Thiết bị: máy nghiền mẫu, cân phân tích, tủ hút, giá ống nghiệm, bộ TLC, tủ sấy, tủ ủ,…
Dụng cụ: ống nghiệm, bình tam giác, pipet, micropipet, đĩa petri, đèn cồn,… 3.2.3. Các loại hóa chất sử dụng + CHCl3 + Hexan + Cồn 70o + FeCl3 + H2SO4 + Vanilin + Bột Mg kim loại + HCl + Acid tricloaroacetic + Anhydrid acetic
42 + Metanol + n-butanol + Acid acetic + NaCl + TSA + Pepton water + Agar, … 3.3.Phương pháp thí nghiệm
3.3.1. Thí nghiệm 1:cảm ứng tạo mô sẹo 3.3.1.1. Khử trùng mẫu lá 3.3.1.1. Khử trùng mẫu lá
Lá Kim ngân được khử trùng theo các bước sau: Khử trùng sơ bộ:
Mẫu lá được đặt dưới vòi nước chảy trong 30 phút để loại bỏ bớt sự nhiễm bẩn bề mặt.
Rửa kỹ từng mẫu lá trong nước rửa chén được pha loãng.
Rửa lại bằng nước máy từ 4 -5 lần và đưa vào tủ cấy. Khử trùng bên trong tủ cấy:
Chuyển mẫu sang một erlen khác đã được hấp khử trùng.
Tiến hành lắc khử trùng mẫu lá bằng dung dịch Javel (NaOCl) 7% có bổ sung thêm vài giọt Tween 20 trong các khoảng 5 phút.
Ngâm mẫu trong nước cất vô trùng để chuẩn bị tiến hành các thí nghiệm tạo mô sẹo.
3.3.1.2. Cảm ứng tạo mô sẹo
Mẫu cấy lá Kim ngân Hoa sau khi khử trùng được cắt bỏ rìa lá bị trắng hoặc nâu do do tác động của chất khử trùng và cắt phiến lá dài 1 – 2 cm sẽ được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 30g/l đường sucrose, 9g/l agar và các chất điều hòa tăng trưởng thực vật có nồng độ như sau:
+ 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA + 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA
Sau 2 tháng, ghi nhận sự phát sinh hình thái mô sẹo của mẫu cấy. Dùng mẫu để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo
43 3.3.2. Chuẩn bị mẫu
Các mẫu: lá và cành tự nhiên, hoa khô, mô sẹo, được sấy khô ở nhiệt độ 50 – 60oC trong vòng từ 3 – 4 tiếng, mục đích là khử bớt nước trong vật liệu. Sau đó nghiền mẫu bằng máy nghiền, mục đích làm vật liệu trở nên nhuyễn, nhỏ để dễ dàng tiến hành quá trình chiết.
Chiết lấy dịch bằng kỹ thuật chiết ngâm dầm với cồn 70o: lấy bình erlen 250ml, cho mẫu khoảng 10g vào bình rồi rót cồn 70o cho đến khi xâp xấp bề mặt của lớp bột mẫu. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Có thể gia tăng hiệu quả chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc nhẹ. Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24h là đủ, vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn. Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần lượng ít dung môi.
Sau 48h, với 2 lần chiết mỗi lần là 24h, đem tất cả dịch thu được đi cô quay chân không để giúp đuổi bớt dung môi dùng chiết là cồn 70o.
3.3.3. Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid trong cây Kim ngân bằng phương pháp thử nghiệm sinh triterpenoid trong cây Kim ngân bằng phương pháp thử nghiệm sinh hóa
Mục đích của thí nghiệm: các phản ứng hóa học đặc trưng của từng hợp chất trong thực vật giúp ta có khái niệm sơ bộ về mặt định tính, từ đó định hướng cho việc chiết xuất cũng như việc xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất trong mẫu thí nghiệm. Nhưng trong thí nghiệm này, chúng tôi tập trung vào phản ứng đặc trưng của flavonoid và saponin triterpenoid vì đây là hợp chất được biết nhiều nhất trong cây Kim ngân.
Thực nghiệm: dùng các phản ứng đặc trưng để kiểm tra
44
+ Khảo sát flavonoid: tác dụng với dung dịch H2SO4 đậm đặc, tác dụng với dung dịch FeCl 5% /ethanol, phản ứng Cyanidin của Wilstatter.
+ Khảo sát saponin: phản ứng Liebermann-Burchard, phản ứng Rosenheim, phản ứng Rosenthaler.
Chỉ tiêu đánh giá: các phản ứng màu đặc trưng với các chất chỉ thị.
3.3.4. Thí nghiệm 3: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Mục đích của thí nghiệm: kiểm tra sự hiện diện của hoạt chất tự nhiên có trong mẫu cần phân tích nhờ khả năng tách riêng các hợp chất này bằng sắc ký lớp mỏng tùy thuộc vào tỉ lệ phân phối của các hợp chất này giữa chất hấp thu và dung môi giải ly. Khẳng định lại kết quả của trắc nghiệm sinh hóa ở trên do độ nhạy của phương pháp sắc ký lớp mỏng là cao hơn.
Thực nghiệm:
Mỗi dịch chiết mẫu sau cô quay lấy từ 0.5 – 1ml để làm dịch chiết chấm sắc ký.
Chuẩn bị hệ dung môi giải ly đặc trưng cho từng hợp chất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chuẩn bị thuốc thử đặc trưng lên từng hợp chất.
Chuẩn bị bản sắc ký: là loại tráng sẵn F254 của Merk có kích thước là 20x20 cm được chia làm 4 với mỗi bản có kích thước là 10x10 cm. Dùng viết chì vạch đường xuất phát điểm chấm mẫu cách mép dưới 1cm, cứ cách 2 mép ngoài 0.5 cm. Mẫu được chấm cách nhau 1cm. Vạch đường kết thúc chạy của dung môi triển khai cách mép trên 0.5cm. (Hình 3.1)
45
Hình 3.1: Hình minh họa bản chấm sắc ký
Dùng ống vi quản để chấm mẫu lên bản sắc ký. Mẫu chấm phải nhỏ gọn, không để lan rộng, dùng máy sấy làm khô ngay. Chấm lặp lại nhiều lần.
Tiến hành chạy sắc ký: cho bản sắc ký vào bình sắc ký đã chứa sẵn dung môi triển khai. Đặt bản sắc ký vào gờ nhỏ ở đáy bình. Phải đảm bảo dung môi tiếp xúc gần sát vạch xuất phát. Đậy nắp bình, dung môi sẽ thấm lên bản sắc ký theo lực mao dẫn và phân tách các thành phần hoạt chất của mẫu. Chấm dứt chạy mẫu khi dung môi thấm đến vạch kết thúc.
Chỉ tiêu đánh giá: sự hiện màu đặc trưng của flavonoid và triterpenoid saponin đó trên bản sắc ký với thuốc thử đặc trưng.
3.3.5. Thí nghiệm 4: khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân ngân
Mục đích của thí nghiệm: kiểm tra sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn cụ thể là đối
với E. coli và Samonella của mẫu hoa, mẫu mô sẹo, mẫu đối chứng là kháng sinh
cefalvidi.
3.3.5.1. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân bằng phương pháp khuếch tán qua vòng giấy lọc
Thực nghiệm: Chuẩn bị mẫu: Vạch kết thúc Vạch xuất phát Mẫu 0.5 cm 1cm 1cm 0.5cm
46
+ Mỗi dịch chiết mẫu sau cô quay lấy 10 ml thể tích dung dịch để thí nghiệm.
+ Một mẫu kháng sinh cefadroxil pha với 10ml nước cất dùng làm dịch đối chứng. Nồng độ là 50mg/ml
+ Giống E.coli và Samonella do phòng thí nghiệm khoa môi trường và
công nghệ sinh học cung cấp.
Chuẩn bị giấy lọc đường kính 8mm, được hấp khử trùng trước khi sử dụng.
Chuẩn bị môi trường TSA để nuôi cấy E.coli
Chuẩn bị môi trường pepton water có bổ sung 2% agar để nuôi cấy
Samonella.
Dịch nuôi cấy E.coli (21h, 37oC) do phòng thí nghiệm cung cấp. Pha loãng 10-5, 10-6, 10-7.
Dịch nuôi cấy Samonella (21h, 37oC) do phòng thí nghiệm cung cấp. Pha loãng ở 10-2, 10-3, 10-4 Cách thực hiện: Đổ đĩa môi trường TSA Trải 0.1 ml dịch chứa E.coli
Đổ đĩa môi trường Pepton water 2%
KS cefadroxil (T0) Dịch chiết hoa (T1) Dịch chiết mô sẹo 1 (T2) Dịch chiết mô sẹo 2 (T3)
Trải 0.1 ml dịch
chứa Samonella
Đặt giấy thấm
Ủ hiếu khí 24h, 37 oC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kiểm tra sự tạo vòng kháng sinh
Hình 3.2: sơ đồ thực hiện thí nghiệm khuếch tán qua vòng
47
Mô sẹo 1: mô sẹo nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l BA.
Mô sẹo 2: mô sẹo nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA.
Chỉ tiêu đánh giá: kiểm tra vòng kháng khuẩn do mẫu tạo ra so với đối chứng là nước cất và kháng sinh từ đó kết luận sơ bộ có hay không hoạt tính kháng khuẩn của mẫu.
3.3.5.2. Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch
Thực nghiệm:
Chuẩn bị mẫu:
+ Mỗi dịch chiết mẫu sau cô quay lấy 10 ml thể tích dung dịch để thí nghiệm
+ Một mẫu kháng sinh cefaldroxil pha trong 10ml nước cất dùng làm dịch đối chứng. Nồng độ là 50mg/ml.
+ Giống E.coli và Samonella do phòng thí nghiệm khoa môi trường và
công nghệ sinh học cung cấp.
Chuẩn bị ống đục lỗ bằng inox đường kính 8mm, được hấp khử trùng trước khi sử dụng.
Chuẩn bị môi trường TSA để nuôi cấy E.coli và môi trường pepton water có bổ sung 2% agar để nuôi cấy Samonella.
Dịch nuôi cấy E.coli (21h, 37oC) do phòng thí nghiệm cung cấp. Pha loãng 10-5, 10-6, 10-7.
Dịch nuôi cấy Samonella (21h, 37oC) do phòng thí nghiệm cung cấp. Pha loãng ở 10-2, 10-3, 10-4
48
Hình 3.3 : sơ đồ thực hiện thí nghiệm khuếch tán qua giếng thạch
Mô sẹo 1: mô sẹo nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l BA.
Mô sẹo 2: mô sẹo nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA.
Đổ đĩa môi trường TSA
Trải 0.1 ml dịch
chứa E.coli
Đổ đĩa môi trường Pepton water 2% agar
Trải 0.1 ml dịch chứa Samonella Đục lổ có bán kính 8mm, đổ vào lổ 100μl dung dịch KS cefadroxil (T0) Dịch chiết hoa (T1) Dịch chiết mô sẹo 1 (T2) Dịch chiết mô sẹo 2 (T3)
Ủ hiếu khí 24h, 37oC
Kiểm tra sự tạo vòng kháng sinh
49
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1.Thí nghiệm 1: cảm ứng mô sẹo (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lá Kim ngân sau khi khử trùng, cắt thành nhiều mảnh có kích thước 1.0cm x 1.0cm, cấy vào 2 môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D kết hợp với 1mg/l BA và môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ kết hợp với 0.05 mg/l IBA để cảm ứng tạo mô sẹo.
Mô sẹo là một đám tế bào không phân hóa có đặc tính phân chia mạnh thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan (Bùi Trang Việt, 2000). Mô sẹo hình thành ở hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt (Street, 1969). Tuy nhiên, khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hóa và kiểu gen (Torres, 1989). Chỉ có cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành là dễ cho mô sẹo dưới tác động của auxin mạnh được áp dụng riêng lẻ hay kết hợp với cytokinin, còn những mảnh cơ quan trưởng thành thường không có khả năng này. Ứng với mỗi loại mô hay cơ quan, thường phải sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật với loại và nồng độ khác nhau tùy theo mức độ nhạy cảm của các tế bào trong mô hay cơ quan đó (Ochatt và Caso, 1986).
Sau 2 tháng nuôi cấy thu được kết quả như sau:
+ Trên môi trường MS 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA: mô sẹo hình thành có màu nâu, xốp, tạo thành khối, bông trắng.
+ Trên môi trường MS có sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA: mô sẹo hình thành có màu xanh lục, tạo thành khối, xốp.
50
Hình 4.1: mô sẹo lá Kim ngân trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA
Hình 4.2: mô sẹo hình thành từ lá Kim ngân trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA
51
Nuôi cấy mô sẹo là khâu rất quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào. Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô và tế bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học, … .
Đặc điểm sinh trường của mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo, thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Sự hình thành mô sẹo chia thành 3 giai đoạn: phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào và biệt hóa.
Trong phase phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy.
Tế bào đi vào giai đoạn phân chia tăng sinh khối.
Tế bào đi vào quá trình biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa tế bào và sự xuất hiện các con đuờng trao đổi chất dẫn đến sự sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học (Aitchison, 1997). Mô sẹo thường có màu vàng, trắng, xanh hay màu sắc tố anthocyanin.
4.2. Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và sapoin triterpenoid bằng phương pháp trắc nghiệm sinh hóa bằng phương pháp trắc nghiệm sinh hóa
4.2.1. Khảo sát sự hiện diện của flavonoid 4.2.1.1. Tác dụng với H2SO4 đậm đặc 4.2.1.1. Tác dụng với H2SO4 đậm đặc
Để khảo sát sự hiện diện của hợp chất flavonid, nhỏ 1ml dung dịch H2SO4
đậm đặc vào từng dịch chiết. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.1 Bảng 4.1 kết quả thử nghiệm với dung dịch H2SO4 đậm đặc
Dịch chiết Hiện tượng
Hoa sấy khô (M1) Đậm màu
Cành lá tự nhiên (M2) Đậm màu
Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1
mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Đậm màu
Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5
52
Hình 4.3 kết quả phản ứng H2SO4 đậm đặc M1: mẫu hoa sấy khô.
M2: mẫu cành lá sấy khô.
M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4- D, 1 mg/l BA.
M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA.
4.2.1.2. Tác dụng với FeCl3 5% trong ethanol (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để khảo sát sự hiện diện của hợp chất flavonid, nhỏ 1ml dung dịch FeCl3 5% vào từng dịch chiết. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.2
Bảng 4.2: kết quả thử nghiệm với FeCl3 5%
Dịch chiết Hiện tượng
Hoa sấy khô (M1) Xuất hiện vòng xanh đen Lá cành tự nhiên (M2) Xuất hiện vòng xanh đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1
mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Xuất hiện vòng xanh đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5
mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (M4) Không đổi màu
53
Hình 4.4 kết quả thử nghiệm với FeCl3 5% M1: mẫu hoa sấy khô.
M2: mẫu cành lá tự nhiên sấy khô.
M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4- D, 1 mg/l BA.
M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA.
ĐC: là dịch chiết các mẫu ban đầu M1 ĐC ĐC ĐC M2 M2 M4 ĐC
54
4.2.1.3. Phản ứng Cyanidin của Wilstatter
Phản ứng dựa trên sự khử bằng bột Mg trong HCl/ethanol trên các dẫn xuất flavonoid. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.3
Bảng 4.3 kết quả thử nghiệm phản ứng Cyanidin
Dịch chiết Hiện tượng
Hoa sấy khô (M1) Xuất hiện màu đỏ đậm Lá cành tự nhiên (M2) Xuất hiện màu đỏ Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1
mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Không đổi màu Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5
mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (M4) Không đổi màu
ĐC ĐC