá có 1 cuống mang 2 hoa, hai bên lá mọc đối mang 4 hoa, lá bắc giống lá nhưng nhỏ hơn. Hoa hình ống xẻ 2 môi, môi lớn lại xẻ thành 3 hay 4 thùy nhỏ, phiến của tràng dài gần bằng ống tràng, lúc đầu màu trắng, sau khi nở một thời gian chuyển màu vàng, cùng một lúc trên cây có hoa mới nở màu vàng như bạc, lại có hoa nở đã lâu màu vàng như vàng cho nên có tên là Kim ngân (kim là vàng, ngân là bạc); cây Kim ngân xanh tốt vào mùa đông cho nên còn có tên là nhẫn đông nghĩa là chịu đựng mùa đông, 4 nhị thòi dài cao hơn tràng; vòi nhụy lại thòi dài cao hơn nhị, mùi thơm dễ chịu. Quả hình trứng dài chừng 5mm.
2.4.2. Phân bố, thu hái và chế biến
Kim ngân là một cây loại mọc hoang dại tại nhiều tỉnh vùng núi nước ta, nhiều nhất ở Cao Bằng, Lạng Sơn, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Bắc Giang, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Phú Thọ. Một số nơi người ta bắt đầu trồng lấy hoa và cành lá làm thuốc. Do cây Kim ngân có lá xanh tốt quanh năm, đến tháng 4 -5 lại cho hoa đẹp và thơm cho nên có thể trồng làm cảnh và lấy bóng mát.
38
Kim ngân có thể trồng ở miền núi cũng như ở đồng bằng. Đất đai và khí hậu Hà Nội cũng rất thích hợp. Ta có thể trồng bằng dâm cành: cắt những cành bánh tẻ dài chừng 20–60 cm, khoanh thành khoanh, chôn xuống dưới đất, để chừa đoạn sau cùng; vào thời kỳ đầu cần tưới đều. Có thể trồng quanh năm nhưng tốt nhất vào tháng 9–10 hoặc tháng 2 -3. Sau một năm có thể bắt đầu thu hoạch; thu hoạch lâu năm, càng về những năm sau càng nhiều hoa. Nếu hái hoa cần hái vào lúc hoa sắp nở hay khi hoa mới nở, màu còn trắng chưa chuyển vàng. Có thể hái hoa riêng, cành lá riêng nhưng có thể hái hoa kèm theo một ít cành lá, về nhà mới phân, chia cành lá riêng, hoa riêng. Hoa hay cành lá hái về phơi hay sấy khô là dùng được. Không phải chế biến gì khác. Việc bảo quản hoa lá cành lá Kim ngân tương đối dễ vì ít bị mốc, mọt.
2.4.3. Thành phần hóa học
Hoa và lá chứa flavonoid, chất chính là luteolin-7-rutinosid (lonicerin=scolymosid).
Một số chất carotenoid: ξ-caroten, β-cryptoxanthin, auroxanthin. Acid chlorogenic và các đồng phân của nó.
Lá có loganin và secologanin.
Hình 2.15: (1) scolymosid, (2) β-cryptoxanthin
Hình 2.16: (3) acid chlorogenic, (4) loganin, (5) secologanin (1) (2)
(3) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(4)
39 2.4.4. Tác dụng dược lý
Tác dụng kháng sinh – tác dụng kháng sinh được nhiều nhà nghiên cứu chú ý và chứng minh trong thực nghiệm.
Người ta thấy nước hoa Kim ngân có tác dụng ức chế rất mạnh đối với tụ cầu khuẩn vi khuẩn thương hàn, trùng lỵ Shiga. Nước sắc có tác ụng mạnh hơn các dạng bào chế khác.
Năm 1950, Lưu Quốc Thanh (Trung Hoa tân y học báo) đã báo cáo dùng nước sắc cô đặc 100% của hoa Kim ngân thấy có tác dụng khánh sinh rất mạnh đối với vi trùng thương hàn, tả, liên cầu khuẩn tiêu máu (vòng vô khuẩn tới 11–20 mm),