Xác định hoạt tính sinh học và bản chất hóa học của một số hoạt chất từ nấm nội sinh trên cây khổ sâm (croton tonkinensis gagnep ) và cây bùm bụp (mllotus apelta lour )

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ix DANH MỤC CÁC BẢNG xi DANH MỤC CÁC HÌNH xiii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cƣơng thể nội sinh thực vật (CTNS) nấm nội sinh thực vật (NNS) 1.2 Sinh học sinh thái học NNS 1.2.1 Quan hệ NNS với chủ chúng 1.2.2 NNS bảo vệ chống tác nhân có hại 14 1.2.2.1 Bảo vệ chủ chống côn trùng hại 14 1.2.2.2 Bảo vệ chủ trƣớc điều kiện môi trƣờng bất lợi 20 1.2.3 Đa dạng sinh học NNS 21 1.2.4 NNS nhiệt đới 23 1.3 Các chất có hoạt tính sinh học từ nấm nội sinh 25 1.3.1 Đại cƣơng 25 1.3.2 Các chất kháng vi sinh vật 26 1.3.3 Các chất gây độc tế bào ung thƣ 27 1.3.3.1 Taxol 27 1.3.3.2 Các xanton 29 1.3.3.3 Các chất từ Penicillium sp nội sinh Hopea hainanensis 29 iii 1.3.3.4 Các chất từ nấm Stemphylium globuliferum nội sinh thuốc Mentha pulegium 29 1.3.3.5 Các chất từ nấm Ampelomyces sp nội sinh thuốc Urospermum picroides 30 1.3.4 Các chất chống oxy hóa 30 1.3.5 Các chất kháng kí sinh trùng 31 1.3.6 Các chất ức chế miễn dịch 33 1.3.7 Các chất chữa bệnh tiểu đƣờng 33 1.3.8 Các độc tố 34 1.3.9 Các enzym thủy phân ngoại bào 36 1.3.9.1 Đại cƣơng 36 1.3.9.2 Mối liên quan enzym với vai trò nấm nội sinh chủ 37 1.4 Nấm nội sinh thuốc 38 1.5 Các nghiên cứu nấm nội sinh Việt Nam 40 1.6 Giới thiệu chi Trichoderma 41 1.6.1 Đại cƣơng 41 1.6.2 Sinh học ứng dụng Trichoderma 41 1.6.3 Phân bố địa lý Trichoderma 43 1.7 Giới thiệu hai thuốc 44 1.7.1 Khổ sâm - Croton tonkinensis Gagnep - họ Euphorbiaceae 44 1.7.2 Bùm bụp - Mallotus apelta Lour - họ Euphorbiaceae 46 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 48 2.1 Vật liệu 48 iv 2.1.1 Mẫu 48 2.1.2 Vi sinh vật kiểm định 49 2.1.3 Các dòng tế bào 49 2.1.4 Dụng cụ, hoá chất thiết bị nghiên cứu 49 2.2 Môi trƣờng 50 2.2.1 Môi trƣờng phân lập nấm nội sinh 50 2.2.2 Môi trƣờng nuôi giữ chủng nấm nội sinh 50 2.2.3 Các mơi trƣờng thử hoạt tính enzym 51 2.2.4 Môi trƣờng nuôi VSVKĐ tế bào 52 2.3 Phƣơng pháp 52 2.3.1 Phân lập NNS từ mẫu 52 2.3.2 Phân loại nấm phƣơng pháp hình thái học 53 2.3.3 Phân loại nấm phƣơng pháp sinh học phân tử 53 2.3.4 Thu nhận cặn chiết từ dịch lên men chủng NNS 54 2.3.5 Tách chất từ cặn chiết dịch lên men chủng Trichoderma konilangbra KS14 55 2.3.6 Xác định cấu trúc hợp chất tách đƣợc 56 2.3.7 Xác định hoạt tính sinh học chủng NNS 57 2.3.7.1 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật 57 2.3.7.2 Xác định hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thƣ 59 2.3.7.3 Xác định hoạt tính chống oxy hố 61 2.3.7.4 Xác định hoạt tính enzym ngoại bào 63 2.3.8 Khảo sát tác dụng chế phẩm Trichoderma konilangbra KS14 63 khổ sâm 63 v CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 65 3.1 Phân lập nấm nội sinh từ thuốc 65 3.1.1 Các chủng nấm nội sinh từ khổ sâm 65 3.1.2 Các chủng nấm nội sinh từ bùm bụp 66 3.2 Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật chủng NNS phân lập đƣợc 68 3.3 Phân loại chủng nấm nội sinh phƣơng pháp hình thái phƣơng pháp sinh học phân tử 73 3.3.1 Phân loại chủng NNS phƣơng pháp hình thái 73 3.3.1.1 Chủng KS6 73 3.3.1.2 Chủng MB8 74 3.3.1.3 Chủng KS14 75 3.3.1.4 Chủng KS15 76 3.3.1.5 Chủng KS17 77 3.3.1.6 Chủng KS18 77 3.3.1.7 Chủng KS19 78 3.3.1.8 Chủng MR2 79 3.3.1.9 Chủng KS24 80 3.3.1.10 Chủng KS33 81 3.3.2 Phân loại chủng nấm nội sinh KS14 phƣơng pháp sinh học phân tử…… 85 3.4 Hoạt tính sinh học cặn chiết dịch lên men chủng nấm nội sinh đƣợc lựa chọn 87 3.4.1 Hoạt tính kháng VSV cặn chiết etylaxetat 87 3.4.2 Hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thƣ cặn chiết etylaxetat 90 vi 3.4.3 Hoạt tính chống oxy hố cặn chiết etylaxetat 92 3.4.4 Hoạt tính enzym ngoại bào dịch nuôi chủng nấm lựa chọn 93 3.5 Tìm hiểu điều kiện ni thích hợp cho hoạt tính kháng VSV chủng nấm T konilangbra KS14 96 3.5.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng lên men 96 3.5.2 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi 97 3.5.3 Ảnh hƣởng thời gian nuôi 99 3.5.4 Ảnh hƣởng nguồn cácbon nguồn nitơ 100 3.6 Bản chất hóa học hợp chất tách đƣợc từ dịch lên men chủng NNS T konilangbra KS14 103 3.6.1 Hợp chất KS14-1 103 3.6.2 Hợp chất KS14-2 105 3.6.3 Hợp chất KS14-3 107 3.6.4 Hợp chất KS14-4 109 3.6.5 Hợp chất KS14-5 111 3.7 Hoạt tính sinh học hợp chất tách đƣợc từ chủng T konilangbra KS14 113 3.7.1 Hoạt tính kháng VSV 113 3.7.2 Hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thƣ 115 3.7.3 Hoạt tính chống oxy hố 116 3.7.4 So sánh hoạt tính sorbixilin ergosterol peroxit với ent-7βhydroxy-18-axetoxy-kaur-16-en-15-on 117 3.8 Tác dụng chế phẩm T konilangbra KS14 khổ sâm 120 KẾT LUẬN 124 KIẾN NGHỊ 126 vii CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO 129 PHỤ LỤC viii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR Cácbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ cácbon 13) H-NMR Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton) ABTS 2,2‟-azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) ADN Axit deoxyribonucleic ADNr Axit deoxyribonucleic riboxom CKS Chất kháng sinh CMC Cacboxyl metyl xelluloza CS% Cell survival % (% tế bào sống sót) CTNS Cơ thể nội sinh thực vật DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer (Phổ DEPT) DMEM Dullbecco‟s modified Minimum Essential Medium (Môi trƣờng khoáng Dullbecco cải tiến) DMSO Dimethyl sulfoxid (Dimetyl sulfoxit) DPPH 1,1-diphenyl -2-picrylhydrazyl EC50 Efective concentration 50% ( nồng độ cần thiết để tác động 50%) EDTA Ethylenediaminetetra acetic acid (Axit etylenediaminetetra axetic) ESI- MS Electrospray ionization mass spectrometry (phổ khối ion hoá bụi electron) EtOAc Ethylacetat (Etylaxetat) EtOH Ethanol (Etanol) IC50 Inhibitory concentration 50% (Nồng độ ức chế 50%) KTKS Khuẩn ty khí sinh LC-MS Liquid Chromatography with Mass-Spectrometry (Sắc kí lỏng ghép nối khối phổ) MEME Minineal essential medium with Eagle‟s salts (Mơi trƣờng khống có muối Eagle) ix MeOH Methanol (Metanol) MIC Minimum inhibitory concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MT Môi trƣờng NNS Nấm nội sinh OD Optical Density (Mật độ quang) SC % Scavenging capacity (% khả bẫy gốc tự do) SC50 Scavenging capacity 50% (khả bẫy 50% gốc tự do) SRB Sulforhodamine B (Sunforodamin B) TCA Trichloacetic acid (Axit tricloaxetic) VSV Vi sinh vật VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định VSVNS Vi sinh vật nội sinh x DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Hoạt tính kháng VSVKĐ chủng nấm phân lập từ khổ sâm 70 Bảng 3.2 Hoạt tính kháng VSVKĐ chủng nấm phân lập từ bùm bụp 71 Bảng 3.3 Tóm tắt đặc điểm chủng NNS đƣợc phân loại phƣơng pháp hình thái 83 Bảng 3.4 Hoạt tính kháng VSV cặn chiết etylaxetat từ chủng NNS lựa chọn 89 Bảng 3.5 Hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thƣ cặn chiết etylaxetat từ chủng NNS lựa chọn 91 Bảng 3.6 Hoạt tính chống oxy hóa cặn chiết etylaxetat từ chủng NNS lựa chọn 93 Bảng 3.7 Hoạt tính enzym chủng NNS lựa chọn 94 Bảng 3.8 Hoạt tính kháng VSVKĐ chủng T konilangbra KS14 đƣợc nuôi môi trƣờng 97 Bảng 3.9 Hoạt tính kháng VSV chủng T konilangbra KS14 đƣợc ni mơi trƣờng Czapek-Dox có pH khác 98 Bảng 3.10 Hoạt tính kháng VSVKĐ chủng T konilangbra KS14 theo thời gian nuôi 100 Bảng 3.11 Hoạt tính kháng VSVKĐ chủng T konilangbra KS14 nguồn cácbon khác 101 Bảng 3.12 Hoạt tính kháng VSVKĐ chủng T konilangbra KS14 nguồn nitơ khác 102 Bảng 3.13 Hoạt tính kháng VSV hợp chất tách đƣợc từ chủng T konilangbra KS14 115 Bảng 3.14 Hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thƣ hợp chất tách đƣợc từ chủng T konilangbra KS14 116 xi Bảng 3.15 Hoạt tính chống oxy hoá hợp chất tách đƣợc từ chủng T konilangbra KS14 117 Bảng 3.16 So sánh hoạt tính hợp chất tách từ chủng nấm T konilangbra KS14 hợp chất tách từ khổ sâm 119 Bảng 3.17 Chất lƣợng cành chiết khổ sâm tháng tuổi dƣới tác dụng chế phẩm T konilangbra KS14 120 Bảng 3.18 Dữ liệu phân tích hàm lƣợng ent-kauran mẫu cành chiết khổ sâm 121 xii PHỤ LỤC Một số đặc điểm chủng nấm nội sinh phân lập từ bùm bụp STT Kí hiệu Bộ phận Sắc tố sinh chủng phân lập Màu sắc khuẩn lạc môi trƣờng MB1 Thân Trắng Không MB2 Thân Trắng-xanh Đen MB3 Thân Trắng-đen Đen MB4 MB5 Thân Lá Trắng Đen Đen Nâu MB6 Cành Vàng nâu Nâu MB7 MB8 Cành Rễ Trắng Xanh Đen Không MB9 Rễ Trắng-hồng Hồng 10 MB10 Rễ Trắng-vàng Vàng nhạt 11 MB11 Lá Trắng-nâu Đen 12 M1 Thân Đen Đen 13 14 M2 M3 Lá Lá Đen Trắng-đen Đen Đen 15 MA1 Thân Trắng Đen 16 17 MA2 MA3 Lá Lá Đen nâu Trắng-đen Caramen Đen 18 MA4 Thân Trắng Không 19 MT1 Thân Vàng Nâu nhạt 20 MR1 Rễ Trắng Trắng 21 MR2 Rễ Xanh lục Không 22 23 ML1 ML2 Lá Lá Xanh lục Đen Không Caramen 24 ML3 Lá Xanh Không PHỤ LỤC Dữ liệu phổ chất KS14-1 (Ergosterol) Phổ 1H-NMR chất KS14-1 Phổ 13C-NMR DEPT hợp chất KS14-1 PHỤ LỤC Dữ liệu phổ chất KS14-2(axit dehydracetic) Phổ 1H-NMR hợp chất KS14-2 Phổ 13C-NMR DEPT hợp chất KS14-2 PHỤ LỤC Dữ liệu phổ hợp chất KS14-3 (Sorbixilin) Phổ 1H-NMR hợp chất KS14-3 Phổ 13C-NMR DEPT hợp chất KS14-3 PHỤ LỤC Dữ liệu phổ hợp chất KS14-4 (axit 16-hydroxyoctadecanoic) Phổ 1H-NMR hợp chất KS14-4 Phổ 13C-NMR DEPT hợp chất KS14-4 PHỤ LỤC Dữ liệu phổ chất KS14-5 (Ergosterol peroxit) Phổ 1H-NMR hợp chất KS14-5 Phổ 13C-NMR DEPT hợp chất KS14-5 PHỤ LỤC Hoạt tính kháng VSV mẫu thử phiến vi lƣợng 96 giếng Dƣơng tính Âm tính Âm tính Dƣơng tính Dƣơng tính Âm tính PHỤ LỤC 10 Đồ thị giá trị IC50 mẫu KS14-3 với dòng tế bào thử nghiệm PHỤ LỤC 11 Đồ thị giá trị IC50 mẫu KS14-5 với dòng tế bào thử nghiệm PHỤ LỤC 12 Dữ liệu phổ LC-MS mẫu thử nghiệm chế phẩm C2 PHỤ LỤC 13 Dữ liệu phổ LC-MS mẫu thử nghiệm chế phẩm T1.2 PHỤ LỤC 14 Dữ liệu phổ LC-MS mẫu thử nghiệm chế phẩm T2.2 PHỤ LỤC 15 Phân lập tinh nấm nội sinh PHỤ LỤC 16 Các mẫu khổ sâm thử nghiệm chế phẩm thực địa ... định hoạt tính sinh học chất hoá học số hoạt chất từ nấm nội sinh khổ sâm (Croton tonkinensis Gagnep. ) bùm bụp (Mallotus apelta Lour .)? ??, chúng tơi nhằm mục tiêu sau đây: - Tìm kiếm số chủng nấm nội. .. nội sinh có hoạt tính sinh học cao từ thuốc đƣợc nghiên cứu Việt Nam mà đại diện hai loài khổ sâm bùm bụp - Xác định hoạt tính sinh học cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc từ chủng nấm nội sinh. .. QUẢ VÀ THẢO LUẬN 65 3.1 Phân lập nấm nội sinh từ thuốc 65 3.1.1 Các chủng nấm nội sinh từ khổ sâm 65 3.1.2 Các chủng nấm nội sinh từ bùm bụp 66 3.2 Sàng lọc hoạt tính