Nghiên cứu nuôi trồng và khảo sát một số hợp chất có hoạt tính sinh học của nấm ophiocordyceps sobolifera

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN VĂN KHOA NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM Ophiocordyceps sobolifera LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỮU CƠ HUẾ - NĂM 2021 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN VĂN KHOA NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM Ophiocordyceps sobolifera Ngành: Hóa Hữu Cơ Mã số: 944.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỮU CƠ Người hướng dẫn khoa học: PGS TS TRẦN THỊ VĂN THI GS TSKH TRỊNH TAM KIỆT HUẾ - NĂM 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu kết nghiên cứu nêu luận án trung thực, đồng tác giả cho phép sử dụng chưa công bố công trình khác Việc tham khảo nguồn tài liệu trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định Tác giả luận án Trần Văn Khoa i LỜI CẢM ƠN Trên thực tế, khơng có thành công mà không gắn liền với hỗ trợ, giúp đỡ dù hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp người khác Trong suốt thời gian thực luận án, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ quý thầy cơ, gia đình bạn bè Với lịng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến Cô PGS.TS Trần Thị Văn Thi, Thầy GS TSKH Trịnh Tam Kiệt lời cám ơn chân thành, với tri thức tâm huyết mình, q Cơ, q Thầy truyền đạt vốn kiến thức quý báu hướng dẫn cho em suốt thời gian học tập-nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy TS Lê Trung Hiếu tạo điều kiện, hướng dẫn thực nghiệm phịng thí nghiệm Hố Hữu Cơ suốt q trình thực luận án Đồng thời, quý Cô, quý Thầy đồng hành, hỗ trợ, giúp đỡ mặt vật chất cũng tinh thần giai đoạn khó khăn q trình làm Nghiên cứu sinh Tơi xin trân trọng cảm ơn khoa Hóa học, quý Thầy Cơ khoa Hố học, mơn Hố Hữu Cơ, q Thầy Cơ mơn Hố Hữu Cơ, phịng Đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Huế tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án Bạn bè gần xa dành cho tơi tình cảm, động viên, chia sẻ giúp đỡ suốt q trình tơi học tập nghiên cứu Cuối xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người thân gia đình tơi; Kính gửi đến Linh Hờn Mẹ, thời gian làm luận án thời gian có dịp bên Mẹ từ khoẻ mạnh đến Mẹ qua đời, tình thương Mẹ dành cho vô bờ bến, cảm ơn Mẹ nhớ đến Mẹ, anh chị em gia đình, anh TS Trần Văn Tôn người anh đồng hành, động viên giúp đỡ em thực ước mơ học tập từ nhỏ đến Đặc biệt, xin dành lời cảm ơn sâu nặng đến vợ hai tôi, người đồng hành tạo chỗ dựa vững cho tơi suốt hành trình thực đam mê Tơi xin trân trọng cảm ơn! Thừa Thiên Huế, tháng 01 năm 2021 Tác giả luận án Trần Văn Khoa ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình x ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 Tổng quan loài Ophiocordyceps sobolifera chi Cordyceps 1.1.1 Nguồn gốc loài Ophiocordyceps sobolifera 1.1.2 Phân loại đặc điểm hình thái lồi Ophiocordyceps sobolifera 1.1.3 Điều kiện nuôi trồng Ophiocordyceps sobolifera 1.1.4 Thành phần hóa học loài Ophiocordyceps sobolifera số loài thuộc giống Cordyceps 11 1.1.5 Hoạt tính sinh học loài Ophiocordyceps sobolifera chi Cordyceps 13 1.2 Tổng quan hoạt tính chống oxy hóa 14 1.2.1 Khái niệm 14 1.2.2 Cơ chế hoạt động chất chống oxy hóa 14 1.2.3 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 15 1.3 Tổng quan hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa 22 1.4 Tổng quan polysaccharide 27 1.4.1 Khái niệm 27 1.4.2 Hoạt tính sinh học polysaccharide 28 1.4.3 Cấu trúc polysaccharide số loài Cordyceps 29 1.5 Tổng quan mô hình quy hoạch hố thí nghiệm 31 1.6 Nhận định tình hình nghiên cứu trước Ophiocordyceps sobolifera 33 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Đối tượng nghiên cứu 35 2.1.1 Giống gốc 35 iii 2.1.2 Chứng nhận DNA 35 2.1.3 Ve sầu 35 2.2 Hóa chất thiết bị 36 2.3 Mục tiêu nghiên cứu 38 2.4 Nội dung nghiên cứu 38 2.5 Phương pháp nghiên cứu 39 2.5.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu nguyên liệu 39 2.5.2 Phương pháp tách chiết cao nước cao ethanol .43 2.5.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 43 2.5.4 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính bảo vệ thận thể động vật 45 2.5.5 Phương pháp Folin- Ciocalteu - trắc quang để định lượng tổng hợp chất phenol 49 2.5.6 Phương pháp tạo phức với muối nhôm môi trường kiềm- trắc quang để định lượng tổng hợp chất flavonoid 50 2.5.7 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) định lượng hợp chất phenol 51 2.5.8 Phương pháp tách chiết tinh chế polysaccharide 53 2.5.9 Phương pháp xác định cấu trúc 55 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64 3.1 Khảo sát điều kiện nuôi trồng nấm Ophiocordyceps sobolifera 64 3.1.1 Điều kiện hình thành kích thước sợi nấm 64 3.1.2 Điều kiện tách chiết định lượng hoạt chất polysaccharide (PS), hợp chất phenol flavonoid mẫu nấm 68 3.1.3 Ảnh hưởng yếu tố dinh dưỡng môi trường nuôi cấy đến khối lượng sinh khối hàm lượng hoạt chất polysaccharide, hợp chất phenol flavonoid nấm 72 3.2 Khảo sát số hoạt tính sinh học nấm Ophiocordyceps sobolifera 81 3.2.1 Hoạt tính chống oxy hóa in vitro mơ hình hóa học .81 3.2.2 Hoạt tính bảo vệ thận in vivo nấm Ophiocordyceps sobolifera chuột nhắt trắng bị gây tổn thương thận cisplatin 84 iv 3.3 Định tính, định lượng hoạt tính chống oxy hóa số hoạt chất phenol nấm 89 3.3.1 Định tính 89 3.3.2 Định lượng 91 3.4 Xác định cấu trúc, định lượng hoạt tính chống oxy hóa polysaccharide nấm Ophiocordyceps sobolifera 95 3.4.1 Xác định cấu trúc polysaccharide mẫu PS chiết nhiệt độ 100°C (mẫu PS-T100) 80°C (mẫu PS-T80) 95 3.4.2 Định lượng polysaccharide 109 3.4.3 Hoạt tính chống oxy hóa polysaccharide từ nấm Ophiocordyceps sobolifera 110 KẾT LUẬN 114 DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BỐ .117 TÀI LIỆU THAM KHẢO 118 PHỤ LỤC 133 v O sobolifera C sobolifera C.militaris C sinensis C.subssesilis PS PS-Ti sCr BUN MDA Vvm ROS DPPH TPC TFC TAC TA5C-HPLC HAT SET CC HPLC TLC H-NMR 13 C-NMR APCI-MS DEPT COSY ESI-MS vi HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HR-ESI-MS High Resolution - Electron Spray Ionization - Mass Spectrometry HSQC HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence IR Infrared Spectroscopy J (Hz) Hằng số tương tác tính Hz NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy UV Ultraviolet Spectroscopy δ (ppm) (ppm = part per million) s Singlet dt Double of triplet dd Double of doublet t triplet q quartet d doublet br Broad m multiplet IC50 Inhibitory Concentration 50% ED50 Effective dose 50% BDE Bond dissociation energy IE Ionization energy Mp Melting point OD Optical Density CTPT Công thức phân tử EtOAc Ethyl acetate DMSO Dimethylsulfoxide Mw Khối lượng phân tử trung bình khối Mn Khối lượng phân tử trung bình số vii Bảng 1.1 Các cơng trình nghiên cứu giới mơi trường ni cấy lồi Ophioco Bảng 1.2 Các cơng trình nghiên cứu giới vài hợp chất hóa học tiêu biểu Bảng 1.3 Một số hoạt tính sinh học polysaccharide tách chiết từ nấm thuộc chi Co Bảng 1.4 Một số nghiên cứu mơ hình in vivo gây độc thận Bảng 1.5 Một số hoạt tính sinh học polysaccharide tách chiết từ nấm Ophiocordyc Bảng 1.6 Khối lượng phân tử polysaccharide từ loài nấm Cordyceps Bảng 1.7 Thành phần monosaccharide tỉ lệ mol polysaccharide từ số loài nấm C Bảng 1.8 Các cơng bố lồi nấm Ophiocordyceps sobolifera Bảng 2.1 Các loại hóa chất sử dụng luận án Bảng 2.2 Tên thiết bị sử dụng luận án Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm Bảng 2.4 Mẫu thử thuốc thử đ định lượng creatinin Bảng 2.5 Chương trình rửa giải dung mơi Bảng 2.6 Chương trình nhiệt độ phân tích mẫu thiết bị sắc ký GC-MS Bảng 2.7 Phổ FTIR polysaccharide Bảng 3.1 Kích thước sợi nấm mơi trường có pH khác (n-3) Bảng 3.2 Hiệu suất chiết polysaccharide điều kiện khảo sát Bảng 3.3 Hiệu suất chiết hợp chất phenol điều kiện khảo sát Bảng 3.4 Thông số thiết lập với 04 yếu tố ảnh hưởng đến 04 hàm mục tiêu Bảng 3.5 Hàm lượng P hợp chất nghiệm khác Bảng 3.6 Bảng phân tích yếu tố ảnh hưởng Bảng 3.7 Kết thí n viii Mật độ quang Hình P3 Phương trình hời quy tuyến tính xác định hàm tổng flavonoid (Phản ứng tạo phức màu flavonoid với ion Al 3+ môi trường kiềm) Bảng P1 Thời gian lưu chất chuẩn gallic acid, quercetin, quercitrin, hesperidin Bảng P2 Dữ liệu xây dựng đường chuẩn 134 Diện tích peak 1000000 900000 800000 700000 600000 500000 400000 300000 y = 179634x - 1256,5 R² = 0,9981 200000 100000 0 Diện tích peak Diện tích peak Nồng độ gallic acid chuẩn (ppm) 135 peak Diện tích Hình P7 Đường chuẩn hesperidin Đường chuẩn chất chuẩn gallic acid ascorbic acid khoảng nồng độ từ Mật độ quang Mật độ quang 0,1 đến 0,5 mg/mL sử dụng mơ hình phosphor molybdenum Hình P9 Đường chuẩn ascorbic acid 136 Mật độ quang Đường chuẩn chất chuẩn MDA thử nghiệm in vivo chuột nhắt trắng: Hình P10 Đường chuẩn MDA Hình P11 Sắc ký đờ GC-MS mẫu 137 Các hình ảnh sắc ký đồ phổ PS-T80: Hình P12 Sắc ký đồ biểu diễn khối lượng phân tử PS-T80 (7.4×10 Da) Ophiocordyceps sobolifera đo GPHPLC Hình P13 Phổ FT-IR PS-T80 tách chiết từ Ophiocordyceps sobolifera 138 Hình P14 Phổ H- NMR PS-T80 Hình P15 Phổ 13 C NMR PS-T80 139 13 Hình P16 Phổ 2D H– C HSQC PS-T80 1 Hình P17 Phổ 2D H– H COSY PS-T80: a (overall); b (close up) 140 Hình P18 Phổ HMBC PS-T80 Hình P19 Cấu trúc đoạn mạch polysaccharide PS-T80 141 Kết qủa đo kiểm tra thành phần đường sau methyl hoá, mẫu so sánh mẫu PS-T100 142 143 Giấy xác nhận tên khoa học loài ve 144 Giấy chứng nhận DNA nấm Ophiocordyceps sobolifera ( Cordyceps sobolifera): 145 ... khảo sát số hợp chất hố học có hoạt tính sinh học Ý nghĩa khoa học thực tiễn: Nghiên cứu nuôi trồng khảo sát thành phần hoá học số hợp chất có hoạt tính sinh học Ophiocordyceps sobolifera thay...ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN VĂN KHOA NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM Ophiocordyceps sobolifera Ngành: Hóa Hữu Cơ Mã số: 944.01.14... chưa có nghiên cứu loài Ophiocordyceps sobolifera chưa thấy có mặt thị trường Với lý trên, đề tài lựa chọn luận án : Nghiên cứu nuôi trồng khảo sát số hợp chất có hoạt tính sinh học nấm Ophiocordyceps