ngân
Mục đích của thí nghiệm: kiểm tra sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn cụ thể là đối
với E. coli và Samonella của mẫu hoa, mẫu mô sẹo, mẫu đối chứng là kháng sinh
cefalvidi.
3.3.5.1. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân bằng phương pháp khuếch tán qua vòng giấy lọc
Thực nghiệm: Chuẩn bị mẫu: Vạch kết thúc Vạch xuất phát Mẫu 0.5 cm 1cm 1cm 0.5cm
46
+ Mỗi dịch chiết mẫu sau cô quay lấy 10 ml thể tích dung dịch để thí nghiệm.
+ Một mẫu kháng sinh cefadroxil pha với 10ml nước cất dùng làm dịch đối chứng. Nồng độ là 50mg/ml
+ Giống E.coli và Samonella do phòng thí nghiệm khoa môi trường và
công nghệ sinh học cung cấp.
Chuẩn bị giấy lọc đường kính 8mm, được hấp khử trùng trước khi sử dụng.
Chuẩn bị môi trường TSA để nuôi cấy E.coli
Chuẩn bị môi trường pepton water có bổ sung 2% agar để nuôi cấy
Samonella.
Dịch nuôi cấy E.coli (21h, 37oC) do phòng thí nghiệm cung cấp. Pha loãng 10-5, 10-6, 10-7.
Dịch nuôi cấy Samonella (21h, 37oC) do phòng thí nghiệm cung cấp. Pha loãng ở 10-2, 10-3, 10-4 Cách thực hiện: Đổ đĩa môi trường TSA Trải 0.1 ml dịch chứa E.coli
Đổ đĩa môi trường Pepton water 2%
KS cefadroxil (T0) Dịch chiết hoa (T1) Dịch chiết mô sẹo 1 (T2) Dịch chiết mô sẹo 2 (T3)
Trải 0.1 ml dịch
chứa Samonella
Đặt giấy thấm
Ủ hiếu khí 24h, 37 oC
Kiểm tra sự tạo vòng kháng sinh
Hình 3.2: sơ đồ thực hiện thí nghiệm khuếch tán qua vòng
47
Mô sẹo 1: mô sẹo nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l BA.
Mô sẹo 2: mô sẹo nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA.
Chỉ tiêu đánh giá: kiểm tra vòng kháng khuẩn do mẫu tạo ra so với đối chứng là nước cất và kháng sinh từ đó kết luận sơ bộ có hay không hoạt tính kháng khuẩn của mẫu.
3.3.5.2. Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch
Thực nghiệm: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chuẩn bị mẫu:
+ Mỗi dịch chiết mẫu sau cô quay lấy 10 ml thể tích dung dịch để thí nghiệm
+ Một mẫu kháng sinh cefaldroxil pha trong 10ml nước cất dùng làm dịch đối chứng. Nồng độ là 50mg/ml.
+ Giống E.coli và Samonella do phòng thí nghiệm khoa môi trường và
công nghệ sinh học cung cấp.
Chuẩn bị ống đục lỗ bằng inox đường kính 8mm, được hấp khử trùng trước khi sử dụng.
Chuẩn bị môi trường TSA để nuôi cấy E.coli và môi trường pepton water có bổ sung 2% agar để nuôi cấy Samonella.
Dịch nuôi cấy E.coli (21h, 37oC) do phòng thí nghiệm cung cấp. Pha loãng 10-5, 10-6, 10-7.
Dịch nuôi cấy Samonella (21h, 37oC) do phòng thí nghiệm cung cấp. Pha loãng ở 10-2, 10-3, 10-4
48
Hình 3.3 : sơ đồ thực hiện thí nghiệm khuếch tán qua giếng thạch
Mô sẹo 1: mô sẹo nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l BA.
Mô sẹo 2: mô sẹo nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA.
Đổ đĩa môi trường TSA
Trải 0.1 ml dịch
chứa E.coli
Đổ đĩa môi trường Pepton water 2% agar
Trải 0.1 ml dịch chứa Samonella Đục lổ có bán kính 8mm, đổ vào lổ 100μl dung dịch KS cefadroxil (T0) Dịch chiết hoa (T1) Dịch chiết mô sẹo 1 (T2) Dịch chiết mô sẹo 2 (T3)
Ủ hiếu khí 24h, 37oC
Kiểm tra sự tạo vòng kháng sinh
49
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1.Thí nghiệm 1: cảm ứng mô sẹo
Lá Kim ngân sau khi khử trùng, cắt thành nhiều mảnh có kích thước 1.0cm x 1.0cm, cấy vào 2 môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D kết hợp với 1mg/l BA và môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ kết hợp với 0.05 mg/l IBA để cảm ứng tạo mô sẹo.
Mô sẹo là một đám tế bào không phân hóa có đặc tính phân chia mạnh thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan (Bùi Trang Việt, 2000). Mô sẹo hình thành ở hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt (Street, 1969). Tuy nhiên, khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hóa và kiểu gen (Torres, 1989). Chỉ có cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành là dễ cho mô sẹo dưới tác động của auxin mạnh được áp dụng riêng lẻ hay kết hợp với cytokinin, còn những mảnh cơ quan trưởng thành thường không có khả năng này. Ứng với mỗi loại mô hay cơ quan, thường phải sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật với loại và nồng độ khác nhau tùy theo mức độ nhạy cảm của các tế bào trong mô hay cơ quan đó (Ochatt và Caso, 1986).
Sau 2 tháng nuôi cấy thu được kết quả như sau:
+ Trên môi trường MS 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA: mô sẹo hình thành có màu nâu, xốp, tạo thành khối, bông trắng.
+ Trên môi trường MS có sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA: mô sẹo hình thành có màu xanh lục, tạo thành khối, xốp.
50
Hình 4.1: mô sẹo lá Kim ngân trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA
Hình 4.2: mô sẹo hình thành từ lá Kim ngân trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
51
Nuôi cấy mô sẹo là khâu rất quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào. Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô và tế bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học, … .
Đặc điểm sinh trường của mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo, thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Sự hình thành mô sẹo chia thành 3 giai đoạn: phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào và biệt hóa.
Trong phase phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy.
Tế bào đi vào giai đoạn phân chia tăng sinh khối.
Tế bào đi vào quá trình biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa tế bào và sự xuất hiện các con đuờng trao đổi chất dẫn đến sự sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học (Aitchison, 1997). Mô sẹo thường có màu vàng, trắng, xanh hay màu sắc tố anthocyanin.
4.2. Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và sapoin triterpenoid bằng phương pháp trắc nghiệm sinh hóa bằng phương pháp trắc nghiệm sinh hóa
4.2.1. Khảo sát sự hiện diện của flavonoid 4.2.1.1. Tác dụng với H2SO4 đậm đặc 4.2.1.1. Tác dụng với H2SO4 đậm đặc
Để khảo sát sự hiện diện của hợp chất flavonid, nhỏ 1ml dung dịch H2SO4
đậm đặc vào từng dịch chiết. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.1 Bảng 4.1 kết quả thử nghiệm với dung dịch H2SO4 đậm đặc
Dịch chiết Hiện tượng
Hoa sấy khô (M1) Đậm màu
Cành lá tự nhiên (M2) Đậm màu
Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1
mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Đậm màu
Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5
52
Hình 4.3 kết quả phản ứng H2SO4 đậm đặc M1: mẫu hoa sấy khô.
M2: mẫu cành lá sấy khô.
M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4- D, 1 mg/l BA.
M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA.
4.2.1.2. Tác dụng với FeCl3 5% trong ethanol
Để khảo sát sự hiện diện của hợp chất flavonid, nhỏ 1ml dung dịch FeCl3 5% vào từng dịch chiết. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.2
Bảng 4.2: kết quả thử nghiệm với FeCl3 5%
Dịch chiết Hiện tượng
Hoa sấy khô (M1) Xuất hiện vòng xanh đen Lá cành tự nhiên (M2) Xuất hiện vòng xanh đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1
mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Xuất hiện vòng xanh đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5
mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (M4) Không đổi màu
53
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 4.4 kết quả thử nghiệm với FeCl3 5% M1: mẫu hoa sấy khô.
M2: mẫu cành lá tự nhiên sấy khô.
M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4- D, 1 mg/l BA.
M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA.
ĐC: là dịch chiết các mẫu ban đầu M1 ĐC ĐC ĐC M2 M2 M4 ĐC
54
4.2.1.3. Phản ứng Cyanidin của Wilstatter
Phản ứng dựa trên sự khử bằng bột Mg trong HCl/ethanol trên các dẫn xuất flavonoid. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.3
Bảng 4.3 kết quả thử nghiệm phản ứng Cyanidin
Dịch chiết Hiện tượng
Hoa sấy khô (M1) Xuất hiện màu đỏ đậm Lá cành tự nhiên (M2) Xuất hiện màu đỏ Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1
mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Không đổi màu Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5
mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (M4) Không đổi màu
ĐC ĐC
ĐC
55
Hình 4.5 kết quả thí nghiệm Cyanidin M1: mẫu hoa sấy khô.
M2: mẫu cành lá tự nhiên sấy khô.
M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4- D, 1 mg/l BA sấy khô.
M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA.
ĐC: là dịch chiết mẫu ban đầu. 4.2.1.4. Kết luận sơ bộ
Bảng 4.4 tóm tắt kết quả khảo sát sự hiện diện của hợp chất flavonoid bằng phương pháp trắc nghiệm hóa sinh
H2SO4 đậm đặc FeCl3 5% Phản ứng Cyanidin
Mẫu hoa sấy khô Đậm màu Xanh đen Đỏ
Mẫu cành lá tự nhiên
Đậm màu Xanh đen Đỏ
Mẫu mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l
Đậm màu Xanh đen Không đổi màu
M3 M4
56 2,4-D + 1mg/l BA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA
Đậm màu Không đổi màu Không đổi màu
Theo Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) đã ghi nhận rằng, nếu dịch chiết có chứa hợp chất flavonoid thì:
+ Dịch chiết đậm màu lên khi tác dụng với dung dịch H2SO4 đậm đặc, + Dịch chiết xuất hiện màu xanh đen khi tác dụng với FeCl3 5% . + Dịch chiết xuất hiện màu đỏ trong phản ứng Cyanidin
Từ kết quả của các thí nghiệm (bảng 4.4) cho thấy, trong dịch chiết của hoa sấy khô, cành lá tự nhiên đều cho kết quả dương tính với các phản ứng dung dịch FeCl3 5%, dung dịch H2SO4 đậm đặc và phản ứng Cyanidin . Điều này chứng tỏ, trong dịch chiết của hoa sấy khô có thể có sự hiện diện của hợp chất flavonoid. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Đỗ Tất Lợi (2004),trong hoa, cành lá cây Kim ngân có chứa lonicerin là hợp chất thuộc nhóm flavonoid. Phạm Thanh Kỳ và cộng sự (2002) cũng đã ghi nhận hoa, cành lá tự nhiên của cây Kim ngân chứa flavonoid, chất chính là luteolin-7-rutinosid. Bằng phương pháp HPLC Wie-Jong Kwak cùng cộng sự (2005) đã xác định được hàm lượng loganin từ 13.9%-41.4% thuộc nhóm flavonoid trong cành lá của cây Kim Ngân.
Dưới sự kích thích của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau, mô sẹo hình thành cũng khác nhau về hình thái và màu sắc. Trên môi trường có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA mô sẹo hình thành có màu nâu, xốp, thành khối. Còn trên môi trường có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA mô sẹo hình thành có màu xanh lục, tạo thành khối, cứng.
Qua ba phản ứng đặc trưng để khảo sát sự có mặt của nhóm hợp chất flavonoid thì có thể tạm thời kết luận rằng trong dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA có thể có sự hiện diện của nhóm flavonoid.
57
Dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA cho kết quả âm tính với phản ứng FeCl3 5% và phản ứng Cyanidin nhưng lại dương tính với phản ứng H2SO4 đậm đặc. Tuy nhiên không thể kết luận mô sẹo này có chứa nhóm flavonoid vì H2SO4 đậm đặc là acid mạnh nên có thể có tính phân hủy mạnh đối với một số hợp chất khác ngoài nhóm flavonoid dẫn tới dương tính giả. Từ đó kết luận rằng, dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA có thể không có sự hiện diện của nhóm hợp chất flavonoid.
4.2.2. Khảo sát sự hiện diện của triterpenoid saponin bằng phản ứng Liebermann-Burchard Liebermann-Burchard
Trong mỗi ống nghiệm chứa 1ml dịch chiết mẫu thêm vào đó: 1ml anhydrid acetic, 1ml cloroform, làm lạnh ống nghiệm rồi thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc. Nếu dịch chiết mẫu đổi thành màu xanh dương lục, cam hoặc đỏ; màu này bền không đổi là dương tính. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.5
Bảng 4.5 Kết quả thử nghiệm phản ứng Liebermann – Burchard
Dịch chiết Hiện tượng
Hoa sấy khô (M1) Xuất hiện màu cam đỏ ở mặt phân cách Lá cành tự nhiên (M2) Xuất hiện màu cam đỏ ở
mặt phân cách Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1
mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3)
Xuất hiện màu cam đỏ ở mặt phân cách Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5
58
Hình 4.6 kết quả phản ứng Liebermann – Burchard M1: mẫu hoa sấy khô.
M2: mẫu cành lá sấy khô.
M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4- D, 1 mg/l BA.
M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA.
Kết quả thí nghiệm cho thấy:
- Trong dịch chiết mẫu hoa sấy khô, cành lá tự nhiên có sự xuất thiện vòng cam đỏ. Kết quả cho thấy có thể có sự hiện diện của triterpenoid saponin trong mẫu. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Đỗ Tất Lợi (1964), trong Kim ngân có nhiều saponin. Wie Jong Kwak và cộng sự (2003) phát hiện Loniceroside C là những hợp chất thuộc nhóm triterpenoid saponin trong Kim ngân bằng phương pháp HPLC.
- Dịch chiết của mẫu mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l BA có sự xuất hiện vòng cam đỏ ở mặt phân cách. Điều này chứng tỏ rằng có thể có sự hiện diện của nhóm hợp chất saponin triterpenoid trong mô sẹo này.
59
- Dịch chiết của mẫu mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA trong phản ứng Liebermann-Burchad không đổi màu. Điều này chứng tỏ có thể không có sự hiện diện của nhóm hợp chất saponin triterpenoid trong mô sẹo này.
4.3.Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
4.3.1. Khảo sát sự hiện diện flavonoid (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sắc ký lớp mỏng rất hữu dụng đối với tất cả các loại flavonoid. Các aglycon của flavonol và flavon dễ dàng tách xa nhau (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Vì vậy chỉ cần trong dịch chiết mẫu có một lượng rất nhỏ hợp chất flavonoid thì bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) vẫn có thể phát hiện được bằng cách hiện ra các vết màu đặc trưng với thuốc thử đặc trưng.
Hệ dung môi: CHCl3 : metanol = 89 : 11.
Hệ dung môi này giúp tách các thành phần flavonoid, anthranoid, coumarin, phenolcarbocyclic acid dưới dạng glycosid có trong dịch chiết (Nguyễn Thị Bích,