qua giếng thạch
Phương pháp này có ưu điểm hơn phương pháp khuếch tán qua giấy lọc là nó giúp dịch chiết khuễch tán đều hơn từ trong dưới lòng giếng thạch lên tới bề mặt thạch, còn phương pháp khuếch tán qua giấy lọc chỉ giúp dịch khuếch tán trên bề mặt thạch.
4.4.2.1. Đối với E.coli
Hình 4.11 kết quả ức chế E.coli sau 24h ở 37oC T0 là kháng sinh cefadroxil.
T1 là dịch chiết hoa Kim ngân.
T2 là dịch chiết mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA
T3 là dịch chiết mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA T0 d0 T1 T2 T4 d1
68
Kết quả thí nghiệm thu nhận được trình bày trong bảng 4.12:
Bảng 4.12 kết quả thử nghiệm hoạt tính sơ bộ của dịch chiết đối với E.coli
Mẫu Đường kính vòng kháng
(d)
Kháng sinh cefadroxil (T0) 40 cm
Dịch chiết hoa (T1) 19 cm
Dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có
bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (T2) 0 cm Dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có
bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (T3)
0 cm
- Cũng như kết quả của thí nghiệm qua phương pháp khuếch tán qua giấy lọc thì dựa vào bảng kết quả 4. 12 thì dịch chiết hoa cũng xuất hiện vòng kháng khuẩn và có đường kính là 19 mm nhỏ đường kính kháng khuẩn của kháng sinh là 40mm . Và cũng có tính kháng khuẩn yếu và vẫn còn khuẩn lạc phát triển bên ngoài vòng kháng do dịch chiết chưa tinh khiết và nồng độ dịch chưa đủ ức chế .
- Trong thí nghiệm này thì dịch chiết của mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA không thấy rõ vòng kháng, còn mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA cũng không có xuất hiện vòng kháng khuẩn.
69 4.4.2.2. Đối với Samonela
Hình 4.12 kết quả ức chế Samonell sau 24h, ủ ở 37oC T0 là kháng sinh cefadroxil.
T1 là dịch chiết hoa Kim ngân.
T2 là dịch chiết mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA
T3 là dịch chiết mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA
Kết quả thí nghiệm thu nhận được trình bày trong bảng 4.13:
Bảng 4.13 kết quả thử nghiệm hoạt tính sơ bộ của dịch chiết đối với Samonella
Mẫu Đường kính vòng kháng
(d)
Kháng sinh cefadroxil (T0) 40 mm
Dịch chiết hoa (T1) 24 mm
Dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ
sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (T2) 0 cm Dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ
sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (T3) 0 cm T0 d0 T1 d1 T3 T2
70
Với nồng độ nước sắc Kim ngân là 1/320 là có tác dụng ức chế đối với sự
phát triển của vi khuẩn Samonella (Đỗ Tất Lợi, 2004). Mặc dù chưa có thể xác định
nồng độ chính xác của các dịch chiết mẫu nhưng qua bảng kết quả 4.13, dịch chiết hoa là có xuất hiện vòng kháng khuẩn với đường kính là 24 mm nhỏ hơn so với vòng kháng khuẩn của kháng sinh cefadroxil là 40 mm.
Dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA chưa xuất hiện vòng kháng rõ ràng vì có thể nồng độ của dịch chiết cũng chưa phù
hợp để có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn Samonella.
Dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA thì cũng không thấy xuất hiện vòng kháng khuẩn.
71
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1.Kết luận
Qua các trắc nghiệm hóa sinh, TLC thì ta có thể kết luận rằng:
+ Mẫu hoa, lá cành tự nhiên, mô sẹo hình thành từ lá của cây Kim ngân tự nhiên trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA đều có thể có sự hiện diện của hợp chất thuộc nhóm flavonoid và saponin triterpenoid với những mức độ khác nhau.
+ Còn mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA là có thể không có sự hiện diện của các hợp chất nhóm flavonoid hay saponin triterpenoid hoặc là chứa một nhóm hợp chất khác. Qua các thí nghiệm khảo sát hoạt tính sơ bộ của dịch chiết hoa, hai dịch mô sẹo và đối chứng là kháng sinh cefadroxil ta có thể kết luận:
+ Dịch chiết hoa có khả năng ức chế sự phát triển cả 2 vi khuẩn là E.coli và Samonella như Đỗ Tất Lợi (2004) đã ghi nhận với nồng độ nước sắc Kim ngân là 1/160 là có khả năng ức chế sự phát triển của E.coli và nồng độ nước sắc Kim ngân là 1/320 là có khả năng ức chế sự phát triển của Samonella .
+ Dịch chiết mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4- D, 1 mg/l BA thì vẫn chưa thể hiện rõ ràng hoạt tính kháng khuẩn mặc dù qua các trắc nghiệm hóa sinh và TLC cho kết quả dương tính với nhóm hoạt chất flavonoid và saponin triterpenoid. Có thể nồng độ của dịch chiết vẫn chưa đủ
để ức chế được E.coli và Samonella.
+ Dịch chiết mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA thì hoàn toàn không có khả năng kháng khuẩn phù hợp với kết quả của các thí nghiệm trắc nghiệm hóa sinh, TLC cũng cho kết quả âm tính với hợp chất saponin triterpenoid và nhất là flavonoid vì những hợp chất thuộc nhóm này mới khả năng kháng khuẩn mạnh.
72 5.2. Kiến nghị
Do điều kiện phòng thí ngiệm, thời gian có hạn nên tôi xin đưa ra một số kiến nghị để nghiên cứu được hoàn thiện hơn:
+ Khảo sát thêm trong mô sẹo phát sinh từ lá của cây Kim Ngân ngoài hai hợp chất trên còn có thêm hoạt chất nào không.
+ Khảo sát thử các phương pháp nuôi cấy khác nhau như nuôi cấy huyền phù, lỏng, lắc,… hoặc trong quá trình nuôi cấy có thể bổ sung tiền chất, elicitor,…để xem khả năng sinh tổng hợp các hợp chấp thứ cấp.
+ Khảo sát khả năng kháng khuẩn và xác định được nồng độ cụ thể đối với từng loài vi khuẩn gây bệnh khác từ dịch chiết hoa hay dịch chiết mô sẹo
73
CHƯƠNG 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
1. Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật đại cương, phần 2 – Phát triển. Nxb Quốc gia TP.HCM.
2. Diệp Quỳnh Như, Đỗ Thị Tuyến, Nguyễn Thị Như Quỳnh (2008), Tài liệu hướng dẫn thực tập môn sinh phẩm chứa hoạt chất thứ cấp, NXB Viện sinh học nhiệt đới, Hồ Chí Minh.
3. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội.
4. Lê Thị Diễm Hồng, Nguyễn Xuân Thắng(2005), Tác dụng chống viêm của
flavonoid cây Kim ngân (Lonicera japonica Thunb. Caprifoliaceae) khi kết
hợp với -amylase, Tạp chí Dược học, Hà Nội.
5. Lê Thị Diễm Hồng, Nguyễn Thị Hồng Nhiên, Nguyễn Thị Hồng Vân, Nguyễn Viết Thân, Nguyễn Xuân Thắng (2007), Nghiên cứu tác dụng chống viêm
mạn của saponin và flavonoid cây Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.)”,
Tạp chí Dược học, Hà Nội
6. Nguyễn Kim Bích và cộng sự (2007), Phân tích và xác định các đặc điểm hóa học đặc trưng của dươc liệu phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa,Viện dược liệu. 7. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB
Đại học quốc gia thành phố HCM, Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Thái Quỳnh Quyên (2009), Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA và 2, 4–D lên mẫu lá Kim ngân, Đồ án tốt nghiệp, Đại học Kỹ thuật công nghệ thành phố HCM, Hồ Chí Minh.
9. Phan Minh Giang, Nguyễn Tuấn Minh, Nguyễn Thị Minh Hằng, Phan Tống
Sơn (2005), Nghiên cứu hoạt chất sinh học từ câyKim ngân (Lonicera japonica Thunb. Caprifoliaceae), Tuyển tập các công trình hội nghị khoa học
và công nghệ hóa hữu cơ toàn quốc lần thứ 3.
10.Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh (2002), Bài giảng dược liệu (I, II), NXB Y học, Hà Nội.
74
11.Quách Diễm Phương, Bùi Văn Lệ (2007), Nhân giống in vitro cây bắt ruồi Drosera Burmanni Vahl để thu nhận một hợp chất Quinone có hoạt tính sinh
học, Tạp chí phát triển KH&CN, tập 10, số 04, Hồ Chí Minh. Tiếng Anh
12.Berlin J, Sasse F (1985) Selection and screening techniques for plant cell
cultures. Advanced Biochemistry and Engineering 31: 99-132.
13.Bruneton J (1995) Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants. Intercept UK, 522.
14.Choi KT, Ahn IO, Park JC (1994) Production of ginseng saponin in tissue
culture of ginseng (Panax ginseng C.A. Mayer). Russian Journal of Plant Physiology. 41: 784-788.
15.Chueh FS, Chen CC, Sagare AP, and Tsay HS (2000) Quantitative determination of secoiridoid glucoside in in vitro propagated plants of Gentiana davidii var. formosana by high performance liquid chromatography.
Planta Medica 67: 70-73.
16.Cragg GM, Schepartz SA, Suffuess M, Grever MR (1993) The taxol supply crisis. New NCI policies for handling the large-scale production of novel
natural product anticancer and anti-HIV agents, Journal of Natural Products
56: 1657-1668.
17.Dicosmo F and Tower GHN (1984) Stress and secondary metabolism in ciltured plant cells. In: Recent Adv Phytochem 18 (eds) Timmerman SC and Loewus FA. Plenum Press, NewYork: 97-175.
18.Dicosmo F, Misawa M (1995) Plant cell and tissue culture: Alternatives for
metabolite production, Biotechnology Advance 13 (3): 425-453.
19.Dixon RA (1999) Plant natural products: the molecular genetic basis of
biosynthetic diversity. Current Opinion in Biotechnology 10: 192-197.
20.Fett-Neto AG, Stewart JM, Nicholson SA, Pennington JJ, and DiCosmo F (1994) Improved taxol yield by aromatic carboxylic acid and and amino acid
feeding to cell cultures of T. cuspidata. Biotechnology Bioengineering 44:
75
21.Fischer R, Liao YC, Hoffmann K, Schillberg S, Emans N (1999) Molecular
farming of recombinant antibodies in plants. Biological Chemistry 380: 825-
839.
22.Furuya T, Kojima H, Syono K, Ishii T, Uotani K (1973) Isolation of saponins
and sapogenins from callus tissue of Panax ginseng. Chem Pharm Bull 21(1):
98-101.
23. Goleniowski M, Trippi VS (1999) Effect of growth medium composition on
psilostachyinolides and altamisine production. Plant Cell Tissue and Organ Culture 56: 215-218.
24.13. Hu ZB and Alfermann AW (1993) Diterpenoid production in hairy root
cultures of Salvia miltiorrhiza. Phytochemistry 32: 699-703.
25.Issell BF, Rudolph AR, and Louie AC (1984) Etoposide (VP-16-213): An
overview. In BF Issell, FM Muggia, and SK Carter (eds.), Etoposide (VP-16-
213)-Current status and new developments. Academic Press Inc, Orlando. 26.Kadkade PG (1981) Formation of podophyllotoxin by Podophyllum peltatum
tissue cultures. Naturwiss 68: 481-482.
27.Kadkade PG (1982) Growth and podophyllotoxin production in callus tissues
of Podophyllum peltatum. Plant Sci Lett 25: 107-115.
28.Lee JM (2001) Biochemical Engineering. Prentice Hall, Inc. USA.
29.Lee CY, Lin FL, Yang CT, Wang LH, Wei HL, and Tsay HS (1995) Taxol
production by cell cultures of Taxus mairei. Proc. Symp. on Development and
Utilization of Resources of Medicinal Plants in Taiwan, Taiwan Agricultural Research Institute, Taiwan. TARI Special Publication 48: 137-148.
30.Lee CWT, Shuler ML (2000) The effect of inoculum density and conditioned medium on the production of ajmalcine and catharanthine from immobilizes
Catharanthus roseus cells. Biotechnology Bioengineering 67: 61-71.
31.Merkli A, Christen P, and Kapetanidis I (1997) Production of diosgenin by
hairy root cultures of Trigonella foenum-graecum L. Plant Cell Reports 16(9):
76
32.Misawa M (1994), “Plant tissue culture: An alternative for production of
useful metabolite”, FAO Agricultural services bulletin, 108.
33.Miyasaka H, Nasu M, and Yoneda K (1989) Salvia miltiorrhiza: In vitro
production of cryptotanshinone and feruginol. In: Biotechnology in agriculture and forestry. 7, Medicinal and Aromatic Plants II ed. By Bajaj YPS. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg: 417- 430.
34.Moreno PRH, Heijden R, Verpoorte R (1993) Effect of terpenoid precusor feeding and elicitation on formation of indole alkaloids in cell suspension
cultures of Catharanthus roseus. Plant Cell Reports, 12: 702-705.
35.Mulbagal V, Tsay HS (2004) Plant cell cultures-an alternative and efficient source for the production of biologically important secondary metabolites.
International Journal of Applied Science and Engineering 2(1): 29-48.
36.Rao SR (2000) Biotechnological production of phyto-pharmaceuticals.
Journal of Biochemistry Molecular Biology Biophysics 4: 73-102.
37.26. Shimomura K, Kitazawa T, Okamura N, and Yagi A (1991) Tanshinone
production in adventitious roots and regenerates of Salvia miltiorrhiza. Journal of Natural Products 54: 1583.
38.Skrzypczak L, Wesolowska M, and Skrzypczak E (1993) Gentiana species XII: In vitro culture, regeneration, and production of secoirridoid glucosides. In Y.P.S. Bajaj (ed.), Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol. 21,
Medicinal and Aromatic Plants IV. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 172- 186.
39.Slichenmyer WJ, Von Horf DD (1991) Taxol: a new and effective anticancer
drug. Anti-Cancer Drugs 2: 519-530.
40.Smollny T, Wichers H, De Rijk T, Van Zwam A, Shasavari A, and Alfermann
AW (1992) Formation of lignans in suspension cultures of Linum album. Planta Med Suppl 58: A622.
41.Song Jin Lee and et (năm), Loniceroside C , an antiinflammatory saponin
77
42.Srinivasan V, Pestchanker L, Hirasuma MT, Taticek RA, and Shuler ML (1995) Taxol production in bioreactors; kinetics of biomass accumulation,
nutrient uptake, and taxol production by cell suspensions of Taxus baccata. Biotechnol Bioeng 47: 666-676.
43.Silvestrini A, Pasqua S, Botta B, Monacelli B, Heijden R, Verpoorte R (2002)
Effect of alkaloid precusor feeding on a Camptotheca acuminata cell line. Plant Physiology and Biochemistry 40: 749-753.
44.Tabata M, Yamamoto H, and Hiraoka N (1972) Les Cultures de Tissus de Plantes. Colloques internationaux de CNRS. No 193.
45.Tsay HS, Chang WD, Chen CC, and Chang YS (1994) The production of
imperatorin from Angelica dahurica var. formosana by cell suspesion culture. J Agric Assoc China. 168: 32-48.
46.Tsay HS (1999) Tissue culture technology of medicinal herbs and its application of medicinal herbs and its application in Taiwan. In: CH Chou, GR Waller, and C Reinhardt (eds.), Biodiversity and Allelopathy: from Organisms to Ecosystems in the Pacific. Academia Sinica, Taipei, Taiwan. 137-144.
47.Verpoorte R (1998) Exploration of nature’s chemodiversity: the role of
secondary metabolites as leads in drug development. Drug Discovery Today
3: 232-238.
48.Yamada Y, and Sato F (1981) Production of berberine in cultured cells of
Coptis japonica. Phytochemistry 20: 545-547.
49.Yamamoto Y, Mizuguchi R, Yamada Y (1982) Selection of a high and stable
pigment-producing strain in cultured Euphorbia millii cells. Theoretical and Applied Genetics 61: 113-116.
50.Yeh FT, Huang WW, Cheng CC, Na C, and Tsay HS (1994) Tissue culture of
Dioscorea doryophora Hance. II. Estabilshment of suspension culture and the measurement of diosgenin content. Chinese Agronomy Journal 4: 257-268.
78
51.Wang HQ, Yu JT and Zhong JJ (1999) Significant improvement of taxane
production in suspension cultures of Taxus chinensis by sucrose feeding strategy. Process Biochemistry 35: 479-483.
52.Wani MC, Taylor HL, Wall ME, Coggon P, and McPhail AT (1971) Plant antitumor agents VI. The isolation and structure of taxol, a novel antileukemic
and antitumor agent from Taxus brevifolia. Journal of American Chemical Society 93: 2325-2327.
53.Wickremesinhe ERM, Arteca RN (1993) Taxus callus cultures: Intiation, growth optimization, characterization and taxol production. Plant Cell Tissue and Organ Culture 35: 181-193.
54.Wickremesinhe ERM, Arteca RN (1994) Taxus cell suspension cultures: optimizing growth and production of taxol. Journal of Plant Physiology 144:
183-188.
55.Woerdenbag HJ, Van Uden W, Frijlink HW, Lerk CF, Pras N, and Malingre
ThM (1990) Increased podophyllotoxin production in Podophyllum hexandrum cell suspension cultures after feeding coniferyl alcohol as a β- cyclodextrin complex. Plant Cell Rep 9: 97-100.
56.Wu CT, Vanisree M, Satish MN, Chen CL, Yang TF, and Tsay HS (2003) Isolation and quantitative analysis of cryptotanshinone, an active quinoid
diterpene formed in the callus of Salvia miltiorrhiza Bunge. Biological and Pharmaceutical Bulletin 26(6): 845-848.
57.Zheng HZ, Dong ZH, and She J (1997) Longdan. In: Modern Study of Traditional Chinese Medicine 2: 1398-1408. Beijing Xue Yuan Press, Beijing, China.
58.Wie-Jong Kwak, Yong-Baik Cho, Chang-Kyun Han, Hee Jae Shin, Keun Ho Ryu, Hunseung Yoo, Hae In Rhe, (năm), Extraction and purification method of active constituents form stem of lonicera japonica thunb., its usage for anti – inflammatory and analgesic drug.
iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
2, 4-D : 2,4-dichlorophenolxyacetic acid
BA : 6-benzyladenine
MS : môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)
TDZ : thidiaruzon
iv
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: so sánh các đặc trưng của các kỹ thuật sắc ký
Bảng 2.2: các hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuôi cấy mô và tế bào thực vật (Mulbagal and Tsay 2004)
Bảng 2.3: nồng độ loãng nhất có tác dụng ức chế đối với sự phát triển của vi khuẩn
Bảng 4.1 kết quả thử nghiệm với dung dịch H2SO4 đậm đặc Bảng 4.2: kết quả thử nghiệm với FeCl3 5%
Bảng 4.3 kết quả thử nghiệm phản ứng Cyanidin
Bảng 4.4: tóm tắt kết quả khảo sát sự hiện diện của hợp chất flavonoid bằng