Tóm tắt Luận án tiến sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu công nghệ thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ hai loài nấm thượng hoàng (Phellinus igniarius và Phellinus nilgheriensis) ở Việt Nam, ứng dụng trong thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN TÂN THÀNH NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ THU NHẬN MỘT SỐ HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ HAI LOÀI NẤM THƯỢNG HOÀNG (Phellinus igniarius Phellinus nilgheriensis) Ở VIỆT NAM, ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM Ngành: Cơng nghệ thực phẩm Mã số: 9540101 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM HÀ NỘI: 2018 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học PGS.TS Tơn Thất Minh GS.TS Trần Đình Thắng Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi……giờ, ngày… Tháng… năm ……… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tạ Quang Bửu – Trường ĐHBK Hà Nội Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Nấm Thượng hồng (hay cịn gọi nấm Hồng sơn) tên lồi chi Phellinus, thuộc họ Hymenochaetaceae (ở Trung Quốc gọi Songgen, Hàn Quốc gọi Sang Hwang, Nhật Bản gọi Meshima) Đây loại nấm quý tự nhiên người Nhật Bản, Hàn Quốc sử dụng rộng rãi việc điều trị, tăng cường khả hệ thống miễn dịch, giúp giảm lượng cholesterol đường máu Trong nấm thượng hồng có chứa nhiều thành phần hóa học acid amin, vitamin, khống, carbonhydrat số hợp chất có hoạt tính sinh học polysaccharid, protein-polysaccharide, steroid, terpenoid, flavone, styrylpyrone, furane polychlorinat [81] Các loại nấm hiệu nhiều bệnh, bao gồm việc tăng lưu thông máu, ngăn ngừa điều trị bệnh tim, tăng khả giải độc bảo vệ gan, chống lại bệnh dị ứng tiểu đường, giảm căng thẳng Nấm có chức chống ung thư mạnh ngăn ngừa phát triển khối u Năm 1976, nhóm nghiên cứu TS Chihara Trung tâm nghiên cứu ung thư Nhật Bản kiểm tra so sánh tỷ lệ kháng ung thư chuột dịch chiết nước nóng 27 loại nấm thuốc nấm Phellinus linteus xếp hạng số với tỷ lệ ức chế tế bào u báng (Sarcoma 180) chuột 96,7% Phellinus igniarius xếp thứ với tỷ lệ 87,4%.[28] Ngày nay, ngày nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài nấm nhằm phát hoạt chất có dược tính mạnh bệnh nan y viêm gan, kháng viêm ung thư, HIV, tăng hệ miễn dịch, chống oxy hóa… Việc đưa vào sử dụng rộng rãi chế phẩm tách chiết từ nấm giúp người khỏe mạnh, phòng chống nhiều bệnh tiềm ẩn, nguy hiểm [4], [9], [10] Hiện nay, tổng sản lượng loài phellinus giới khoảng 30 tấn/năm, chủ yếu từ thu hái hoang dại Trên giới có nước trồng loài nấm Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan Ở Việt Nam, Trung tâm linh chi nấm dược liệu TPHCM bước đầu nghiên cứu ni trồng thành cơng lồi nấm thượng hoàng P linteus bịch mạt cưa gỗ cao su, suất khoảng 140 kg/năm, sản phẩm nấm sau thu hoạch bảo quản cách sấy khô để đưa bán thị trường nước xuất thơ nước ngồi Việc khai thác hợp chất có hoạt tính sinh học, thành phần dinh dưỡng nấm thượng hồng cơng nghệ chế biến đại, tạo sản phẩm giàu hoạt chất để ứng dụng sản xuất loại thực phẩm chức có khả hỗ trợ, nâng cao sức khỏa hướng cần thiết Xuất phát từ thực tế nghiên cứu cấp thiết trên, lựa chọn đề tài “Nghiên cứu công nghệ thu nhận số hợp chất có hoạt tính sinh học từ hai loài nấm thượng hoàng (Phellinus igniarius Phellinus nilgheriensis) Việt Nam, ứng dụng thực phẩm” Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng sở liệu thành phần dinh dưỡng thành phần hóa học hai lồi nấm thượng hồng (Phellinus igniarius Phellinus nilgheriensis) khu vực Bắc trung bộ, Việt Nam - Đề xuất quy trình cơng nghệ tối ưu chiết xuất sấy phun dịch chiết từ hai loài nấm thượng hoàng; xây dựng số quy trình sản xuất số sản phẩm thực phẩm có bổ sung nấm thượng hồng Nội dung nghiên cứu - Thu mẫu xác định tên khoa học loài nấm thượng hoàng Việt Nam (P igniarius P nilgheriensis) - Nghiên cứu thành phần hóa học (các vitamin, acid amin, kim loại, hàm lượng tổng phenolic, flavonoid) từ nấm thượng hoàng thu hái từ tự nhiên - Phân lập, xác định cấu trúc thử hoạt tính sinh học hợp chất thu từ nấm thượng hoàng (P igniarius) Việt Nam - Xây dựng quy trình cơng nghệ chiết xuất sấy phun dịch nấm thượng hoàng (P igniarius P nilgheriensis) - Nghiên cứu ứng dụng sản xuất số sản phẩm thực phẩm bổ sung nấm thượng hoàng Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án 4.1 Ý nghĩa khoa học - Kết nghiên cứu thành phần dinh dưỡng thành phần hóa học hai loài nấm thượng hoàng (P igniarius P nilgheriensis) đóng góp khoa học có độ tin cậy cao, góp phần làm phong phú thêm sở liệu chất lượng nguyên liệu, thành phần hóa học lồi nấm lớn Việt Nam - Đã phân lập xác định cấu trúc hợp chất nấm thượng hoàng (P igniarius) tìm chất thuộc nhóm chất triterpenoid Đã thử hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư HepG2, MCF7, Lu hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết hợp chất sạch, kết cho thấy hợp chất có khả kháng dùng tế bào ung thư - Đã đề xuất công nghệ (chiết xuất sấy phun) thu nhận số hợp chất từ hai loài nấm thượng hoàng (P igniarius P nilgheriensis) Việt Nam 4.2 Ý nghĩa thực tiễn: - Các kết nghiên cứu đề tài công nghệ thu nhận số hợp chất sinh học từ nấm thượng hồng tạo nên sản phẩm có giá trị kinh tế cao, có tác dụng chống oxy hóa, có khả ngăn chặn chữa bệnh Đây việc làm cần thiết, phù hợp với xu thời đại, đóng góp cho phát triển kinh tế - xã hội bảo vệ sức khỏe cộng đồng - Kết nghiên cứu đề tài tài liệu tham khảo khoa học đáng tin cậy có giá trị; tài liệu phục vụ cho giảng dạy, nghiên cứu khoa học cho sản xuất sau Những điểm luận án - Đây nghiên cứu đầy đủ thành phần dinh dưỡng (acid amin; vitamin E, D2, B3; kim loại…) từ hai loài nấm thượng hoàng (P igniarius P nilgheriensis) thu hái Việt Nam - Luận án phân lập xác định cấu trúc hợp chất nấm thượng hoàng (Phellinus igniarius) là: igniarine (PIE-1), meshimakobnol B (PIE-3), inoscavin A (PIE-6), daidzin (PIE-7), ergosterol (PIE-4), pterocarpin (PIE-8), ergosterol peroxit (PIE-5), meshimakobnol A (PIE-2) 5-hydroxy-7methoxy-flavon (PIE-9) Trong hợp chất igniarine (PIE-1) hợp chất Đã thử hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư HepG2, MCF7, Lu hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết hợp chất - Tối ưu hóa quy trình cơng nghệ chiết xuất sấy phun dịch nấm thượng hoàng (P igniarius P nilgheriensis) Đề xuất quy trình chế biến số sản phẩm thực phẩm bổ sung nấm thượng hoàng như: bánh quy, trà nấm cà phê hòa tan có tính chất cảm quan hấp dẫn người dùng Cấu trúc luận án Luận án bao gồm 127 trang với 51 bảng số liệu, 50 hình 06 sơ đồ với 155 tài liệu tham khảo Kết cấu luận án gồm: mở đầu (03 trang), tổng quan (30 trang), nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu (19 trang), kết thảo luận (60 trang), kết luận đề xuất nghiên cứu tiếp tục (02 trang), danh mục cơng trình cơng bố (01 trang), tài liệu tham khảo (12 trang) CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Nấm Thượng hoàng (Phellinus sp.) Giới thiệu đặc điểm thực vật, phân loại đặc điểm hình thái phân bố chi Phellinus 1.2 Thành phần hóa học nấm thượng hồng Trình bày tổng quan thành phần dinh dưỡng, thành phần hóa học hoạt tính sinh học nấm thượng hồng (Phellinus sp.) 1.3 Cơng nghệ tách chiết hoạt chất nấm dược liệu 1.4 Công nghệ sấy nguyên liệu dịch chiết từ nấm dược liệu 1.5 Ứng dụng nấm dược liệu sản xuất thực phẩm chức CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu luận án loài nấm thượng hoàng chi Phellinus thu hái khu bảo tồn quốc gia Pù Huống vườn Quốc gia Pù Mát Nghệ An Mẫu định danh tên khoa học Phellinus igniarius Phellinus nilgheriensis PGS TS Ngô Anh, khoa Sinh, Trường Đại học Khoa học Huế, Đại học Huế 2.1.2 Hóa chất Các hóa chất sử dụng nghiên cứu đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng để chạy thiết bị phân tích đại HPLC, UPLC, LC/MS… 2.1.3 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu Sắc ký lớp mỏng (TLC), Sắc ký cột (CC), Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), Hệ thống sắc ký lỏng ghép nối khối phổ, Thiết bị phản ứng Reaction, Máy sấy phun Spray Dryer B290… 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân tích thành phần dinh dưỡng thành phần hóa học Phân tích hàm lượng cellulose theo nguyên tắc hòa tan acid kiềm; sử dụng UPLC, HPLC với đầu dò huỳnh quang để xác định hàm lượng acid amin, vitamin; hàm lượng nguyên tố kim loại đo thiết bị phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), hàm lượng tổng phenolic, tổng flavonoid xác định phương pháp quang phổ (UV-Vis) 2.2.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập hợp chất Phân lập, xác định cấu trúc hợp chất: sử dụng phương pháp sắc ký như: sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột thường (CC); sắc ký cột nhanh (FC); sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC); Phân lập hợp chất: Mẫu nấm thượng hoàng (P igniarius) (4,5kg) sấy khô nhiệt độ từ 40-50C 48 giờ, nghiền nhỏ ngâm chiết với metanol (10L x 3) nhiệt độ phòng, thu dịch chiết cất thu hồi dung môi áp suất thấp cao methanol (154g) Phân bố dịch chiết vào nước (1L) chiết ethyl acetate (1Lx5) butanol (1Lx5), sau cất thu hồi dung mơi thu cao etyl axetat (42g), cao butanol (67g) dịch nước Cao ethyl acetate phân tách cột silicagel, với hệ dung môi rửa giải chloroform: metanol (100:0, 40:1: 30:1; 20:1; 10:1: 4:1; 2:1), thu phân đoạn (PI.E1 đến PI.E5) Phân đoạn (PI.E3) phân tách lại sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải chloroform: methanol (30:1; 20:1; 10:1), thu phân đoạn (PI.E3.1 đến PI.E3.3) Phân đoạn PI.E3.1 tiếp tục phân tách sắc ký cột với hệ dung môi chloroform: methanol (30:1) thu chất hợp chất PIE1 (igniarine) (38mg) hợp chất PIE-3 (meshimakobnol B) (23mg) Phân đoạn PI.E3.2 phân tách sắc ký cột với hệ dung môi chloroform: methanol (30:1) thu chất hợp chất PIE-6 (Inoscavin A) (18mg) hợp chất PIE-7 (daidzin) (21,5mg) Phân đoạn PI.E1 sắc ký cột với silica gel hệ dung môi rửa giải hexane: axeton (15:1 9:1) thu chất PIE-4 (ergosterol) (123mg) Phân đoạn PI.E4 tiến hành sắc ký cột với hexane: axeton (15:1, 9:1) thu hợp chất chất PIE-8 (pterocarpin) (18 mg) PIE-5 (ergosterol peroxit) (31mg) Phân đoạn PI.E5 tiến hành sắc ký cột (200 g, 60 × cm) với chloroform/methanol (10:1) kết tinh phân đoạn thu hợp chất PIE-2 (meshimakobnol A) (30mg) PIE-9 (5-hydroxy-7methoxyflavon) (27mg) (Sơ đồ 2.2) 2.2.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc hợp chất Cấu trúc hợp chất khảo sát nhờ kết hợp phương pháp phổ: phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối lượng (EIMS), (ESI-MS), (HR-ESI-MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC; cấu trúc lập thể tương đối hợp chất xác định phương pháp phổ NMR - Hợp chất PIE-1 (igniarine): chất bột trắng vô định hình, nhiệt độ nóng chảy 205-206ᵒC; HR-ESI-MS m/z: 453,0446 [M+Na]+; UV (MeOH) λmax: 257nm, 414nm; IR(KBr) νmax(cm-1):1690, 3400; 1H 13 C-NMR: bảng 3.13 - Hợp chất PIE-2 (meshimakobnol A): chất bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 181-182ᵒC; HR-ESI-MS m/z: 403,3346 [M+H]+; UV (MeOH) λmax: 290nm, 258nm; IR(KBr) νmax(cm-1):1706, 3542; 1H 13 C-NMR: bảng 3.14 - Hợp chất PIE-3 (meshimakobnol B): chất bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 175-176ᵒC; HR-ESI-MS m/z: 387,0485 [M+H]+; UV (MeOH) λmax: 409nm, 250nm; IR(KBr) νmax(cm-1):1685, 3369; 1H 13 C-NMR: bảng 3.14 - Hợp chất PIE-4 (ergosterol): chất bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 165-167ᵒC; EI-MS m/z: 369 [M]+; UV (MeOH) λmax: 211nm, 285nm; IR(KBr) νmax(cm-1): 3433, 2959, 1726, 1090; 1H 13C-NMR: bảng 3.15 - Hợp chất PIE-5 (ergosterol peroxit): dạng thể hình kim khơng màu, nhiệt độ nóng chảy 176-178ᵒC; EI-MS m/z: 428 [M]+; 1H 13CNMR (CDCl3) (δ ppm): bảng 3.16 - Hợp chất PIE-6 (inoscavin A): chất bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 268-269ᵒC; HR-ESI-MS m/z: 463,1045 [M+H]+; 1H-NMR (500 MHz, DMSO –d6) 13C-NMR (125 MHz, DMSO –d6) (δ ppm): bảng 3.17 - Hợp chất PIE-7 (daidzin): chất bột màu vàng nâu, nhiệt độ nóng chảy 246-247ᵒC; EI-MS m/z: 416 [M]+; 1H-NMR (500 MHz, DMSO –d6) 13C-NMR (125 MHz, DMSO –d6) (δ ppm): bảng 3.18 - Hợp chất PIE-8 (pterocarpin): Tinh thể màu trắng, có điểm nóng chảy 154,5-156ᵒC; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3-d6) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3-d6)  (ppm): bảng 3.19 - Hợp chất PIE-9 (5-hydroxy-7-methoxyflavone): Chất rắn màu vàng, có điểm nóng chảy: 195o-196oC; UV (MeOH) max: 216, 278 322; ESI-MS m/z: 331 [M+H]+; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3-d6) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3-d6)  (ppm): bảng 3.20 2.2.4 Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học: xác định hoạt tính chống oxy hóa phương pháp DPPH (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl); hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp môi trường thạch (MTT) 2.2.5 Quy hoạch thực nghiệm - Sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm, thí nghiệm bố trí theo quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp xử lý phần mềm tối ưu hóa Design - Expert phiên 7.1 để tối ưu hóa q trình chiết sấy phun dịch nấm thượng hồng - Trong thí nghiệm phân tích thị hiếu, đánh giá cảm quan chất lượng sản phẩm bổ sung bột nấm thượng hoàng sử dụng phần mềm thống kê SPSS Sơ đồ 2.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ nấm thượng hoàng (P igniarius) 11 3.1.5 Hàm lượng tổng phenolic flavonoid Hàm lượng tổng phenolic nấm thượng hoàng P igniarius P nilgheriensis 65,36 41,24 mgGAE/g; hàm lượng tổng flavonoid 6,35mgCE/g 3,92mgCE/g 3.1.6 Thành phần hóa học nấm thượng hồng (P igniarius) Xác định thành phần hóa học lồi P igniarius thiết bị LC-MS, nhận dạng số hợp chất mẫu nấm sau: Hình 3.1 Sắc ký đồ LC-MS dịch chiết ethanol nấm P igniarius Việt Nam Bảng 3.13 Nhận dạng hợp chất polyphenol từ dịch chiết nấm P igniarius Hợp Thời gian Tên dự kiến Khối lượng [M+H]+ chất lưu phân tử m/z 13.5 Interfungin A 464.43 465.3328 15.7 Inonoblin C 462.42 463.0872 17.6 Phelligridin C 364.309 365.3093 18.4 Inoscavin A 462.410 463.4108 20.9 Phelligridin D 380.308 381.3088 21.8 Inoscavin E 378.34 379.0163 23.0 Inoscavin C 420.373 421.2224 25.1 interfungin B 422.389 423.3893 3.2 Phân lập, xác định cấu trúc chất hoạt tính số thành phần hóa học dịch chiết nấm thượng hoàng (P igniarius) 3.2.1 Chiết phân đoạn Các hợp chất phân lập từ nấm thượng hoàng (P Igniarius) thu hái Việt Nam thể bảng sau: Hợp Ký Tên hợp chất Công thức Khối lượng chất hiệu phân tử (mg) PIE-1 Igniarine C30H44O3 38 mg 12 PIE-2 PIE-3 PIE-4 PIE-5 PIE-6 PIE-7 PIE-8 PIE-9 Meshimakobnol A C20H12O8 30 mg Meshimakobnol B C20H12O7 23 mg Ergosterol C28H44O 123mg Ergosterol peroxit C28H44O3 31mg Inoscavin A C25H18O9 18 mg Daidzin C21H20O9 21.5 mg Pterocarpin C17H14O5 18 mg 5-hydroxy-7C16H13O4 27 mg methoxyflavone 3.2.2 Xác định cấu trúc hợp chất Hợp chất lần công bố (PIE-1) Các tín hiệu proton carbon khác hợp chất PIE-1 quy gán dựa phổ 1D- 2D-NMR xác định cấu trúc Đây hợp chất lần công bố, gọi tên igniarine Igniarine Bảng 3.13 Dữ liệu phổ 1H- 13C-NMR hợp chất PIE-1 (400 MHz, DMSO-d6) 13 Cacbon H-NMR C-NMR δH (ppm, multi., J Hz) δC (ppm) 1,25 (1H, m) 35,5 1,67 (1H, m) 1,67 (2H, m) 27,9 3,24 (1H, dd, 11,6, 4,8) 78,9 38,9 1,06 (1H, dd, 12,6, 2,0) 50,3 1,55 (1H, m) 18,2 1,72 (1H, m) 1,85 (2H, m) 27,3 134,4 134,3 13 10 11 12 37,0 2,05 (2H, m) 20,9 1,65 (1H, m) 31,0 1,95 (1H, m) 13 49,4 14 44,8 15 1,17 (1H, m) 30,9 1,60 (1H, m) 16 2,05 (2H, m) 26,5 17 2,22 (1H, br d, 8,4) 47,0 18 0,79 (3H, s) 16,2 19 1,00 (3H, s) 19,2 20 3,24 (1H, m) 44,5 21 1,18 (3H, d, 6,8) 17,3 22 193,8 23 152,4 24 7,06 (1H, s) 119,7 25 122,6 26 7,37 (3H, s) 143,8 27 2,08 (3H, s) 9,8 28 0,98 (3H, s) 27,8 29 0,81 (3H, s) 15,4 30 0,92 (3H, s) 24,3 3.3 Kết thử hoạt tính cao chiết hợp chất 3.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập từ P iganirius Các hợp chất phân lập từ thể nấm P.iganirius tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào dịng ung thư (MCF7, HepG2, Lu) Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hoá học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Bảng 3.21 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào dịng ung thư hợp chất phân lập từ loài P iganirius IC50 (µM)a Hợp chất MCF-7 HepG2 Lu PIE-1 >100 18,4 ± 2,6 29,1 ± 3,6 14 PIE-2 >100 19,2 ± 2,0 35,2 ± 3,4 PIE-3 >100 16,7 ± 1,6 21,7 ± 2,8 PIE-4 43,6 ± 5,1 21,5 ± 5,1 >50 PIE-5 >100 46,9 ± 3,7 >50 b Adriamycin 2,2 ± 0,1 5,4 ± 0,5 2,8 ± 0,4 a Nồng độ ức chế cần thiết (IC50) Kết thị ý nghĩa ± SD (n = 3) b Đối chứng dương 3.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa cao chiết nấm thượng hoàng (P igniarius P nilgheriensis) Các mẫu thử PI cồn 45%, PI cồn, PN cồn 45% PN cồn có biểu hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH nồng độ thử nghiệm (200µg/ml) Mẫu thử nghiệm với nồng độ mẫu có khả trung hòa 50% gốc tự (SC50) tương ứng sau: PI cồn 45% (112,55µg/ml), PI cồn (154,15µg/ml), PN cồn 45% (123,16µg/ml) PN cồn (114,21µg/ml) Hai mẫu thử PI nước PN nước khơng biểu hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH nồng độ thử nghiệm (200µg/ml) 3.3.3 Hoạt tính gây độc tế bào cao chiết từ nấm thượng hoàng Các cao chiết phân lập từ thể nấm P iganirius (PI) P nilgheriensis (PN) tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hoá học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Kết thử nghiệm cho thấy hoạt tính cao chiết từ lồi P iganirius từ cồn 45% có khả kháng dòng ung thư ba dòng u (HepG2, MCF-7 Lu) 19,498, 11,180 19,520 Trong đó, cao chiết cho thấy hoạt tính kháng dịng tế bào HepG2 có số IC50 đáng ý cao chiết PI cồn 45% có giá trị IC50 11,180 so với loại cao chiết khác 3.4 Xây dựng quy trình trích ly dịch chiết từ nấm thượng hoàng 3.4.2 Khảo sát phương pháp chiết Qua thí nghiệm nghiên cứu ta nhận thấy yếu tố đảo trộn trình chiết xuất ảnh hưởng lớn đến hàm lượng chất chiết thu hồi, vậy, chúng tơi lựa chọn phương pháp chiết thường có đảo trộn hồi lưu dung môi để thực nghiên cứu 3.4.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất dịch nấm thượng hồng (P igniarius) 15 3.4.4 Tối ưu hóa q trình tách chiết số hợp chất nấm thượng hoàng (P igniarius) 3.4.4.1 Thiết lập mơ hình Tiến hành nghiên cứu hàm lượng tổng phenolic, tổng flavonoid hàm lượng chất chiết thu hồi với yếu tố ảnh hưởng là: nhiệt độ chiết (ᵒC), thời gian chiết (h) nồng độ dung môi (%) Sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box-Behnken cho yếu tố, yếu tố tiến hành mức (-1, 0, +1) Bảng 3.29 Mức ảnh hưởng yếu tố Biến số Ký hiệu Đơn vị Mức -1 Nhiệt độ chiết A ᵒC 30 50 Thời gian chiết B Giờ Nồng độ ethanol C % 30 60 70 90 Bảng 3.30 Kết thí nghiệm tối ưu quy trình tách chiết hợp chất từ loài P igniarius TN Nhiệt độ Thời Nồng độ Hàm lượng Hàm lượng Hàm o A ( C) gian Ethanol tổng tổng lượng chất B (h) C (%) phenolic flavonoid khô thu Y1 Y2 nhận mgGAE/g (mgCE/g) Y3 (%) 0 79,85 7,25 5,26 66,27 5,52 3,65 + 69,73 5,84 4,23 + 75,72 6,82 6,25 0 80,42 7,29 5,18 + 70,25 6,21 4,54 + + 77,32 7,07 5,77 + 71,26 6,08 4,92 67,38 5,62 4,73 10 + + 76,75 6,48 6,64 11 + 71,82 6,12 4,88 12 + 72,88 6,24 6,35 16 13 14 15 68,84 6,07 5,09 + + 73,85 6,35 5,93 0 79,12 7,21 5,31 Hàm lượng tổng phenolic (Y1), hàm lượng tổng flavonoid (Y2) hiệu suất chất chiết thu hồi (Y3) được biểu diễn phương trình hồi quy bậc hai sau: Y1 = 78,86 + 2,59A + 5,67B + 0,78C – 0,019AB – 0,35AC + 0,059BC – 5,17A2 – 4,84B2 – 3,66C2 Y2 = 7,15 + 0,28A + 0,60B + 0,083C – 0,062AB – 0,028AC + 0,034BC – 0,86A2 – 0,52B2 – 0,37C2 Y3 = 5,08 + 0,75A + 0,89B – 0,25C + 0,15AB + 0,02AC + 0,022BC – 0,16A2 – 0,098B2 + 0,22C2 Bảng 3.31 Bảng phân tích hồi quy hàm mục tiêu: Hàm lượng tổng phenolic (Y1), hàm lượng tổng flavonoid (Y2) hiệu suất chất chiết thu nhận(Y3) Hàm lượng tổng Hàm lượng tổng Hiệu suất chất chiết phenolic (Y1) flavonoid (Y2) thu nhận (Y3) Nguồn gốc Giá trị F Giá trị p Giá trị F Giá trị p Giá trị F Giá trị p Mô hình 51,47 0,0002 40,73 0,0004 66,95 0,0001 A 75,66 0,0003 42,32 0,0013 257,15