Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp tạo ra một bước tiến xa trong khoa học thực vật, việc phát triển và sử dụng các công cụ di truyền cũng như sự hiểu biết ngày càng sâu sắc hơn về bản chất của tế bào, nhằm giúp các bạn hiểu rõ hơn về vấn đề này, mời các bạn cùng tham khảo nội dung đồ án tốt nghiệp "Khảo sát một số hợp chất có hoạt tính sinh học trong nuôi cấy mô sẹo cây kim ngân" dưới đây. Hy vọng đây là tài liệu tham khảo hữu ích cho các bạn.
Trang 1MUC LUC CHUONG 1: e1 1 BA >3» 1 1.2 Mục đích và nội dung nghiên cứu ¿+5 «+ ++x+e<+xe++ 1 IPAN N0 0 +11.S 1 1.2.2 Nội dung nghiên CỨU - 6+6 +26 *EEvESskEkEsekrrrserrkreree 2
CHƯƠNG 2: TỎNG QUAN TÀI LIỆU -22- 2522 E+SE+EE2EE£2E2EEE2EE2EEeExerxers 3 2.1 Khái niệm chung về các hợp chất tự nhiên .: -: ¿ 3 2.1.1 Khái niệm 5ccc22Et12EEE 2215211272127 C71 1EEE.Eerrerrrerrer 3
2.1.2 Phan uy nh 5 3
2.2 Khái niệm chung về Thin layer chromatography (TLC) l5
2.2.1 Tổng quát về TLC -¿©-2++++2E+2EE+EE2E2EE2EA222E22EeExcrrr 15
2.3 Ni cây mô tế bào thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp 25 2.3.1 Khái niệm ch vn TT TH Hàn Hàn HH rưy 25
2.3.2 Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật 26
2.3.3 Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học 29 2.4 Giới thiệu chung về Kim ngân hoa 22¿+sz+cxz+zscee 37 na c ẽ ẽ 14< Ỏ 37 2.4.2 Phân bố, thu hái và chế biến -2- 2+ Ext2E+E2Ex2Ezerx2 37 2.4.3 Thành phần hóa học - ¿2 s£+EE2EtEEESEEEtEE2EEerrrrrer 38 2.4.4 Tác dụng dược lý - - LH ng ng ng ng, 39
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2-©22z222xc2czxzsrseee 4I
3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm -2 -¿+sc+cxeczccee 4I
3.2 “ š.3°“°- 4I
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu
3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ
3.2.3 Các loại hóa chất sử đụng -©-2+ck+cxc2kerkzrrrrrrrrrrres 41
Trang 23.3.1.2.Cảm ứng tạo mô sẹo
3.3.2 Chuẩn bị mẫu . - se St+E E1 SE121111511110112111111 11111112 43
3.3.3 Thí nghiệm 2: khảo sat thanh phan flavonoid va saponin triterpenoid trong cây Kim ngân bằng phương pháp thử nghiệm sinh hóa 43 3.3.4 Thi nghiém 3: khảo sát thành phan flavonoid va saponin triterpenoid
bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
3.3.5 Thí nghiệm 4: khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Kim
ngân 45
CHUONG 4: KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN . 22-522225¿2csc2zxzcxeszxsrxee 49
4.1 Thí nghiệm l: cảm Ứng mÔ SỆO .- - 5 5c Sex 49 4.2 Thí nghiệm 2: khao sat thanh phan flavonoid va sapoin triterpenoid bằng phương pháp trắc nghiệm sinh hóa - ¿- 2525z+szz2s2 51
4.2.1 Khảo sát sự hiện diện của fÏlavonoid +5 + + ++<s++<sss+s+ 51 4.2.2 Khảo sát sự hiện diện của triterpenoid saponin
4.43 Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lop mong (TLC)
4.3.1 Khảo sát sự hiện diện flavonoid - + +25 s+++<s++<zs<s+ 59 4.3.2 Khảo sát sự hiện diện triterpenoid -.- +: sx++c<sx+sx+exx+ 62
4.4 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân 65
4.4.1 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân bằng phương pháp khuếch tán qua vòng giấy lọc
Trang 3CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ra một bước tiễn xa trong khoa học thực vật Việc phát triển và sử dụng các công cụ di truyền cũng như sự hiểu biết ngày càng sâu sắc hơn về bản chất của tế bào và các phương thức điều hòa quá trình chuyền hóa trao đổi chất là cơ sở cho việc sản xuất chúng ở quy mô thương mại
Do nhu cầu sử dụng các sản phẩm tự nhiên trong y dược ngày càng tăng nhưng sản lượng của chúng ở cây trồng tự nhiên lại rất thấp đã thúc đây sự phát triển không ngừng của công nghệ nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn Tuy nhiên, các con đường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn trong thực vật cũng như trong nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn là rất phức tạp Vì vậy, các thông tin ở mức độ tế bào và phân tử của các quá trình chuyển hóa là rất cần thiết cho sự phát triển của sản xuất
công nghiệp Nhiều nghiên cứu được đã thực hiện ở các điều kiện khác nhau đề giải
thích các hiện tượng xuất hiện trong quá trình sản xuất các chất trao đôi thứ cấp từ các tế bào thực vật nuôi cấy i vitro Cac két quả này cũng cho thấy các hệ thống nuôi cay tế bào thực vật có tiềm năng rất lớn cho việc khai thác thương mại các chất trao đồi thứ cấp
1.2 Mục đích và nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục đích
Bước đầu khảo sát một vài hợp chất có hoạt tính sinh học có trong mẫu mô sẹo, hoa, cành lá của Kim ngân hoa và thử hoạt tính của chúng lên hai chủng vi
khuan E.coli va Samonella Từ đó tạo tiền đề cho những nghiên cứu tách chiết và
Trang 41.2.2 Nội dung nghiên cứu
Bước đầu khảo sát hai hợp chất có hoạt tính sinh học được biết nhiều trong Kim ngân hoa là saponin triterpenoid và flavonoid bằng hai phương pháp: trắc nghiệm sinh hóa và sắc ký lớp mỏng (TLC)
Trang 5CHƯƠNG 2: TONG QUAN TAI LIEU
2.1 Khái niệm chung về các hợp chất tự nhiên 2.1.1 Khái niệm
Hợp chất tự nhiên, là chất biến dưỡng thứ cấp, có trọng lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bởi cơ thể của một sinh vật Chất biến dưỡng thứ cấp có thể cần thiết hoặc nhiều khi không cần thiết cho sự sống của sinh vật, điều này khác với những hợp chất đại phân tử như protein, acid nucleic, polysacchride là những hợp chất căn
bản cần thiết đối với sự sống của mỗi sinh vật (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007,
Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh) 2.1.2 Phân loại
Các chất biến dưỡng thứ cấp bao gồm nhiều loại hợp chất và được sắp xếp thành những nhóm khác nhau Việc phân loại các hợp chất thành một nhóm thường không phải bởi một định nghĩa duy nhất, cũng như ranh giới của một nhóm thường không rõ ràng
2.1.2.1 Alkaloid
Alkaloid là những hợp chất có tính base yếu, do sự có mặt của nguyên tử nitơ Tính base của các alkaloid cũng khác nhau tùy theo sự hiện diện của các nhóm thế R (mang các nhóm chức khác nhau) gắn trên nguyên tử nito
Các alkaloid chia thành ba loại:
" Alkaloid that: 1a nhitng hop chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính base, thường được sinh tổng hop tir amino acid, phân bố giới hạn trong thực vật và hiện diện trong cây dưới dạng muối của một acid hữu cơ
" Protoalkaloid được xem là những ami có hoạt tính sinh học kể cá mescalin và N, N-dimetyltryptamin Chúng là những amin đơn giản, được tổng hợp từ các amino acid, trong đó nguyên tử nitơ không ở trong vòng dị hoàn
* Gia alkaloid 1a nhimg hop chat không bắt nguồn từ những amino acid, bao
Trang 62.1.2.2 Flavonoid > Khai niém
Flavonoid 1a m6t nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật Hơn một nữa rau quả thường dùng có chứa flavonoid Flavonoid cũng là thành phần hay gặp trong dược liệu có nguồn gốc từ thực vật Cho đến nay có khoảng 4.000 chất đã được xác định cấu trúc Chỉ riêng 2 nhóm flavon và flavonol và với nhóm thế là -OH và / hoặc -OCH; thì theo lý thuyết có thể gặp 38.627 chất Phần lớn các chất flavonoid có màu vàng (flavonoid do từ flavus có nghĩa là màu vàng) Tuy nhiên một số có màu xanh, tím, đỏ, một số khác lại không có màu cũng thuộc nhóm flavonoid Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác không thuộc flavonoid nhung lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon
> Cấu trúc hóa học
Người ta xếp vào nhóm flavonoid những chất có cấu tạo khung theo kiểu Cạ- C;—Cạ hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon + 2ZZ T4 B 3 2 CG tS 4 | a 5 6 Cc _— c
Hình 2.1: khung co’ ban cua flavonoid
Người ta xem cấu trúc này gồm hai phần (được theo đõi bằng chất đồng vị):
+ Cạ— C; (tức là vòng B + 3C) phần này xuất phát từ acid shikimic dẫn
Trang 7p—hydroxyphenylpyruvic acid
4 i
AT 1 pone NH
phenylalanine tyrosine
ax | shenvtalenine aL | “Tin
amino lyace h mino a cinnamic acid GH” oe p- hydroxycinnamic acid _ {fp coumaric acid) ~~ rae ` “oe _ a PHENYLPROPTANOIDS CCg- Cpor[Cg- C-c-c] Hình 2.2: sơ đồ hình thành phenylpropanoid
+ Cạ hay là (vòng A) xuất phát từ 3 đơn vị acetat dẫn đến acid triacetic Sau đó 2 phần được ghép lại tạo thành chalcone
Hình 2.3: cấu tạo cơ bản của chalcone
Trang 8Hình 2.4: cấu tạo cơ bản của flavan > Phan loai flavonoid
Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí của géc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hóa của mạch 3C Người ta chia ra: Euflavonoid là các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C— 2, isoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C — 3, neoflavonoid có gốc ary ở vị trí C — 4 Người ta còn phân biệt biflavanoid 1a nhimg flavonoid dimer, triflavonoid cau tạo bởi 3 monomer flavonoid, flavolignan là những flavonoid mà phân tử có một phân cấu trúc ligan
Euflavonoid: bao gồm các nhóm: anthocyanidin, flavan, flavan 3-ol flavan 4— ol, 3,4-diol, flavanon, 3-hydroxy flavanon, flavon, flavonol, dihydrochalcon, chalcon, auron
Isoflavonoid: bao gồm nhiều nhóm khác nhau: isoflavan, isoflav-3-ene, isoflavan — 4 —ol, isoflavanon, isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3— arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, dihyroisochalcon, homoisoflavon Isoflavonoid thuong gap trong hg Dau — Fabaceac
Neoflavonoid chỉ có giới hạn trong một số loài thực vật, bao gồm: + arylchrroman, 4—arylcoumarin, dalbergion
Trang 9> Sự phân bố flavnoid trong thực vật
Trong thực vật bậc thấp flavonoid ít được gặp Trong ngành rêu chỉ phát hiện được rất ít chất Trong dương xỉ sé lượng flavonoid ít nhưng đều có mặt các nhóm anthocyanin, flavanon, flavon, flavonol, chalcon, dihydrochalcon
Ngành hạt trần có khoảng 700 loài, 20 họ, số lượng flavnoid cũng không
nhiều nhưng cũng đủ các nhóm anthocyanidin, leucoanthocyanidin, flavanon, flavon, flavonol, isoflavon Nét đặc trưng của nghành hat trần có khác thực vật bậc thấp và
ngành hạt kín ở chỗ sự hiện diện của nhiều dẫn chất biflavonoid
Flavonoid tập trung chủ yếu vào ngành hạt kín ở lớp 2 lá mầm Có rất nhiều họ chứa flavonoid và đủ các loại flavonoid Tuy nhiên cũng có một vài nét đặc trưng cho một số họ ví dụ họ Asteraceae là một họ lớn với 15.000 loài, 1000 chi, có rất nhiều dẫn xuất thuộc các nhóm khác nhau Tuy nhiên, một số chỉ có nét đặc trưng riêng cua no, vi du trong cac chi Carthamus, Coreopsis, Cosmos, Dahlia thi hay gap các dan chat chalcon va auron Chi Gymnosperma, Ageratum thi gap cdc dan chat flavon và flavonol có nhiều nhóm thế có oxy (có thể đến 8 nhóm) Họ Fabaceae thì hay gặp các chất thuộc nhóm isoflavonoid Họ Rutaceae thường gặp các flavon va flavonol có nhiều nhóm methoxy Họ Theaceae hay gặp các flavan-3-ol Họ Ranunculaceae và Paeoniaceae hay gặp dẫn chất flavonol 3,7 diglycosid Họ Rosaceae chi Rubrus va Prunus 6 trong qua hay gặp anthocyanin có mạch đường phan nhanh Ho Polygonaceae 6 chi Hydropiper hay gap cac flavon va flavonol sulfat
Lớp một lá mầm có 53 họ nhưng cho đến nay chỉ khoảng trên 10 họ tìm thấy có flavonoid: Amaryllidaceae, Araceae, Cannaceae, Commelinaceae, Iridaceae, Lemnaceae, Liliaceae, Musaceae, Oridaceae, Poaceae
Trang 10Phenylalanine 4-Coumaryl CoA Malonyl CoA Chalcone synthase Chalcone Chalcone isomerase Flavanone ~^ | Flavanone 3-hydroxylase (F3H) Flavones, isoflavones, flavan-4-ols Dihydroflavanol (Colorless) at
Anthocyanins Flavanol glycosides (Red pigmentation) (Colorless)
Hình 2.5: sơ đồ sinh tổng hợp flavonoid
> Tinh chat
Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt có khi không có màu (trường hợp các nhóm OH đã methyl hóa), flavonol vàng nhạt đến vàng, chalcon và auron vàng đậm, đến đỏ cam Các chất thuộc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanon, flavanonol, leuco-anthocyanidin, flavan-3-ol do không có nối đôi liên hiệp giữa vòng B với nhóm carbonyl nên không màu
Các dẫn chất anthocyanidin thì màu thay đổi tùy theo pH của môi trường Tuy nhiên khi các flavonoid ở trong các bộ phận của cây thì còn phụ thuộc vào hỗn hợp với các sắc tố khác
Trang 11> Tác dụng sinh học của flavonoid
Các dẫn chất flavonoid có khả năng loại bỏ các gốc tự do như -HO, -ROO Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DNA thì sẽ gây ra những ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng nhanh sự lão hóa Thí nghiệm cho thấy khả năng ức chế của một số flavonoid theo thứ tự: myriceum > quercetin > rhammetin > morin > diosmetin > naringenin > apigenis > catechin > 5,7 dihydroxy—3’, 4’, 5’ trimethoxy flavon > robinin > kaempferol > flavon
Flavonoid tao duge phức với các ion kim loại mà chính cac ion kim loại này là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hóa Các flavonoid có 3, 5, 3°, 4 hydroxyl có khả năng liên kết tốt với các ion kim loại đó theo phức oxychromon, oxycarbonxyl hoặc 3°, 4ˆ orthodioxyphenol
Thành phần của màng tế bào có các hoạt chất lipid dễ bị peroxyde hóa, tạo ra
những sản phẩm làm rối loạn sự trao đồi chất cũng như đến sự hủy hoái tế bào Đua các chất chống oxy hóa như flavonoid vào cơ thể đề bảo vệ tế bào thì có ngăn ngừa các nguy cơ như xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, tổn thương do bức xạ, thoái hóa gan
Trang 12Tác dụng chống độc của flavonoid thé hién lam giảm thương tổn gan, bảo vệ được chức năng gan khi một số chất độc được đua vào cơ thể sinh vật thí nghiệm (CCl, benzene, ethanol, CHCl;, quinine, novarsenol, ) Dưới tác dụng cua flavonoid ngưỡng ascorbic được ồn định đồng thời lượng glycogen trong gan tăng Sự tích lũy glycogen có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao chức năng giải độc gan
Việc sử dụng một số được liệu trong điều trị viêm gan, xơ gan, bảo vệ tế bào gan rất hiệu quả như: cây actiso, có biệt duge la Chophytol Cay Silibummarianum Gaerfn có biệt được “Legalon”; cây bụt dấm — Hibiscus sabdariffa
Tac dung kich thich tiết mật thể hiện ở các chất thuộc nhóm flavanon, flavon, flavonol, và flavan-3-ol
Flavonoid thể hiện tác dụng chống co thắt những tổ chức cơ nhẫn (túi mật, ống dẫn mật, phế quản và một số tổ chức khác) Ví dụ apigemin có tác dụng làm giảm co thắt phế quản gây ra bởi histamin, acetylcholine, serotonin
Trên bộ máy tiết niệu, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, flavonon, flavonol thể hiện tác dụng thông tiểu rõ rệt Scoparosid trong SŠarofhammus scoparius, lespecapitosid trong Lespedeza capiata, quercitrin trong lá điếp cá, flavonoid của cây râu mèo đều có tác dụng thông tiểu
Tác dụng chống loét của flavanon và chalcon glycoside của rễ cam thảo đã được ứng dụng đề chữa đau đạ dày Một số dẫn chất khác như catechin, 3—~O- methyl catechin, naringennin cũng đã được thử thấy có tác dụng chống loét
Tác dụng chống viêm của nhiều flavonoid thuộc các nhóm flavon, flavonon, dihydroflavonol, anthocyanin, flavan-3-ol , chalcon, isoflavon, biflavon, 4—aryl coumarin, 4-aryl chroman đều được chứng minh bằng thực nghiệm do các chất flavonoid này ức chế con đường sinh tổng hợp prostaglandin
Người ta đã sir dung rutin, citrin, leucodephinidin, quercetin, catechin đề điều trị ban đỏ, viêm da, tốn thương da va mang nhay trong trường hợp xạ trị
Trang 13Cao chiết từ lá cây bach qua (Ginko biloba) chứa các dẫn xuất 3-rutinosid của kaempferol, quercetin va isorhammetin (trong lá già đã vàng thì chứa ginkgetin và
isoginkgetin) đã được một số hãng của Pháp bào chế thành biệt được ví dụ
“Ginkogink”, “Tanakan” có tác dụng tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch Thuốc dùng cho những người có biểu hiện lão suy: rồi loạn trí nhớ, khả năng làm việc trí óc sút kém, mat tập trung tư tưởng, hay cáu gắt
Trên hệ thần kinh, một số C- lavon glycoside cua hat tao — Ziziphus vulgaris var spinosus (chứa spinosin, swertisin và các dẫn chất acyl của spinosin) có tác dụng an thần rõ rệt
Một số tài liệu gần đây có nói đến tác dụng chống ung thư của một số chất như leucocyanidin, leucopelargonidin, leucodelphinidin và tác dụng kháng HIV của một số dẫn xuất thuộc nhóm flavon như chrysin, acacein 7-O-f-D- galactopyranosid
Các dẫn xuất thuộc nhóm isoflavonoid có tác dụng tương tự estrogen ví dụ như genistein daizein Tác dụng này được giải thích do sự gần nhau về cấu trúc với điethylstiboestrol
Một số flavonoid khác thuộc nhóm rotenoid như chất rotenon có trong dây mật — Deris ellptica Benth thi tac dụng diệt côn trùng đã được biết và đã được ứng dụng từ lâu
2.1.2.3 Saponin
> Định nghĩa
Trang 14-_ Độc với cá vì saponin làm tăng tính thắm của biểu mô đường hô hấp nên làm mắt các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sắn, ốc sên
- Kich ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu cao gây nôn mửa, đi lỏng
- Có thê tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3- Ä-hydroxysteroid khác Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài saponin Ví dụ: sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức với cholesterol Saponin đa sỐ có vị đắng trừ một số như glycyrrhizin có trong cam thảo bắc, abrusosid trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodđium vulgare có vị ngọt
Saponin tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan do đó người ta dùng ba dung môi này để tủa saponin Saponin có thể bị tủa bởi chì acefate, barihydroxyd, ammoni sulfate Saponin kh6 bi tham tich, người ta dựa vào tính chất nay dé tinh chế saponin trong quá trình chiết xuất Phần genin tức là sapogenin va dẫn xuất acetyl sapogenin thường dễ kết tỉnh hơn saponin
Trang 16> Công dụng
- _ Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho Saponin là hoạt chất chính trong các dược liệu chữa ho như viễn chí, cát cánh, cam thảo, thiên môn, mạch môn -_ Một số dược liệu chưa saponin có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải,
thiên môn, mạch môn
- Saponin co mat trong một số vị thuốc bổ như nhân sâm, tam thất và một số cây thuộc họ nhân sâm khác
- _ Saponin làm tăng sự thấm của tế bào: sự có mặt của saponin sẽ làm cho các
hoạt chất khác dễ hòa tan và hấp thu
-_ Một số saponin có tác dụng chống viêm Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nắm, ức chế virus
-_ Một số có tác dụng chống ung thư
-_ Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm (nhuyễn thé) > Sự phân bố trong thực vật
Saponin steroid thường gặp trong những cây một lá mầm Các họ thường gặp la: Amaryllidaceae, Dioscoreaceae, Liliaceae, Smilacaceae
Saponin triterpenoid thường gặp trong những cây 2 lá mầm thuộc các họ như: Acanthaceae, Amaranthaceae, Araliaceae, Campnulaceae, Caryophyllaceae, Fabaceae, Polygalaceae, Rubiaceae, Sapindaceae, Sapotaceae,
Trong cây saponin thường tích lũy ở những bộ phận khác nhau: tích lũy ở quả
bồ kết, bồ hòn; rễ cam thảo, viễn chí, cát cánh; lá như dứa Mỹ 2.1.2.4 Hop chat glycoside
Cac glycoside hién dién trong rat nhiều họ thực vật và ở tất cả các bộ phận cây: lá, vỏ, hạt, .Các glycoside thường là chất kết tỉnh và có vị đắng
Glycoside là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm có hai phần: phần đuờng và phần không đường thường được gọi là aglycon Dưới tác dụng của enzyme thực vật hoặc dung dịch acid hoặc kiềm, glycosid bị thủy phân thành aglycon và phần đường:
Trang 17+ Phần aglycon của glycosid: phần aglycon rất đa dạng và gồm tất cả các loại hợp chất tự nhiên như: monoterpen, sesquiterpen, diterpen, triterpen, steroid, iridoid, flavonoid, alkaloid, quinonoid, polyphenol
2.1.2.5 Hop chat phenol
Cac hop chat phenol dung dé chi chung cac hgp chat ma trong cau trúc có vòng benzen mang một hoặc nhiéu nhém chtre hydroxy — OH Trong thiên nhiên, các hợp chất phenol la: flavonoid, xanthon, courmarin, quinon, các phenol đơn vòng, các polyphenol (ligin, tanin, )
Các hợp chất phenol dễ tan trong nước vì chúng thường hiện diện trong cây ở dang glycosid Nhiều hợp chất phenol có màu sắc tự nhiên, nên có thê đựa vào đặc điểm này đề theo dõi chúng trong quá trình chiết tách, cô lập chúng ra khỏi cây cỏ Các hợp chất phenol thường bị hủy hoại do tác dụng của enzmye phenolase vốn luôn có trong cây vì thế nên sử dụng alcol nóng đề chiết tách do alcol giúp hạn chế tác dụng của enzyme này
Sinh tổng hợp các hợp chất đã được biết từ rất sớm, đi từ ba amino acid là phenylamin, tyrosin, tryptophan Quá trình này xảy ra ngang một chuỗi các phản ứng phức tạp để cho phenylalanin, tyrosin, tryptophan và từ đó dẫn đến những hợp chất phenol
2.2 Khái niệm chung về Thin layer chromatography (TLC)
2.2.1 Tổng quát về TLC
Kỹ thuật sắc ký đã được sử dụng từ nhiều thế kỷ trước để tách các phẩm
nhuộm từ cây cỏ Đến thập kỷ 1930 — 1940, phương pháp này được phát triển nhanh chóng với nhiều kỹ thuật khác nhau Có các loại sắc ký: sắc ký giấy (kỹ thuật sớm nhất, hiện nay ít được sử dụng vì hiệu quả tách kém thua kỹ thuật sắc ký lớp mỏng), sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực, sắc ký lỏng hiệu năng cao, điện di
Trang 18kiến, tắm nhôm hoặc tấm plastic Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng
Pha tĩnh (chat hap
thu)
Mẫu cần phân tích
Bình sắc ký: một chậu, hũ, lọ, bằng thủy tỉnh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy
Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0.25 mm của một loại chất hấp thu, thí dụ như silica gel, alumin, được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tắm kiếng, tắm nhôm hoặc tắm plastic Chat hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ sulfat calci khan, hoặc tỉnh bột, hoặc một loại polymer hữu cơ Nắp đậy bình sắc ký Tắm lớp mỏng bằng plastic hoặc nhôm Pha động (dung môi) Hình 2.11: bình sắc ký lớp móng
Mẫu cần phân tích: mẫu chất cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chat với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng II dung địch mẫu với nồng độ loãng 2 — 5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình
Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi, di chuyên cham chậm dọc theo tắm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chat đi theo nó Dung môi di chuyền đi lên cao nhờ vào tính mao quản Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi Vận tốc di chuyền này tùy thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh (hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi
Trang 19Với chất hấp thu là silica gel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực di chuyền chậm
2.2.1.1 So sánh TLUC với kỹ thuật sắc ký khác
Sắc ký lớp mỏng có ưu điểm: sử dụng ít chất hấp thu, cần rất ít mẫu phân tích (vi lượng), quá trình triển khai sắc ký nhanh nên trong một thời gian ngắn có thẻ biết ngay kết quả mẫu cần phân tích có chứa bao nhiêu chất khác nhau
So với phương pháp sắc ký lớp mỏng, phương pháp sắc ký cột cổ điển cho kết quả kém hơn do phải sử dụng một lượng lớn chất hấp thu, chất mẫu và dung môi nên
quá trình thực hiện phải kéo dài, dẫn theo kết quả không tốt Tiếp theo, kỹ thuật sắc
ký lớp mỏng mới là sắc ký cột chớp nhoáng (flash column chromatography) do có sử dụng thêm áp suất nên rút ngắn được thời gian thao tác và khả năng tách riêng các chất ra khỏi hỗn hợp ban đầu, đã cho kết quả gần đạt được so với sắc ký lớp mỏng, tuy vật vẫn mất thời gian Những năm gần đây kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp cho kết quả nhanh, tốt, cả về mặt định tính lẫn định lượng nhưng may rat đắt tiền, không phải phòng thí nghiệm nào cũng có khả năng trang bị
Bảng 2.1: so sánh các đặc trưng của các kỹ thuật sắc ký Sắc ký lớp | Sắc ký cột | Sắc ký cột | Sắc ký khí | Sắc ký móng cỗ điển chớp HPLC nhoáng Cơ chế sắc |_ Hấp thu/ Hấp thu Hấp thu Phân chia | Phân chia ký phân chia
Trang 20
Hiệu quả Rât tôt Can sac ky | Can sac ky Rat tot Rat tot
tach chat vai lan vai lan dinh tinh Hiéu qua Có thể Cân sắc ký | Cần sắc ký Rất tốt Rất tốt tách chất vài lần vài lần định lượng Khả năng Có thê Rat tot Rat tot Có thê, Rat tot tách lượng nhưng rất lớn mẫu khó
2.2.1.2 Ưu điểm của TUC
Chỉ cần một lượng rất ít mẫu đề phân tích
Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng, trong cùng điều kiện phân tích
Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thẻ được định vị trên tắm sắc ký lớp mỏng; trong khi so với HPLC: những hợp chất có tính phân cực mạnh sẽ có sắc ký đồ ở dạng một mũi (để chỉ sự hiện điện của một chất) hay chi la tap ban
2.2.2 Các bước chuẩn bị trước khi TUC 2.2.2.1 Chấm mẫu lên tắm bán móng
= Chuan bj tam bản mỏng: từ tắm bản mỏng thương mại 20 x 20 cm,
dùng kéo cắt các bản với kích thước cần thiết Lưu ý sao cho tắm bản
mỏng phải lọt được vào bình giải ly
Dùng bút chì đề vạch nhẹ các nét mức xuất phát và mức kết thúc
"_ Chuẩn bị dung dịch mẫu: Với mẫu là chất lỏng, có thể chấm trực tiếp
mẫu lên bản mỏng; trường hợp đây là dung dịch quá sệt, có thể pha
loãng mẫu Với mẫu là chất rắn, phải hòa tan hoàn tồn mẫu trong
dung mơi hữu cơ phù hợp, với nồng độ 2 — 5%; dung môi hòa tan mẫu
không nhất thiết phải là dung môi giải ly
Trang 21(hoặc một ống nhỏ có khắc độ bằng thủy tinh dé rút dung dịch) nhúng vào dung dịch mẫu, lực mao dẫn sẽ tự hút dung dịch lên vi quản, rồi đặt đầu vi quản chạm nhẹ lên bề mặt của tắm lớp mỏng, dung dich trong ống sẽ chảy ra và thám lên tắm lớp mỏng Phải nhanh chóng nhac vi quản rời khỏi tâm lớp mỏng, để vết chấm chỉ lan rộng ra thành vết tròn có đường kính từ 2 — 5 mm
TLC (sắc ký lớp mỏng) là phương pháp định tính vì thế mỗi vết chấm trên bản
không nên chứa nhiều hon 12 microgam (10 microgram là tối ưu) mẫu chất Với một mẫu, có thể chấm nhiều lần, nhưng giữ cho vết chấm đừng lan rộng ra trên bản, vết phải có đường kính từ 2 - 5 mm; muốn thế, sau mỗi lần chấm, dùng miệng thôi hơi nhẹ hoặc dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm, rồi mới chấm tiếp theo vài lần nữa cho đến khi đủ lượng cần cho một vết chấm
Sau khi chấm hoàn tat, dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm, rồi nhúng bản vào dung dịch giải ly; điều này đặc biệt cần thiết nếu dung dịch pha
mẫu là nước hoặc loại dung môi có độ bay hơi kém
Nếu cần khảo sát một lượt nhiều mẫu khác nhau, chuẩn bị các dung dịch mẫu này, mỗi dung dịch mẫu chấm lên cùng một bản, vét này cách vết kia lem Hai vết ở ngoài bìa phải các bờ cạnh 1.5 cm (đối với có kích thước 20 x 20cm)
Với bản sắc ký lớp mỏng điều chế, dung dịch mẫu sẽ được chấm lên bản
thành một đường dài, đều, dọc theo mức xuất phát Có thể áp dụng khoảng 10 mg
cho một bản có kích thước 20 x 20 cm và chiều dầy bản 5mm Trên mức kết thúc dung môi (cách bờ cạnh trên 0.5 — 1 cm), nên dùng một đầu viết chì vót nhọt vạch
một đường hẳn xuống lớp hấp thu Làm như thế, khi dung mdi giải ly đi lên đến đầu
trên sẽ bị buộc phải ngừng lại, giúp cho mỗi bản sẽ có kết thúc giống như nhau Khi dung môi lên đến đầu trên của bản, không nên để bản ở lâu trong bình,
nên lây bản ra khỏi bình giải ly, vì sự khuyếch tán và sự bay hơi dung môi có thé lam các vết vừa tách được sẽ bị trải dài ra
Trang 222.2.2.2 Giải ly bản mỏng
Chuẩn bị bình có kích thước lớn hơn một chút so với kích thước của bản mỏng Kích thước của bình và lượng thể tích đung môi giải ly sẽ ảnh hưởng lên giá trị Rf của mẫu Cần sử dụng bình nhỏ nhất nếu có thể vì như thế bầu khí quyên sẽ nhỏ nhất
Cho dung môi hoặc hỗn hợp dung môi vào bình Với sắc ký lớp mỏng định tính, chỉ cần một thể tích koảng 10 ml dung môi Quan sát chiều dầy của lớp dung môi trong bình giải ly: không được cao quá 1 cm, bởi vì các vết chấm mẫu trên bản mỏng cách bìa là Icm
Nếu sắc ký lớp mỏng với các tắm bản lớn, sử dụng bình lớn, phải tính toán thể
tích dung môi trong bình không cao hơn khoảng cách của vết chấm trên bản mỏng (vết chấm trên bản mỏng không được ngập vào trong dung môi khi vừa mới thả bản vào bình)
Trước khi cho tắm bản mỏng vào bình, bình cần phải được bão hòa dung môi
để có một bầu khí quyền đồng nhất, thực hiện bằng cách phủ bề mặt trong của bình bằng một tờ giấy lọc, nghiêng đảo nhẹ bình giải ly đề dung môi thắm ướt tờ giấy lọc
Một hậu quả dễ thấy là nếu bình không được bão hòa dung môi, khi dung môi giải ly
là hệ hỗn hợp, mức tiền tuyến dung môi sẽ có hình lõm (hình lòng chảo) do dung môi di ở hai bênh cạnh nhanh hơn đi ở giữa bản
Đặt tắm bản mỏng vào bình triển khai, cạnh đáy của bản ngập vào dung dịch giải ly khoảng 0.5 — 1 cm Hệ dung môi phù hợp là sau khi giải ly, hệ sẽ cho các vết chính có Rf khoảng từ 0.3 đến 0.6
2.2.2.3 Hiện hình các vết sau giải ly
Sau khi giải ly xong, các hợp chất có màu sẽ được nhìn bằng mắt thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vét,
cần sử dụng phương pháp hóa học hoặc vật lý
> Phương pháp vật lý
Trang 23quanh bằng vật liệu màu đen để tạo phòng tối; trên nắp thùng có gắn hai bóng đèn UV với hai loại bước sóng là tt = 254 nm và 366 nm Thùng có cửa mở ở bên hông Muốn nhìn bản bằng đèn UV: mở cửa, đặt tắm bản mỏng vào bên trong, ở đáy thùng, đóng cửa lại, bật công tắc cho đèn sáng và quan sát tắm bản mỏng từ bên ngoài, từ trên cao nhìn xuống ngang qua một cửa số bằng kiếng
Đèn chiếu tia UV 254 nm: ánh sáng này để nhận ra các hợp chất có thé hap
thu tia UV Các hợp chat sẽ tạo thành vết có màu tdi sam
Nếu sử dụng bản mỏng thương mại ví dụ silica gel 60 F254, bản mỏng này là silica gel có trộn thêm chất chỉ thị phát huỳnh quang (silicat kẽm có Mn hoạt hóa) hấp thu ánh sáng ở bước sóng 254 nm, như vậy đưới ánh sáng 254 nm, tắm bản sẽ có màu xanh lục chói Nếu trên tắm bản có một vết của hợp chất mà hợp chất này cũng hấp thu ánh sáng ở bước sóng 254 nm, vết này sẽ che mất huỳnh quang, xuất hiện là một vệt tối trên nền sáng
Đèn chiếu tia UV 366 nm: ánh sáng này dùng để phát hiện những hợp chất
phát huỳnh quang Các vết của chất mẫu có màu sáng trên nền bản mỏng sẫm màu “_ Một số điểm cần lưu ý:
Có thể thay thế dụng cụ nêu trên bằng máy kiểm tra tiền, nhưng khi sử dụng cần thận vì máy này không có thùng che chắn tia UV giống như dụng cụ nói trên, nhưng biết rằng tia UV có thể gây đột biến gen
Bản mỏng với chất hap thu có trộn thêm chất chỉ thị phát huỳnh quang có thé gây nên sự thay đổi vị trí của các vết trên bản: vết ở đúng vị trí này nhưng lại nhìn thấy vết ở ví trí khác, điều này gây nên nhưng nhằm lẫn tai hại
> Phương pháp hóa học
Phương pháp hóa học là phát hiện các vết bằng thuốc thử, bằng cách hòa thuốc thử vào một dung môi thích hợp rồi phun xịt đung dịch thuốc thử này lên bản mỏng Thuốc thử sẽ kết hợp với các hợp chất để tạo ra các dẫn xuất có màu Các thuốc thử được xếp thành 2 loại: đặc trưng và không đặc trưng
Thuốc thử không đặc trưng khi nó tạo vết có màu hầu hết với các loại hợp
chất hữu cơ, thí dụ như: iod, acid sulfuric, rhodamin B, chat chi thi phat huynh
Trang 24Thuốc thử đặc trưng khi nó chỉ tác dụng với những hợp chất có chứa những nhóm chức hóa học đặc biệt, tạo vết có màu đặc trưng Thí dụ: thuốc thử dinitrophenylhydrazin tác dụng với những hợp chất có chứa nhóm carbonyl để tạo màu đỏ đậm
> Phun xịt dung dịch thuốc thử lên bản mồng
Muốn khảo sát các hợp chất trên bản mỏng bằng các thuốc thử đặc trưng, phải thấm bản mỏng với dung dịch thuốc thử, có thể thực hiện theo hai cách
+ Phun xit bản mỏng bằng bình phun xịt: Thuốc thử pha theo quy định và cho
vào bình, thể tích thuốc thử chỉ được chiếm tối đa hai phần ba thể tích chứa
của bình Sử dụng khí nén hoặc dùng một bóp cao su để tạo sức nén, giúp dung dịch đi ra khỏi bình ở dạng giọt sương mịn Phải bóp vài cái trước đề tạo ra các giọt sương đều, rồi mới hướng đầu ra của bình vào tắm bản mỏng, sao cho hơi sương phủ đều lên bề mặt bản mỏng Phương pháp có ưu điểm là dung địch thuốc thử được sử dụng với lượng vừa đủ để tạo phản ứng màu với hợp chất trên bản mỏng, nhược điểm là cần có thao tác khéo léo chuyên nghiệp nếu không dung dịch thuốc thử được phủ lên bản không đều, chỗ nhiều gây loang lỗ, chỗ ít không đủ để làm xuất hiện vét
+ Nhúng bản mỏng vào một lọ có chứa dung dịch thuốc thử Ưu điểm của phương pháp này là đung dịch thuốc thử có thể phủ đều lên mặt bản: nhược điểm là các chất mẫu nằm trên bản khi gặp một lượng lớn thuốc thử sẽ hòa tan luôn thuốc thử, có thể biến mắt khỏi bản Sau mỗi lần nhúng bản vào dung dịch, một lượng nhỏ chất hấp thu silica gel sẽ rơi vào dung dịch, sau một thời gian, đáy bình chứa đây silica gel, do đó phải thay dung dịch mới
Trang 252.2.2.4 Lưu giữ vết để làm tài liệu
Sau khi giải ly bản, cần ghi lại những thông tin cần thiết Các chỉ tiết có thể ghi lên mặt trước của bản bằng bút chì, hoặc ghi lên mặt sau bằng bút benzen Các chỉ tiết như: dung môi giải ly, giá trị Rf của mẫu chất, hình dạng, màu sắc của vết,
thuốc thử dùng để hiện hình các vết
Tờ bản mỏng cần được lưu giữ bằng cách bảo quản trong một bao plastic Nhưng nếu đề lâu, bán cũng sẽ bị phai màu hoặc hư hỏng Tốt nhất là đối với các bản quan trọng cần phải lưu tài liệu, có thể làm các cách như sau:
+ Dat tim ban mong dưới một tờ giấy trong, dùng bút chì tô lại các vết đậm, nhạt, vị trí vết
+ Photocopy lai tam ban mong
+ Tốt nhất là chụp hình màu đề lưu lại hình ảnh nguyên tắm bản với đầy đủ màu
sắc của các vết
2.2.2.5 Ung dung cia TLC
> Để công bố các đặc điểm của một hợp chất
Một hợp chất tinh khiết có một vét với sắc ký lớp mỏng, với giá trị Rf không
đổi, trong một hệ dung môi giải ly xác định, bởi bản sắc ký của một lô sản xuất nhất định
Trang 26Tiền tuyến dung môi Mức xuất phát R= a_ đoạn đường di chuyên cna hep chat
th” đoạn đường đi chuyên của dưng môi
Hình 2.12 hình minh họa bản sắc ký
Nếu vết mẫu hiện trên bản mỏng là một vết tròn, nhỏ, đo khoảng cách từ mức xuất phát đến tâm của vết đo Nếu vết mẫu quá to, phái thực hiện sắc ký bản mỏng lại, giảm lượng mẫu chấm, sao cho vết hiện nhỏ, gọn
Gia tri Rf cua hợp chat thay đổi tùy theo nhiều yếu tố:
+ Loại bản mỏng silica gel hoặc alumina của hãng Merk hay Prolabo (bản mỏng tráng sẵn dù của cùng một hãn sản xuất cũng khác nhau tùy theo lô sản xuất) + Hoạt độ của bản lúc sử dụng khác nhau tùy theo thời gian tồn trữ lâu, mau + D6 day ctia bản
+ Thành phần của dung môi giải ly, chi cần thay đổi một ít cũng làm ảnh hưởng
kết quả Độ bão hòa dung môi trong bình giải ly của hai lần giải ly khác nhau cũng khác nhau
+ Kỹ thuật giải ly: đung môi đi lên hay đi xuống cũng cho kết qua khác nhau Lượng mẫu chấm lên bán nhiều hay ít cũng làm vị trí của vết trên bản thay đồi
> Để tìm hiểu sơ bộ về tính chất của mẫu chất khảo sát
Trang 27cần phải dò tìm mới có thể chọn ra được một hệ dung môi phù hợp làm rải các hợp chất ra trên cùng một bản mỏng
Nhìn số lượng các vết hiện trên bản để đoán biết mẫu ban đầu có chứa bao nhiêu hợp chất Lưu ý: do bản mỏng có độ phân giải thấp cho nên nhìn thấy một vết
trên bản mỏng không có nghĩa đó là một chất, mà đó có thê là hai hoặc ba chat ty lai
với nhau
Đề kiểm tra độ tỉnh khiết của một hợp chất: phân tích cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất, mẫu này phải đạt độ tính khiết >
95% Kiểm tra độ tinh khiết của một hợp chất hiệu quả nhất là HPLC, máy sẽ cho
biết luôn hàm lượng phần trăm của mẫu chất Tuy nhiên, thực hiện như thế sẽ khá tốn kém vì HPLC cần có các loại dung môi tỉnh khiết tiêu chuẩn của HPLC Có thể tự mình kiểm tra độ tỉnh khiết của một hợp chất bằng sắc ký lớp mỏng
Chuẩn bị ba bản giống nhau, có vết mẫu Thực hiện sự giải ly, mỗi bản với
một hệ dung môi giải ly khác hẳn nhau Ba hệ dung môi phải lựa chọn như thế nào để có: một hệ dung môi đầy các vết di chuyển gần với mức xuất phát; một hệ dung môi đấy vét di chuyển đến khoảng giữa bản và một hệ dung môi đây vết di chuyển xa với mức xuất phát
Nếu cả ba bản lúc nào cũng cho thấy vết tròn, gọn là mẫu tỉnh khiết, còn chỉ cần một bản có thêm các vét khác, là mẫu có lẫn bản, cần tỉnh chế thêm
2.3 Nuôi cấy mô tế bào thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp 2.3.1 Khái niệm
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện các hợp
Trang 28sản xuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các mô có khả năng phân hóa cao như rễ, lá và hoa Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thành không xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất thứ cấp có khuynh hướng ngưng tạo thành trong quá trình nuôi cây Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào
ở giữa khối có sự tiếp xúc với môi trường khác với các tế bào ở bên ngoài nên sự
phân hóa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối tế bào để tạo thành các chất thứ cấp (Lee, 2001)
Nuôi cấy huyền phù tế bào thường khởi đầu bằng cách đặt các khối mô sẹo dễ
vỡ vụn trong môi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy) Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyền động xoáy của môi trường Sau một thời gian ngắn trong dịch huyền phù sẽ có các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, mẫu nuôi cấy còn thừa chưa phát triển và các tế bào chết Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền phù hoàn hảo, chứa tỉ lệ cao các tế bào đơn và tỉ lệ nhỏ các cụm tế bào Mức độ tách rời của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc
vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thé điều chỉnh bằng cách thay đổi thành
phần môi trường (Misawa, 1994)
Bên cạnh nuôi cấy huyền phù tế bào, nuôi cấy mô sẹo (trên môi trường rắn) có ưu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu nhưng nhược điểm là thể tích nuôi cấy ít nên khó phát triển ở quy mô công nghiệp, mẫu nuôi cấy chỉ tiếp xúc được một mặt với nguồn dinh dưỡng, những sản phẩm do mẫu nuôi cấy tạo ra trong quá trình trao đôi chất sẽ tích tụ xung quanh dẫn đến việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật vì có thể duy trì và thao tác tương tự với các hệ thống lên men vi sinh vật ngập chìm trong môi trường lỏng
2.3.2 Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật
Trang 29cấp (Dicosmo và Misawa, 1995) Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được khởi xướng từ cuối những năm 60 của thế kỷ 20 như là một công cụ hữu ích để nghiên cứu và sản xuất
hợp chất thứ cấp thực vật Kỹ thuật này được phát triển với mục tiêu cải thiện hiệu
suất các sản phẩm có hoạt tính sinh học Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên những lý do sau:
+ Tổng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các yếu tô môi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và điều kiện đất trồng
+ Phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng)
+ Có thể chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau;
+ Với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng củatế bào và điều hòa quá
trình chuyên hóa, chỉ phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên Bên cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thay nuôi cấy tế bào huyền phù của thực vật cũng được sử dụng để sản xuất các sản phẩm protcin tái tổ hợp (Fisher va cs, 1999) Glucose Giycolysis “ — pathway Bhosgie si Erythrose 4-phosphate pyruvate
Pyruvate Shikimate pathway
6-Deoxyxylulose Aliphatic Aromatic Hydroxy-
Trang 30Trong nuôi cấy tế bào, việc chọn lựa cẩn thận các tế bào có khả năng phát triển và điều kiện nuôi cấy tối ưu sẽ giúp tăng khá năng tích lũy một vài sản phẩm ở mức cao hơn Để thu được hiệu suất cao cho khai thác thương mại, người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau trong nỗ lực tập trung vào việc kích thích hoạt động sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy (Rao, 2000; Dixon, 1999) Tế bào ni
cấy tích lđy một lượng lớn hợp chất thứ cấp chỉ khi ở những điều kiện đặc biệt như:
+ + +
Chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp Chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao
Bồ sung tiền chất nuôi cấy và các chất kích kháng bảo vệ thực vật (Mulbagal và Tsay, 2004)
Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy Các thông số hóa học và vật lý như thành
phần và pH môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi cây, sự thông khí, sự lắc hoặc khuấy, và ánh sáng ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp đã được nghiên cứu nhiều (Goleniowski và Trippi, 1999; Lee và Shuler, 2000; Wang va cs, 1999) Một vài sản phẩm tích lũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở điều kiện tối ưu Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có thể gần như là yêu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy
Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao Các tế bào thực vật trong nuôi cấy là một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong nuôi cấy đã được Berlin và Sasse công bố năm 1985, và sau đó phương thức này đã được ứng dụng rộng rãi Chắng hạn, một dòng tế bào của cay bat tién (Euphorbia milli) sau 24 lần chọn lọc da tích lũy gấp khoảng 7 lần lượng anthocyanin được sản xuất
từ nuôi cây tế bào bố mẹ (Yamamoto và cs, 1982) Yamada va Sato (1981) da
Trang 31tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng lượng sản phẩm cuối cùng Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành rẻ Tăng cường kích thích hoặc bổ sung tiền chất hoặc các hợp chất tương tự mang lại hiệu quả trong nhiều trường hợp (Silvestrini và cs, 2002; Moreno và cs, 1993) Chẳng hạn, bổ sung phenylalanine khi nuôi cây tế bào huyền phù cây Sa/via oƒljcinalis đã kích thích tạo ra rosmarinic acid, cung cấp ferulic acid trong nuôi cấy tế bào cây Vanilla planifolia đã tăng tích lũy valnillin, hoặc bổ sung leucine din đến việc tăng các monoterpen dé bay hơi trong nuôi cấy Perilla frutiscens (Mulbagal and Tsay 2004)
© Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation) Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ chống lại các yếu tố gây bệnh Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp Sử dụng các elicitor của bộ máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức đề thu được các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất Sử dụng các elicitor sinh học và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thích hình thành các hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy tế bào, có thê giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao (DiCosmo và Tallevi, 1985)
2.3.3 Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học
Những năm gần đây, thuốc truyền thống trở thành một đề tài quan trọng mang tính toàn cầu Mặc dù ở các nước phát triển người ta thường sử dụng tân dược trong điều trị nhưng các loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc vẫn được dùng phổ biến do yếu
tố lịch sử và văn hóa Theo các đánh giá về mặt khoa học, nhiều loài thảo mộc có thể
ứng dụng trong y học Vấn đề đặt ra là vùng sinh trưởng của cây thuốc đang biến mắt
nhanh chóng do sự không ôn định của điều kiện môi trường và các yêu tố khác Như
Trang 32Ngay từ năm 1971, Wani và các cộng sự đã tìm ra một diterpene amide mới có khả năng chống ung thư gọi là “taxol” chiết từ cay thong do Pacific (Taxus brevifolia) Đến năm 1983, taxol được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư buồng trứng Sau đó, FDA đã cho phép sử dụng taxol trong điều trị các trường hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú Ngoài ra, taxol cũng có tác dụng đối với các bệnh nhân có khối u ác tinh, ung thư phổi và các dạng u bướu khác (Wickremesinhe và Arteca, 1993 và 1994), và nó được xem như là chất đầu tiên của một nhóm mới trong hóa trị liệu ung thư (Cragg và cs, 1993) Tuy nhiên, sử dụng taxol trong điều trị bị hạn chế do chỉ
tách chiết được một lượng rất ít từ vỏ của cây thông đỏ tự nhiên Lớp vỏ mỏng này
chứa khoảng 0,001% taxol tính theo khối lượng khô Ở cây 100 năm tuổi trung bình chỉ thu được 3 kg vỏ (khoảng 300 mg taxol), lượng này ứng với một liều trong toàn đợt điều trị ung thư Sở dĩ nguồn taxol khan hiếm như vậy là do các cây tự nhiên sinh trưởng rất chậm (Cragg và cs 1993) Do đó, cần có những nguồn khác đề thay thế mới đáp ứng được nhu cầu sử dụng ngày càng tăng trong y học
Nuôi cấy tế bào các loài 7axws được xem như là một phương pháp ưu thế để cung cấp ôn định nguồn taxol và dẫn xuất taxane của nó (Slichenmyer và Von Hoff, 1991) Hiện nay, việc sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào các loài Taxus da tro thanh một trong những ứng dụng rộng rãi của nuôi cấy tế bào thực vật và đang tạo ra các giá trị thương mại to lớn Fett-Neto và cs (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và một số yếu tô khác lên sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào 7: cuspidata Srinivasan va cs (1995) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào của T baccata Lee và cs (1995) đã nghiên cứu sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây 7 mairei, một loài được tìm thấy tại Đài Loan ở độ cao 2000 m so với mực nước biển Các dòng tế bào thu được từ mô sẹo có nguồn gốc thân và lá, và một trong những đòng này sau khi được bổ sung các tiền chất vào môi trường nuôi cây, thì sau 6 tuần cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ có khoảng 200 mg taxol
Trang 33lâu năm ở Đài Loan, được sử dụng để chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến Imperatorin được xem là thành phần hoạt động chính trong điều trị các bệnh về da Nếu sản xuất cây Angelica dahurica var ƒormosana bằng phương pháp nhân giống truyền thống sẽ mắt một thời gian đài mới có thể đáp ứng được nhu cầu Vì vậy, phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù sản xuất imperatorin đã được chọn lựa sử dụng Nghiên cứu đã cho thấy trong chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù, sản phẩm imperatorin đạt giá trị cực đại trong khoảng giữa 10 và 14 ngày Benzylamino purine ở nồng độ từ 0,5-1,0 mg/L da kích thích tổng hợp imperatorin, một tỷ lệ thích hop ammonium nitrate và nitrate (2:1) cũng như tăng nồng độ phosphate từ 1-2 mM sẽ làm tăng lượng impertatorin Glucose là nguồn carbon tốt hơn saccharose và fructose về hiệu quả san xuat imperatorin Vai tro cua elicitor cing da được khảo sát, b sung thém vanadyl sulphate trong méi trường sẽ tăng tich lay imperatorin, quyết định nồng độ và thời gian sinh trưởng của tế bào Bồ sung vanadyl sulphate ở nồng độ 30 mg/L vào môi trường đã cho hiệu quả tốt nhất sau 10 ngày nuôi cấy Hoặc bổ sung 20 g/L chất hấp phụ ambcerlite XAD-7 vào môi trường, quá trình tổng hợp imperatorin cũng tăng mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 10 Hàm lượng imperatorin sản xuất bởi phương thức nay dat 460 pg khdi lượng tươi cao hơn đối chứng 140 lần
Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong hệ rễ của cây Coptis japonica và vỏ của cây Phellondendron amurense Berberine chloride duge stt dung dé chita bệnh rồi loan tiêu hóa Để thu được nguyên liệu thô tir ré cay Coptis phai mat 5-6 năm Yamada và Sato (1980) đã chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất berberine cao của loài (1981) €: japonica Sau đó, công ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản) đã cải thiện được năng suất bang cach thém 10% M gibberellic acid vào môi trường, hiệu xuất berberine da tăng lên rất nhiều tới 1.66 g/I (Misawa 1994)
Trang 34cứu nuôi cấy P ginseng trên quy mô công nghiệp Đến nay, đây là một trong các đối tượng được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất
Merkli va cs (1997) đã nuôi cây rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum bằng cách gây nhiễm chủng A4 của 4grobacterium rhizogenes Các rễ tơ này đã sản xuất diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp (semi-synthesis) của các hormone steroid Hàm lượng diosgenin thu được cao nhất là 0.040 % khối lượng khô gần gấp 2 lần so với các rễ không biến nạp chủng A4 8 tháng tuổi (0,024 %) Các tác giả này đã nghiên cứu ảnh hưởng của cholesterol, pH môi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin Kết quá cho thấy bổ sung 40 mg/L chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ tăng hàm lượng diosgenin lên gấp 3 lần so với đối chứng
Ych và cs (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây 2ioscorea đoryophora Phương pháp này được sử dụng như một cách thay thế quá trình tổng hợp steroid Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lập bằng cách đưa mô sẹo vào môi trường có 0,2 mg/L 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4- D) Nồng độ saccharose tối thích cho tổng hợp diosgenin là 3% Lượng diosgenin thu được trong trường hợp này đạt tới 3,2% khối lượng khô Sản xuất diosgenin từ cây D doryophora bằng nuôi cây tế bào huyền phù hiện nay đã được ứng dụng trên quy mô công nghiệp
Trang 35Miyasaka và cs (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuôi cấy mô sẹo cay Salvia miltiorrhiza Salvia la m6t chi quan trong của họ Lamiaceae và m6t vai loai cla Salvia moc hoang dai trén khắp thế giới dùng làm thuốc dân gian Hiệu quả của BA đối với việc hình thành cryptotanshinone trong nuôi cấy mô sẹo S.miltiorrhiza da duoc khao sat M6 seo sơ cap được tạo ra từ nuôi cay mảnh lá ở trong tối trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D Mô sẹo sau đó phát triển nhanh hơn trên môi trường có 1,0 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA Kết quả phân tích HPLC cho thấy mô sẹo chứa một lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối lượng khô) Loại bỏ 2,4-D khỏi môi trường nuôi cây cho kết quả là lượng cryptotanshinone trong mô sẹo tăng lên Nồng độ cao nhất của cryptotanshione thu được trong mô sẹo nuôi cấy trên môi trường có 0,2 mg/L BA trong 6 ngày là 4,59 mg/g khối lượng khô (Wu và cs, 2003)
Trang 392.4 Giới thiệu chung về Kim ngân hoa > Vị trí phân loại % Gidi: Plantae s* Ngành: Tracheobionta Lớp: Magnoliopsida s Bộ: Dipsacales Họ: Caprifoliacea “ Chi: Lonicera L
“ Loai: Lonicera japonica Thunb
Hinh 2.14: hoa Kim ngan 2.4.1 M6 ta cay
Kim ngân là một loại dây leo, thân có thể vươn đài tới 10m hay hơn Cành lúc còn non màu lục nhạt, có phủ lông mịn, khi cành già chuyên màu nâu đỏ nhạt, nhẫn
Lá mọc đối, đôi khi mọc vòng ba lá một, hình trứng dài, đầu hơi tù, phía cuống tròn,
cuống ngắn 2 — 3 mm, cả hai mặt đều phủ lông mịn Vào các thang 5 — 8, hoa moc từng đôi ở kẽ lá, mỗi kẽ lá có I cuống mang 2 hoa, hai bên lá mọc đối mang 4 hoa, lá
bắc giống lá nhưng nhỏ hơn Hoa hình ống xẻ 2 môi, môi lớn lại xẻ thành 3 hay 4
thùy nhỏ, phiến của tràng dài gần bằng ống tràng, lúc đầu màu trắng, sau khi nở một thời gian chuyển màu vàng, cùng một lúc trên cây có hoa mới nở màu vàng như bạc, lại có hoa nở đã lâu màu vàng như vàng cho nên có tên là Kim ngân (kim là vàng, ngân là bạc); cây Kim ngân xanh tốt vào mùa đông cho nên còn có tên là nhẫn đông nghĩa là chịu đựng mùa đông, 4 nhị thòi dài cao hơn tràng; vòi nhụy lại thòi dài cao hơn nhị, mùi thơm dễ chịu Quả hình trứng dài chừng 5mm
2.4.2 Phân bố, thu hái và chế biến
Kim ngân là một cây loại mọc hoang đại tại nhiều tỉnh vùng núi nước ta,
nhiều nhất ở Cao Bằng, Lạng Sơn, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Bắc
Giang, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Phú Thọ Một số nơi người ta bắt đầu
trồng lấy hoa và cành lá làm thuốc Do cây Kim ngân có lá xanh tốt quanh năm, đến tháng 4 -5 lại cho hoa đẹp và thơm cho nên có thể trồng làm cảnh và lấy bóng mát
Trang 40Kim ngân có thể trồng ở miền núi cũng như ở đồng bằng Đất đai và khí hậu Hà Nội cũng rất thích hợp Ta có thể trồng bằng dâm cành: cắt những cành bánh tẻ dài chừng 20-60 em, khoanh thành khoanh, chôn xuống đưới đất, để chừa đoạn sau cùng; vào thời kỳ đầu cần tưới đều Có thẻ trồng quanh năm nhưng tốt nhất vào tháng 9-10 hoặc tháng 2 -3 Sau một năm có thể bắt đầu thu hoạch; thu hoạch lâu năm, càng về những năm sau càng nhiều hoa Nếu hái hoa cần hái vào lúc hoa sắp nở hay khi hoa mới nở, màu còn trắng chưa chuyên vàng Có thể hái hoa riêng, cành lá riêng nhưng có thể hái hoa kèm theo một ít cành lá, về nhà mới phân, chia cành lá riêng, hoa riêng Hoa hay cành lá hái về phơi hay sây khô là dùng được Không phải
chế biến gì khác Việc bảo quản hoa lá cành lá Kim ngân tương đối đễ vì ít bị mốc,
mọt
2.4.3 Thành phần hóa học
Hoa va lá chứa flavonoid, chat chinh là luteolin-7-rutinosid (lonicerin=scolymosid)
Mot sé chat carotenoid: š-caroten, B-cryptoxanthin, auroxanthin Acid chlorogenic va cac déng phan của nó Lá có loganin và secologanin ú) (0) R-O Oo % ® OH HO O Scolymosid(R=rutinose) OH Hinh 2.15: (1) scolymosid, (2) B-cryptoxanthin co (4) COO, (OH; ° S ony ~ Ho = O 0 @) ¬ |
° “OH Gk O-f-D-glc O-f-D-glc