Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng

Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng

Xin cám ơn Ban Giám đốc, Ban Đào tạo Sau đại học của Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Phòng Nghiên cứu Khoa học và Hợp tác Quốc tế, Phòng Đào tạo Sau đại học Trường đại học Khoa học; Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Khoa Sinh-Môi trường, Trường Đại học

Sư phạm - Đại học Đà Nẵng đã có nhiều giúp đỡ quí báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất

để chúng tôi hoàn thành luận án

Xin cám ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ chúng tôi hoàn thành luận án

Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình

đã đóng góp một phần không nhỏ trong việc hoàn thành luận án này

Huế, ngày 15 tháng 02 năm 2014

Tác giả

Võ Châu Tuấn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Tác giả

Võ Châu Tuấn

MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 3

4 ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 4

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT 5

1.1.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật 5

1.1.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật 6

1.1.2.1 Nuôi cấy callus 6

1.1.2.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào 7

1.1.2.3 Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào 10

1.1.2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào 12

1.1.2.5 Nuôi cấy tế bào thực vật ở qui mô lớn 16

1.2 SỰ TÍCH LŨY CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT NUÔI CẤY IN VITRO 19

1.2.1 Vai trò của các hợp chất thứ cấp ở thực vật 19

1.2.2 Các nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu ở thực vật 19

1.2.2.1 Nhóm terpene 20

1.2.2.2 Nhóm phenol 20

1.2.2.3 Các hợp chất chứa nitrogen 20

1.2.3 Những nghiên cứu sản xuất các hợp thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực

vật 21

1.2.3.1 Những nghiên cứu ngoài nước 21

1.2.3.2 Những nghiên cứu trong nước 25

1.3 GIỚI THIỆU VỀ CÂY NGHỆ ĐEN 28

1.3.2 Thành phần hóa học 28

1.3.3 Công dụng 30

1.3.3.1 Công dụng cổ truyền 30

1.3.3.2 Các hoạt tính sinh học 30

1.3.4 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro của cây nghệ đen 35

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 37

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 37

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.3.1 Nuôi cấy callus 39

2.3.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào 39

2.3.2.1 Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác 39

2.3.2.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men 40

2.3.3 Xác định khả năng sinh trưởng của tế bào 40

2.3.4 Định lượng tinh dầu 41

2.3.5 Định lượng curcumin 41

2.3.6 Định lượng polysaccharide hòa tan trong nước 42

2.3.7 Xác định sesquiterpene 42

2.3.8 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu 43

2.3.9 Xử lý thống kê 43

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 NUÔI CẤY CALLUS NGHỆ ĐEN 44

3.2 NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO TRONG BÌNH TAM GIÁC 47

3.2.1 Ảnh hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy 47

3.2.2 Ảnh hưởng của tốc độ lắc 49

3.2.3 Ảnh hưởng của chất ĐHST 51

3.2.3.1 Ảnh hưởng của BA 51

3.2.3.2 Ảnh hưởng của 2,4-D 52

3.2.3.3 Ảnh hưởng của 2,4-D và BA 52

3.2.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon 54

3.2.4.1 Ảnh hưởng của sucrose 54

3.2.4.2 Ảnh hưởng của glucose 56

3.3 NUÔI CẤY TẾ BÀO HUYỀN PHÙ TRONG HỆ LÊN MEN 59

3.3.1 Khảo sát sinh trưởng của tế bào 59

3.3.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 61

3.3.2.1 Cỡ mẫu 61

3.3.2.2 Tốc độ khuấy 62

3.3.2.3 Ảnh hưởng của tốc độ sục khí 63

3.4 KHẢO SÁT SỰ TÍCH LŨY MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG TẾ BÀO NGHỆ ĐEN 65

3.4.1 Hàm lượng tinh dầu 65

3.4.2 Hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số 67

3.4.3 Hàm lượng curcumin 68

3.4.4 Xác định sesquiterpene 73

3.5 HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU TẾ BÀO NGHỆ ĐEN 77

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 80

NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 PHỤ LỤC

ĐHST : điều hòa sinh trưởng

HPLC : high performance liquid chromatography

(sắc ký hiệu năng cao áp) IAA : indoleacetic acid

IBA : indolebutyric acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 3.1.Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro 44

2 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của chất ĐHST lên sinh trưởng và phát

3 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào

4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của tế bào

5 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi

6 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh trưởng của tế bào nuôi

7 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sinh trưởng của tế

bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 53

8 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào

9 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng của tế bào

10 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng của tế bào

11 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào

nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L 62

12 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế

bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L 63

13 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của tốc độ sục khí lên sinh trưởng của tế

bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L 64

14 Bảng 3.14 Hàm lượng tinh dầu của tế bào nghệ đen nuôi cấy

15 Bảng 3.15 Hàm lượng polysaccharide của tế bào nghệ đen nuôi

16 Bảng 3.16 Hàm lượng curcumin của tế bào nghệ đen nuôi cấy

17

Bảng 3.17 Chiều cao phổ hấp thụ (mAU) của sesquiterpene

trong tế bào nuôi cấy ở hệ lên men 10 L và tế bào củ nghệ tự

nhiên

74

18 Bảng 3.18 Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen 78

DANH MỤC CÁC HÌNH

1 Hình 2.1 Cây nghệ đen nuôi cấy in vitro 37

3 Hình 3.1 Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro

(A) callus trắng và xốp, (B) callus trắng và mọng nước 45

4 Hình 3.2 Callus có màu vàng, rắn, rời rạc sau 14 ngày nuôi cấy 47

5 Hình 3.3 Dịch huyền phù tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy

trong bình tam giác trên môi trường có 3% sucrose 55

6

Hình 3.4 Sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình

tam giác trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA và

Hình 3.7 Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men

nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5

mg/L 2,4-D ; khuấy 120 vòng/phút; sục khí 2,0 L/phút, cỡ mẫu

100 g

60

10 Hình 3.8 Sinh khối tươi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào

nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 L 61

11

Hình 3.9 Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hê lên men

nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5

13 Hình 3.11 Phổ HPLC curcumin của củ nghệ đen 01 năm tuổi

14 Hình 3.12 Phổ HPLC curcumin của tế bào nghệ đen sau 2 đến

18 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 lít 73

15

Hình 3.13 Phổ HPLC của sesquiterpene A: Củ nghệ đen tự

nhiên; B: tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L từ 2

đến 18 ngày

76

16 Hình 3.14 Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen 77

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Trong nhiều thế kỷ qua, loài người đã dựa chủ yếu vào thực vật như là nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm thực phẩm Hơn nữa, thực vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, hương liệu, chất màu, thuốc trừ sâu sinh học hoặc các chất phụ gia thực phẩm có giá trị [132] Những sản phẩm này được biết như

là các chất trao đổi thứ cấp, được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây (thường nhỏ hơn 1% khối lượng khô) và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ Chúng được xem là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật [177] Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển

từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX và đến nay có khoảng hơn 80.000 hợp chất thứ cấp khác nhau ở thực vật đã đuợc công bố [19], [23]

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có đến 80% dân số thế giới sử dụng thảo dược làm thuốc để chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe Việc khai thác nguồn dược liệu tự nhiên từ thực vật đang trở thành một vấn đề quan trọng mang tính toàn cầu và chúng ngày càng được thương mại hóa nhiều hơn Tuy nhiên, vấn đề đặt ra hiện nay là nơi sống tự nhiên của các loài cây thuốc đang bị biến mất nhanh chóng do sự biến đổi của khí hậu toàn cầu cũng như sự khai thác bừa bãi của con người Như vậy, sản xuất các hợp chất thứ cấp thực vật bằng con đường canh tác truyền thống và tổng hợp hóa học sẽ có nhiều hạn chế, khó có thể đáp ứng đủ nhu cầu dược liệu ngày càng tăng trong tương lai [188] Điều này buộc các nhà khoa học cần phải tính đến công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật như một con đường tiềm năng để cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược phẩm [106]

Nuôi cấy tế bào thực vật đã được quan tâm nghiên cứu từ những năm

1950 Nhiều nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy tế bào thực vật là một phương thức

có hiệu quả trong sản xuất các hợp chất có hoạt chất sinh học hoặc các chất chuyển hóa của chúng [132] Ưu điểm của nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu dồi dào để tách chiết ở quy mô công nghiệp các hoạt chất mà không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên [106]; có thể tạo ra các hợp chất mới và chủ động nâng cao khả năng sản xuất chúng bằng cách thay đổi các điều kiện nuôi cấy [128]; các hoạt chất thu được không bị nhiễm bẩn bởi thuốc trừ sâu, diệt cỏ, kháng côn trùng cũng như tránh được sự không đồng nhất

về nguồn nguyên liệu và những biến động hàm lượng của các sản phẩm thực vật ngoài tự nhiên Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy, hàm lượng các

chất có hoạt tính sinh học tích lũy trong tế bào thực vật nuôi cấy in vitro tương

đương hoặc cao hơn nhiều lần so với cơ quan tích lũy của chúng trong cây ngoài

tự nhiên [140], [167] Đến nay, người ta đã thành công trong sản xuất rất nhiều loại hợp chất có giá trị theo phương thức này trên qui mô lớn

như anthraquinone ở cây Rubia akane, vincristine ở cây dừa cạn (Catharanthus

roseus), berberin ở cây Coscinium fenustratum, diosgenin ở cây Dioscorea doryophora, taxol ở các loài thuộc chi Taxus, ginsenoside ở các loài thuộc chi Panax… [163]

Nghệ đen còn gọi là nga truật thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) có nguồn gốc từ Đông Bắc Ấn Độ, được trồng ở khắp khu vực Nam Á, Đông Nam Á, Trung Quốc, Đài Loan, và Madagasca [9], [115] Củ của cây nghệ đen có chứa các hoạt chất sinh học chủ yếu là curcumin, terpenoid và tinh dầu Ngoài ra nó còn có tinh bột, chất dẻo và một số chất có vị đắng như tannin và flavonoid [82] Các nghiên cứu cho thấy, curcumin có khả năng chống được sự phát sinh khối u; một số dạng ung thư ở chuột như ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và ung thư buồng trứng [55], [66], [152]; curcumin cũng có tác dụng chống đông máu và hạ huyết áp; curcuminoid và sesquiterpene là những chất có khả năng ức

chế sự hình thành TNF-α của đại thực bào đã được hoạt hóa, do đó có tác dụng chống viêm nhiễm [152]; curcumin còn là một chất chống oxy hóa có khả năng bảo vệ tế bào Nhiều công trình nghiên cứu cũng cho thấy, tinh dầu nghệ đen có tác dụng kháng khuẩn và kháng đột biến rất cao [176] Bên cạnh đó, polysaccharide của nghệ đen ức chế hiệu quả sinh trưởng của các bướu thịt (sarcoma 180) được cấy dưới da của chuột, ngăn cản đột biến nhiễm sắc thể, có hoạt tính kích thích đại thực bào [75], [105], [169] Trong tự nhiên, nghệ đen là loài nhân giống bằng thân rễ, phải mất một thời gian dài để tạo củ nên hệ số nhân kém; năng suất thu hoạch thường thấp, đặc biệt là phụ thuộc rất lớn vào điều kiện đất đai, khí hậu, mùa vụ, chi phí nhân công và vật tư sản xuất Mặt khác, nghệ đen trong tự nhiên còn dễ mắc các bệnh như thối củ và đốm lá [29]

Vì vậy, rất khó có đủ nguồn nguyên liệu dồi dào và ổn định để sản xuất lượng lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học quý của cây nghệ đen sử dụng trong bào chế dược phẩm

Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả

năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng”

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp để sản xuất nhanh sinh khối tế bào, đồng thời xác định được khả năng tích lũy và hoạt tính sinh học một số hợp chất trong tế bào nghệ đen nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới, có

tính hệ thống về nuôi cấy in vitro tế bào cây nghệ đen và sự tích lũy một số hợp

chất có hoạt tính sinh học của chúng; đồng thời là nguồn tài liệu tham khảo hữu

ích trong nghiên cứu, giảng dạy về nuôi cấy tế bào và sản xuất các hoạt chất sinh học có giá trị cao từ nuôi cấy tế bào thực vật

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của luận án là cơ sở khoa học để phát triển hệ thống nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen ở qui mô lớn nhằm sản xuất nhanh sinh khối, cung cấp nguồn nguyên liệu liên tục và ổn định để thu hồi các hợp chất có giá trị cao dùng làm thuốc, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng

4 ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Đã tạo ra dòng tế bào callus (rắn và rời rạc) từ bẹ lá của cây nghệ đen in

vitro thích hợp để nuôi cấy huyền phù, đồng thời xác định một cách có hệ thống

các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng nhanh và ổn định của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml và trong hệ lên men 10 L

- Đã khảo sát sự tích lũy các chất có hoạt tính sinh học như: tinh dầu, curcumin, sesquiterpene và polysaccharide trong tế bào nghệ đen nuôi cấy Nghiên cứu đã xác định được hàm lượng và thời điểm tích lũy cao nhất của các hợp chất này theo đường cong sinh trưởng và đồng thời cho thấy có sự chuyển hóa sinh học các chất như curcumin và sesquiterpene xảy ra trong nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen

- Đã khảo sát được khả năng kháng khuẩn của tinh dầu chiết rút từ tế bào

cây nghệ đen nuôi cấy in vitro và nhận thấy, tinh dầu của tế bào có khả năng ức

chế sinh trưởng một số loài vi sinh vật gây bệnh ở mức tương đương hoặc cao hơn so với tinh dầu chiết rút từ củ nghệ đen 01 năm tuổi ngoài tự nhiên

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT

1.1.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy vô trùng các tế bào, mô, cơ

quan và các bộ phận của chúng dưới các điều kiện về vật lý và hóa học in vitro

[93] Thử nghiệm đầu tiên về nuôi cấy tế bào bên ngoài một cơ thể thực vật hoàn chỉnh được công bố vào năm 1902 bởi Haberlandt - nhà Sinh lý thực vật người Đức, người được biết đến như nhà sáng lập ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật Trong bài viết nổi tiếng với tiêu đề “Những thử nghiệm nuôi cấy các tế bào thực vật tách rời”, ông đã mô tả những nổ lực trong thiết lập có hệ thống nuôi cấy các tế bào thịt lá, biểu bì và lông hút Mặc dù không thành công trong nuôi cấy phân chia tế bào, nhưng ông dự đoán sẽ có khả năng đạt được sự phân chia

tế bào trong nuôi cấy các tế bào riêng rẽ, điều này đã ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự nghiệp của nhiều nhà nhà khoa học sau này Tiếp sau đó là những nghiên cứu rộng rãi theo hướng cải thiện các dung dịch dinh dưỡng và khám phá về các chất ĐHST thực vật nhằm kiểm tra lại những dự đoán của Haberlandt [164] Trong những năm 1960, nhiều nổ lực hơn nữa để cải thiện dung dịch dinh dưỡng đã đưa đến 2 công bố đáng chú ý của Skoog và cs, với hai môi trường nuôi cấy đã được dùng và mô tả đó là môi trường Murashige và Skoog [107] và môi trường Linsmaier và Skoog [85]

Nuôi cấy các tế bào đơn và các khối nhỏ tế bào thành công đầu tiên trong

nuôi cấy tế bào cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) và cây Tagetes erecta trên máy

lắc Nuôi cấy tế bào thực vật trên qui mô lớn đầu tiên thành công ở tế bào của

các cây bạch quả, bắt ruồi, cỏ Lolium và hoa hồng trong hệ lên men kiểu ráy

nước dạng đơn giản với dung tích 20 L [164]

Những thử nghiệm đầu tiên trong nuôi cấy tế bào đơn để sản xuất dược

phẩm đã được tiến hành trong những năm 1950 tại công ty Charles Pfizer [164] Đến năm 1987, đã có 30 hệ thống nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật có khả năng sản xuất các hợp chất thứ cấp cao hơn trong các thực vật tương ứng [177] Đến nay, một thế kỷ sau những nghiên cứu của Haberlandt, nhiều hợp chất thứ cấp đã được sản xuất thương mại bằng con đường nuôi cấy tế bào thực vật như

berberine, paclitaxel, ginseng saponin, polysaccharide [177]

1.1.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật

Mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, chứa đầy đủ thông tin di truyền của một cơ thể Trong những điều kiện nhất định, mỗi tế bào có thể hình thành lại được một cơ thể hoàn chỉnh Hoàn toàn có thể tách riêng và nuôi cấy tế bào độc lập để nghiên cứu mọi quá trình sống xảy ra trong đó [12]

1.1.2.1 Nuôi cấy callus

Nuôi cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các tế bào không phân hóa, được gọi là callus Nuôi cấy callus đạt được bằng cách nuôi cấy các mẫu mô tách từ thực vật trên môi trường dinh dưỡng cơ bản có chất làm rắn

là agar Môi trường dinh dưỡng cơ bản này chứa các chất dinh dưỡng khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn carbon và nhiều loại chất ĐHST thực vật Đánh giá chính xác các ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng hoặc chất ĐHST lên khả năng sinh trưởng của callus là yêu cầu quan trọng để xác định môi trường tối

ưu cho nuôi cấy Các thông số phổ biến nhất dùng trong đánh giá sinh trưởng trong nuôi cấy callus bao gồm khối lượng tươi, khối lượng khô và chỉ số sinh trưởng [93]

Trong nuôi cấy callus, các tế bào của callus có thể trải qua biến dị dòng soma trong quá trình cấy chuyển Vì vậy, các dòng tế bào ổn định di truyền nên được lựa chọn để tránh sự sản xuất thất thường các chất trao đổi thứ cấp trong nuôi cấy Thông thường, sau một số lần cấy chuyển, callus có thể được xem là dòng tế bào đồng nhất khi các thông số sinh trưởng của dòng tế bào được lặp lại

trong quá trình cấy chuyển trên cùng một loại môi trường nuôi cấy [35] Bouque

và cs (1998) đã nghiên cứu nuôi cấy 217 dòng callus khác nhau từ các loài của

chi Psoralea nhận thấy, sau 16 lần cấy chuyển (48 tuần), có khoảng 90% số dòng callus sinh trưởng ổn định [22] Fett-Neto và cs (1994) nuôi cấy tế bào cây

Taxus cuspidate và thu được dòng tế bào ổn định sinh trưởng sau 2 năm cấy

chuyển [42]

1.1.2.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào

Nuôi cấy huyền phù tế bào thường được khởi đầu bằng cách chuyển các khối callus vào nuôi cấy trong môi trường lỏng được khuấy bởi máy lắc, quay hoặc màng lọc xoay Mô callus nuôi cấy nên là loại mô dễ vỡ vụn để có thể thiết lập được dịch huyền phù tế bào với mức độ phân tán cao nhất Nuôi cấy huyền phù tế bào trong môi trường lỏng cung cấp một hệ thống duy nhất cho những nghiên cứu chi tiết về sinh trưởng và sản xuất các chất chuyển hóa So với nuôi cấy callus, nuôi cấy huyền phù sản xuất ra lượng lớn sinh khối tế bào mà từ đó các chất chuyển hóa thứ cấp có thể dễ dàng chiết tách [35]

Nuôi cấy dịch huyền phù là sự tiến triển từ thực vật đến mẫu vật, đến callus và cuối cùng đến dịch huyền phù [7] Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi callus do những chuyển động xoáy của môi trường Sau một thời gian ngắn nuôi cấy, trong dịch huyền phù là hỗn hợp các

tế bào đơn, các khối tế bào với kích thước khác nhau và các tế bào chết Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền phù tốt, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ

lệ nhỏ các cụm tế bào Khả năng tách rời của các tế bào trong môi trường có thể cải thiện bằng cách thay đổi thành phần môi trường nuôi cấy [104] Mặc

dù sự kết khối của tế bào có thể được loại bỏ bởi sự thay đổi điều kiện môi trường nuôi cấy, nhưng thường trong cuối pha lag của quá trình nuôi cấy, các

tế bào trở nên kết dính với nhau như là một qui luật Để thu được dịch huyền phù gồm phần lớn các tế bào đơn, người ta thường sử dụng các enzyme phá hủy thành tế bào hoặc dùng các sàng (rây) Tuy nhiên, các dịch huyền phù

đồng nhất đã được thiết lập thường chúng có xu hướng quay trở lại tình trạng kết khối ban đầu (Fowler và cs 1982) [104]

Cho đến nay, hầu hết các dịch huyền phù tế bào đã được nuôi cấy có sự hiện diện của cả những tế bào đơn và các khối tế bào Nhìn chung, môi trường thích hợp cho nuôi cấy callus thì cũng thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nồng độ của các auxin và cytokinin đòi hỏi cao hơn Thông thường, động học sinh trưởng của các tế bào nuôi cấy huyền phù

là đường hàm mũ; các hợp chất thứ cấp chủ yếu tạo ra trong pha ổn định, liên quan với trao đổi chất sơ cấp và phân chia tế bào [35]

Nuôi cấy huyền phù tế bào là tiến hành nuôi tế bào trong môi trường lỏng

có dung tích nhất định để thiết lập hệ huyền phù tế bào Trong quá trình nuôi cấy, bình nuôi cấy không chỉ thường xuyên có sự tăng lên của các sản phẩm trao đổi chất mà còn luôn luôn diễn ra sự trao đổi không khí với bên ngoài Khi các chất dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy bị tiêu hao, cùng với sự tạo thêm một

số sản phẩm trao đổi chất có hại, thì sự phân chia và sinh trưởng của tế bào sẽ bị

ức chế Khi đó, thông qua cấy chuyển hoặc thay đổi môi trường nuôi cấy sẽ kích thích sự sinh trưởng mạnh mẽ trở lại của huyền phù tế bào [12] Nhìn chung, có

ba phương thức nuôi cấy huyền phù tế bào là nuôi cấy mẻ, nuôi cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng và nuôi cấy liên tục

- Nuôi cấy mẻ

Nuôi cấy mẻ là phương thức mà trong suốt thời gian nuôi cấy không thêm vào chất dinh dưỡng cũng như không loại bỏ sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất Do vậy, các điều kiện môi trường luôn thay đổi theo thời gian, mật

độ tế bào tăng lên còn nồng độ cơ chất giảm xuống Nuôi cấy mẻ được xem là một hệ thống đóng, quần thể tế bào sinh trưởng và phát triển theo một số pha nhất định với những điều kiện đặc trưng [7] Mặc dù tế bào thực vật và tế bào vi sinh vật có một số điểm khác nhau như kích thước của tế bào thực vật lớn hơn, chu kỳ sinh trưởng của tế bào thực vật dài hơn, sự trao đổi chất chậm hơn…

nhưng nhìn chung sinh trưởng của tế bào thực vật trong nuôi cấy mẻ cũng trải qua các giai đoạn như tế bào vi sinh vật, gồm có bốn pha Pha lag (pha tiềm phát): bắt đầu từ khi callus được đưa vào môi trường cho đến khi có dấu hiệu phân chia tế bào đầu tiên; trong pha này không xảy ra sự tăng về khối lượng và

số lượng tế bào Pha log (pha lũy thừa): ở pha này, sự phân chia và tăng khối lượng tế bào diễn ra với tốc độ lớn nhất (số lượng tế bào tăng theo hàm mũ); Pha

ổn định: ở pha này, khả năng phân bào giảm mạnh, số lượng và khối lượng tế

bào ổn định Pha suy vong: sự sinh trưởng của tế bào ra khỏi đỉnh cao, giảm xuống và dần đến ngừng sinh trưởng nếu không được cấy chuyển [12]

- Nuôi cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng

Đây là một hình thức khác của phương thức nuôi cấy mẻ Sau khi tế bào nuôi cấy sinh trưởng cực đại, các chất dinh dưỡng sẽ dần cạn kiệt, lúc này người

ta sẽ cung cấp thêm các chất dinh dưỡng mới vào hệ lên men mà không loại bỏ dịch nuôi cũ Trong hệ lên men này, có các bộ phận điều khiển hàm lượng các chất dinh dưỡng được thêm vào giúp hạn chế hay tăng cường tốc độ sinh trưởng hoặc sự tích lũy hợp chất thứ cấp Tuy nhiên, như vậy thể tích hệ lên men sẽ tăng lên, để hạn chế việc này người ta thường sử dụng dung dịch chất dinh dưỡng dưới dạng đậm đặc Phương thức này vẫn được gọi là nuôi cấy mẻ, vì toàn bộ thể tích của hệ lên men cuối cùng được thu hồi theo từng mẻ [129]

- Nuôi cấy liên tục

Những hạn chế chính của nuôi cấy mẻ đó là tốn thời gian nhiều cho quá trình khử trùng, bổ sung vào và lấy môi trường ra, làm sạch hệ thống lên men [48] Nuôi cấy liên tục là phương pháp kinh tế vì có thể kéo dài thời gian nuôi cấy hay kéo dài pha log trong một thời gian nhất định Trong phương thức nuôi cấy này, dòng đi vào (môi trường mới) bằng với dòng đi ra (gồm môi trường, tế bào và các chất chuyển hóa) để giữ cho thể tích bình nuôi không thay đổi, và điều kiện nuôi cấy của hệ thống luôn ổn định [138]

Nhìn chung, các phương thức nuôi cấy có tính truyền thống như nuôi cấy

mẻ, nuôi cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng và nuôi cấy liên tục trong nuôi cấy

vi sinh vật có thể được dùng trong nuôi cấy tế bào thực vật Về cơ bản, thiết lập một phương thức nuôi cấy tế bào phụ thuộc bởi (1) mối quan hệ giữa sinh trưởng

và tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp và (2) khả năng các sản phẩm thứ cấp tiết

ra hoặc không tiết ra môi trường [23]

1.1.2.3 Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào

Trong nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật, cần phải theo dõi chặt chẽ sự sinh trưởng và sức sống của tế bào để tăng hiệu suất nuôi cấy tế bào cũng như cải thiện điều kiện nuôi cấy [12] Một số chỉ tiêu dùng để đánh giá động học sinh trưởng tế bào thực vật trong nuôi cấy, bao gồm thể tích lắng, thể tích đóng gói, khối lượng tươi và khối lượng khô, mật độ, chỉ số sinh trưởng, thời gian nhân đôi và một số chỉ tiêu khác của tế bào [135]

- Thể tích lắng và thể tích đóng gói của tế bào

Thể tích lắng của tế bào được xác định bằng cách cho các huyền phù tế bào trầm tích trong một cái ống có chia vạch và được biểu thị bằng phần trăm thể tích chung của dịch huyền phù, bao gồm cả sinh khối tế bào Thể tích đóng gói của tế bào được xác định bằng cách tương tự sau khi tế bào được nén chặt bởi quay ly tâm Hai thông số này cho phép đánh giá nhanh sinh trưởng của tế bào trong khi vẫn duy trì được điều kiện vô trùng mẫu Các phương pháp này thuận lợi để giám sát sự sinh trưởng của tế bào suốt một chu kỳ nuôi cấy trong các bình tam giác với điều kiện nuôi cấy như nhau, bởi vì dịch huyền phù có thể đưa trở lại các điều kiện nuôi cấy trước đó Tuy nhiên, dựa vào thể tích tế bào có lẽ không phải là cách chính xác để kiểm tra sinh trưởng vì nó phụ thuộc vào hình thái tế bào [93]

- Khối lượng tươi và khối lượng khô của tế bào

Khối lượng tươi và khối lượng khô của tế bào cho phép đánh giá sinh

trưởng của tế bào chính xác hơn các chỉ tiêu về thể tích tế bào Tuy nhiên, yêu cầu của các thao tác mẫu lại tiến hành trong điều kiện không vô trùng Việc xác định khối lượng tươi của tế bào ít tốn thời gian hơn khối lượng khô, nhưng nó không phản ánh được sự gia tăng sinh khối thực của tế bào, đặc biệt là cuối giai đoạn nuôi cấy, khi mà hầu hết sự tăng trưởng của tế bào trong nuôi cấy là do sự hấp thu nước [161]

- Mật độ tế bào nuôi cấy

Để thu được giá trị tin cậy về số lượng tế bào trong nuôi cấy huyền phù, trước hết các khối tế bào phải được phá vỡ bằng cách ủ dịch huyền phù với dung dịch chromium trioxide 8% hoặc với các enzyme thủy phân như cellulase và pectinase Phương pháp sử dụng chromium trioxide thì nhanh hơn và ít phức tạp hơn dùng các enzyme thuỷ phân, tuy nhiên nó gây trở ngại trong ước tính các tế bào sống của cùng một mẫu Phương pháp dùng enzyme duy trì được các tế bào sống và đánh giá về số lượng các tế bào sống trong cùng một mẫu bởi nhuộm màu tế bào có thể thực hiện được [122]

- Chỉ số sinh trưởng

Khối lượng tươi và khô của tế bào chỉ cho phép đánh giá sinh khối thuần túy của mô tại thời điểm lấy mẫu, chỉ số sinh trưởng tương quan với dữ liệu sinh khối tại thời điểm lấy mẫu và nuôi cấy ban đầu Nó được tính toán bằng tỉ lệ sinh khối được tích lũy với sinh khối ban đầu nuôi cấy [93]

- Thời gian tế bào nhân đôi

Thời gian nhân đôi là thời gian để lượng sinh khối của một quần thể tế bào đạt gấp hai lần so với ban đầu Một trong những điểm khác biệt lớn nhất giữa sinh trưởng của tế bào thực vật và tế bào vi sinh vật có liên quan tới tốc độ sinh trưởng riêng của chúng Mặc dù kiểu sinh trưởng có thể giống nhau, tế bào thực vật có thời gian nhân đôi hoặc tốc độ phân chia đo theo ngày, trong khi đó ở trong nhiều loài vi sinh vật thì xác định theo phút đến giờ Thời gian nhân đôi

nhanh nhất trong nuôi cấy tế bào thực vật được ghi nhận trong nuôi cấy tế bào cây thuốc lá là 15 giờ [24]

1.1.2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào

- Môi trường nuôi cấy

Thành phần môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào Trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, các chất dinh dưỡng giảm nhanh, sản phẩm trao đổi chất mới bắt đầu được tích tụ và tăng dần Ba hợp phần của môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi cấy tế bào thực vật là carbon, nitrogen và phospho Tuy nhiên, cũng không thể coi nhẹ các hợp phần khác của môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các nguyên tố vi lượng và các chất ĐHST Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất mặc

dù nồng độ của chúng có trong môi trường ở mức độ rất thấp [17]

+ Các chất ĐHST

Nhiều nghiên cứu cho thấy, các chất ĐHST có ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các chất của mô thực vật trong nuôi cấy

in vitro cũng như trong cây hoàn chỉnh Zhao và cs (2001) đã nghiên cứu ảnh

hưởng của 2,4-D và NAA phối hợp với BAP ở các nồng độ khác nhau lên sinh

trưởng và tích lũy jaceosidin của tế bào cây hoa sen tuyết (Saussurea medusa)

Kết quả cho thấy, các môi trường có sự phối hợp giữa BAP với 2,4-D thì không thích hợp cho sinh trưởng của tế bào; khi nồng độ 2,4-D gia tăng lên, khả năng sinh trưởng của tế bào giảm đi rõ rệt Sử dụng các môi trường bổ sung phối hợp giữa BAP với NAA, lượng jaceosidin tích lũy trong tế bào tăng tỷ lệ thuận với

sự gia tăng nồng độ của NAA [189] Mô của cây cà trái vàng (Solanum

xanthocarpum) khi nuôi cấy trên môi trường chứa 2,4-D thì có khả năng sản xuất

được solasodine, nhưng khi nuôi cấy trên môi trường có chứa IAA hoặc IBA thì không sản xuất được chất này [111] Năm 1993, khi nghiên cứu sản xuất

berberine từ nuôi cấy huyền phù tế bào cây Thalictrum minus, Hara và cs nhận

thấy, môi trường nuôi cấy có bổ sung 2,4-D và NAA không có tác dụng kích thích sản xuất berberine, trong khi đó khả năng sản xuất berberine của tế bào tăng khi sử dụng BAP [56]

+ Nguồn carbon

Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu dựa theo

phương thức dị dưỡng Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc Nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật thường được cung cấp dưới dạng carbohydrate Carbon vừa tham gia tổng hợp các thành phần của tế bào vừa cung cấp năng lượng cho quá trình sinh trưởng và tồn tại của tế bào Ngoài ra, carbohydrate cũng là nguồn cung cấp carbon cần thiết cho sự hình thành các sản phẩm trung gian thông qua trao đổi chất [191]

Trong phần lớn các môi trường nuôi cấy, nguồn carbon được bổ sung chủ yếu là đường sucrose và glucose với nồng độ 20 - 40 g/L Gautheret (1959) cho rằng đối với phần lớn các mô và tế bào nuôi cấy, đường sucrose và glucose là nguồn carbon tốt nhất, trong một số trường hợp khác, có thể dùng fructose, galactose và maltose (Nguyễn Đức Thành, 2000) [14] Ảnh hưởng của nồng độ sucrose trong môi trường nuôi cấy đã được nghiên cứu ở nuôi cấy tế bào tam

thất (Panax notoginseng) Khối lượng khô của tế bào tăng tỷ lệ thuận với sự gia

tăng nồng độ sucrose từ 20 đến 40 g/L, nhưng khi nồng độ sucrose lên đến 60 g/L thì dường như ức chế sự sinh trưởng của tế bào [140] Theo Gunter và cs

(2003), nuôi cấy tế bào cây Silene vulgaris ở các môi trường có nồng độ đường

sucrose thấp (dưới 30 g/L), khả năng sinh trưởng và tổng hợp polysaccharide của

tế bào không cao Khi tăng nồng độ sucrose lên dến 30 g/L khả năng tích lũy sinh khối tế bào cũng gia tăng Môi trường có chứa 30 g/L sucrose hoặc phối hợp giữa đường sucrose (15 g/L) và glucose (15 g/L) là thích hợp nhất cho sinh trưởng của tế bào [50]

- Điều kiện nuôi cấy

+ Cỡ mẫu nuôi cấy ban đầu

Cỡ mẫu đưa đưa vào nuôi cấy ban đầu rất quan trọng khi cấy chuyển tế bào thực vật, và cũng có thể ảnh hưởng đến sự sản xuất hợp chất trao đổi thứ cấp Khi lượng mẫu ban đầu thấp hơn lượng mẫu tới hạn thấp nhất thì tế bào thường không sinh trưởng được [78] Matsubara và cs (1989) trong nghiên cứu nuôi cấy tế bào

cây Coptis japonica đã nhận thấy, khi lượng mẫu đưa vào nuôi cấy cao thì sinh

khối tế bào và berberine thu được cũng cao Lượng mẫu đưa vào nuôi cấy thích hợp nhất cho sinh trưởng và tích lũy berberine của tế bào là 8 g/L, đạt 55 g/L sinh khối và 3,5 g/L berberine sau nuôi cấy [97] Lượng mẫu nuôi cấy ảnh hưởng lớn

đến sinh trưởng tế bào được tìm thấy trong nuôi cấy tế bào cây Gymnema

sylvestre Với lượng mẫu tế bào đưa vào nuôi cấy là 60 g/L thì khả năng sinh

trưởng của tế bào là cao nhất, nếu lượng mẫu đưa vào nuôi cấy là 80 hoặc 100 g/L thì sinh trưởng tế bào bị giảm rõ rệt [78] Kết quả nghiên cứu nuôi cấy ở mật độ

cao tế bào của cây tía tô (Perilla frutescens ) để sản xuất anthocyanin cho thấy,

lượng mẫu đưa vào nuôi cấy ảnh hưởng đáng kể lên động học của quá trình sinh trưởng và tích lũy anthocyanin của tế bào Sinh trưởng và tích lũy anthocyanin của

tế bào tốt nhất khi nuôi cấy với lượng mẫu nuôi cấy là 50 g/L, sinh khối tế bào đạt 38,3 g/L sau 11 ngày nuôi cấy, và anthocyanin đạt 5,8 g/L sau 10 ngày nuôi cấy; cao gấp 3,3 lần (lượng sinh khối) và 24 lần (lượng anthocyanin) so với nuôi cấy

mà lượng mẫu chỉ sử dụng là 15 g/L [191]

+ Khuấy trộn

Khuấy trộn là điều cần thiết để phân bố đồng đều tế bào, mô, chất dinh

dưỡng trong pha lỏng [77] Việc khuấy trộn thường được thực hiện bằng cách

sục khí hoặc dùng cánh khuấy cơ học hoặc kết hợp cả 2 phương pháp trên Thủy động lực cho việc hòa trộn cần phải nhỏ để không làm hư hại mô hay tế bào nhưng phải đủ để kích thích chức năng của tế bào [116] Hầu hết các chất dinh dưỡng đều có khả năng hòa tan cao trong nước, do đó trong thời gian lên

men nếu chỉ để phân bố đều môi trường thì sự khuấy trộn không thật cần thiết Tuy nhiên, đối với oxy hòa tan thì phải có sự khuấy trộn tốt vì khả năng hòa tan của nó trong môi trường lên men là rất kém, trong khi yêu cầu oxy cho sự sinh trưởng của các vi sinh vật hiếu khí (hoặc tế bào thực vật và động vật) lại rất cao [7]

Nghiên cứu của Wang và cs (2010) cho thấy, nuôi cấy tế bào cây

Glycyrrhiza inflata trong hệ lên men, với tốc độ khuấy đạt 150 vòng/phút thì

sinh khối tế bào đạt cao nhất, trong khi đó với tốc độ khuấy ở 100 và 300 vòng/phút thì sự tích lũy sinh khối tế bào kém hơn [171] Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế bào cây dầu cọ, Choi và cs (2008) đã khảo sát ở các tốc độ khuấy từ 80 - 335 vòng/phút Kết quả cho thấy, ở tốc độ khuấy 120 và 225 vòng/phút, sinh khối tế bào tăng 200%; ở tốc độ khuấy 335 vòng/phút sinh khối tế bào chỉ tăng khoảng 7% so với sinh khối tế bào đưa vào nuôi cấy ban đầu [33]

+ Sục khí

Sục khí trong nuôi cấy tế bào thực vật nhằm đáp ứng ba chức năng chính

đó là duy trì điều kiện hiếu khí, giảm hấp thụ các sản phẩm bay hơi và loại bỏ nhiệt sinh ra từ quá trình trao đổi chất Tốc độ tiêu thụ oxy đặc trưng của tế bào thực vật phụ thuộc vào dòng tế bào, điều kiện nuôi cấy và giai đoạn sinh trưởng, nhưng nhìn chung là khoảng 6 x 10−4

g O2/g khối lượng khô/phút [72].Tốc độ hấp thụ oxy phải đủ lớn để cung cấp đầy đủ lượng oxy cần thiết cho nhu cầu hô hấp của tế bào và vì thế nó hỗ trợ cho sinh trưởng tế bào và sản xuất các hợp chất mong muốn, tuy nhiên không nên quá cao bởi vì cả việc cung cấp dư thừa hoặc thiếu oxy đều có thể ức chế sự sinh trưởng và trao đổi chất thứ cấp của tế bào Để tránh những mặt hạn chế của oxy, hàm lượng oxy hòa tan trong môi trường nuôi cấy phải được giữ trên mức hàm lượng oxy hòa tan tới hạn (thông thường khoảng 15-20% bão hòa không khí) [72]

Lee và cs (2006) nghiên cứu khảo sát sự ảnh hưởng của một số điều kiện

nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của tế bào cây Gymnema sylvestre trong hệ

lên men 2 L Kết quả cho thấy, trong các tốc độ sục khí khảo sát từ 0,1 đến 0,4 L/L/phút thì tốc độ sục khí 0,1 L/L/phút là thích hợp nhất cho sinh trưởng của tế bào [78] Thông thường, tốc độ dòng khí thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật nằm trong khoảng 0,1-0,5 L/L/phút [40] Tuy nhiên, việc tăng dần tốc độ dòng khí phù hợp với tình trạng sinh lý tế bào trong suốt quá trình nuôi cấy có thể có lợi cho sinh trưởng của tế bào Bằng cách áp dụng kiểu sục khí như vậy (2 ngày đầu nuôi cấy, sục khí tốc độ dòng 0,5 L/phút và sau đó là 1,0

L/phút) trong nuôi cấy tế bào cây hoa hướng dương (Helianthus annuus) Haas

và cs (2008) đã nhận thấy, sinh khối tế bào tích lũy cao và đạt đến 15 g/L khối lượng khô [53]

Ảnh hưởng của nồng độ oxy (20,8 - 50%) môi trường nuôi cấy trong hệ

lên men lên khả năng sinh trưởng của tế bào Panax ginseng đã được nghiên cứu

Nồng độ oxy 40% thì thích hợp cho tích lũy sinh khối và sản xuất ginsenoside, đạt 12,8 g/L sinh khối khô và 4,5 mg/g ginsenoside Các nồng độ oxy: 20,8; 30

và 50% thì không thích hợp cho sự sinh trưởng cũng như tích ginsenoside của tế bào nuôi cấy [159] Véronique và cs (1992) nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ

oxy lên sinh trưởng của tế bào cây cà rốt (Daucus carota) trong hệ lên men nhận

thấy, nồng độ oxy giảm thì tốc độ sinh trưởng tế bào cũng giảm theo Kết quả cũng cho thấy, phản ứng của các loại tế bào khác nhau đối với nồng độ oxy cũng khác nhau Đối với nuôi cấy tạo phôi soma, nồng độ oxy 75% đã ức chế khả năng sinh trưởng của tế bào [166]

1.1.2.5 Nuôi cấy tế bào thực vật ở qui mô lớn

Nhìn chung, nuôi cấy tế bào thực vật lên qui mô lớn là thực hiện quá trình sinh học ở qui mô phòng thí nghiệm lặp lại gần như có thể để sản xuất một lượng lớn hơn các sản phẩm mong muốn Trình tự của một quá trình nâng cấp điển hình bắt đầu từ nuôi cấy tế bào trong các chai, lọ đến bình tam giác nuôi cấy

lắc có dung tích 1 L, sau đó đến hệ lên men bằng thuỷ tinh từ 1-10 L, và sau đó nâng cấp đến hệ lên men bằng thép không rỉ từ 30-150 L rồi đến 1000 L [181]

Hệ lên men là một hệ thống nuôi cấy tự động mà chức năng chính của nó là cải thiện khả năng kiểm soát môi trường nuôi để đạt được các điều kiện tối ưu cho sinh trưởng của tế bào và/hoặc hình thành sản phẩm Tế bào thực vật được nuôi cấy trong hệ lên men đầu tiên vào những năm 1960, sử dụng những thiết bị được làm phù hợp cho nuôi cấy tế bào thực vật từ những thiết bị lên men thương mại hoặc không thương mại dùng trong nuôi cấy tế bào động vật [123], [144]

Các nghiên cứu trong hệ lên men là khâu cuối cùng của nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật để thương mại hóa các chất trao đổi thứ cấp Đây là bước quan trọng vì có nhiều vấn đề có thể phát sinh khi nâng cấp từ nuôi cấy lắc trong các bình tam giác đến nuôi cấy ở các hệ lên men [181] Hệ lên men hoạt động như một nhà máy sinh học sản xuất các sản phẩm có lượng cao với nhiều ưu điểm như sau: Các sản phẩm được kiểm soát không phụ thuộc vào nguồn thực vật sẵn có; Tăng các dung tích làm việc; Nuôi cấy đồng nhất do có cơ chế khuấy trộn bằng cơ học hoặc sục khí; Kiểm soát tốt hơn môi trường nuôi cấy và điều kiện vật lý vì vậy có thể dễ dàng tối ưu hóa các thông số sinh trưởng như: dinh dưỡng, pH, nhiệt độ… trong sản xuất các chất chuyển hóa; Có thể kiểm soát các sản phẩm cuối cùng dưới các điều kiện sinh trưởng; Cải thiện khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng để kích thích tốc độ nhân nhanh và sản xuất hàm lượng cao hơn các hoạt chất sinh học; Thu hồi các tế bào đơn giản và nhanh hơn; Thuận lợi trong các khảo nghiệm về sinh tổng hợp hoặc/và chuyển hóa sinh học có liên quan với sản xuất các chất trao đổi bởi các enzyme sẵn có; Dễ dàng hơn trong phân tách các hợp chất mong muốn bởi tính phức tạp thấp của các dịch chiết; Kiểm soát tốt hơn trong nâng cấp sản xuất trên qui mô lớn [44], [52]

Các hệ lên men được dùng chủ yếu cho nuôi cấy trên qui mô lớn tế bào thực vật để sản xuất sinh khối tế bào hoặc các chất chuyển hóa [181] Hiệu suất của bất kỳ hệ lên men nào đều tùy thuộc một số khả năng sau: Duy trì nồng độ

sinh khối phải cao; Duy trì điều kiện vô trùng; Phân bố đồng đều dinh dưỡng và các nguyên liệu sống trong nồi lên men thông qua sự khuấy trộn hiệu quả; Tăng hoặc giảm nhiệt tùy vào yêu cầu nuôi cấy; Tạo ra lực trượt vừa phải Mức độ trượt cao có thể nguy hại cho tế bào nuôi cấy, nhưng lực trượt thấp cũng có thể không mong muốn bởi vì hình thành bọt hoặc bám dính của các khối tế bào lên cánh khuấy và thành của nồi lên men [86]

Có nhiều kiểu của hệ lên men đã được dùng trong nuôi cấy tế bào thực vật Các hệ lên men có tính truyền thống như các hệ lên men khuấy trộn bằng

cánh khuấy, airlift reactors và sủi bọt khí dạng cột sử dụng trong nuôi cấy in

vitro tế bào thực vật đã được phiên bản từ các hệ lên men dùng trong công nghệ

sinh học vi sinh vật [48] Những nổ lực thiết kế hệ lên men dành riêng cho nuôi cấy tế bào thực vật được thực hiện vào cuối những năm 1970 Với sự nhận thức

sâu về tính mẫn cảm của các tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro với lực trượt,

vì vậy trong hơn một thập niên, chỉ có dạng hệ lên men airlift được xem là thích hợp cho nuôi cấy tế bào thực vật [165] Tuy nhiên, đã có nhiều nghiên cứu tiến hành nuôi cấy tế bào thực vật trong hệ lên men khuấy trộn bằng cánh khuấy Ritterhaus và cs (1990) đã sử dụng các hệ lên men khuấy trộn bằng cánh khuấy với dung tích 75, 750, 7.500, 15.000 và 75.000 L để nuôi cấy tế bào cây

Echinacea purpurea, Rauwolfia serpentina và một số thực vật khác trên qui mô

lớn [133] Wang và Zhong (1996) đã phát triển một loại hệ lên men mới dùng

nuôi cấy in vitro thực vật mẫn cảm với lực trượt đó là hệ lên men khuấy trộn

bằng cánh khuấy ly tâm (CIB) [172] Zhang và Zhong (2002) cũng đã dùng hệ

lên men CIB (3 L) để nuôi cấy huyền phù tế bào cây tam thất, với tốc độ khuấy

145 vòng/phút, sinh khối tế bào tích lũy đạt 22 g/L [186] Hơn nữa, các tác giả

này cũng đã nuôi cấy thành công tế bào cây P notoginseng khi nâng cấp dung

tích hệ lên men này lên đến 30 L, sự tích luỹ sinh khối đạt trên 25 g/L, sản lượng saponin và polysaccharide cũng cao hơn (1,7 so với 1,5 g/L và 2,9 so với 2,7 g/L) Từ các nghiên cứu này, Zhang và Zhong (2002) cho rằng, hệ lên men CIB

có tiềm năng lớn trong sản xuất sinh khối tế bào để chiết tách các chất mong muốn trên qui mô lớn [186] Năm 2007, Prakash và Srivastava cũng đã nuôi cấy

thành công tế bào cây Azadirachta indica để sản xuất sinh khối và azadirachtin

trong hệ lên men CIB và nhận thấy, hệ men lên men này tạo ra lực trượt thấp và khả năng trao đổi oxy cũng được cải thiện [125]

1.2 SỰ TÍCH LŨY CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG TẾ BÀO THỰC

VẬT NUÔI CẤY IN VITRO

1.2.1 Vai trò của các hợp chất thứ cấp ở thực vật

Ở thực vật, có nhiều loại hợp chất hữu cơ hoặc các chất chuyển hóa được tạo

ra trong quá trình trao đổi chất Những chất chuyển hóa này được xếp thành nhóm các chất trao đổi sơ cấp và thứ cấp Các hợp chất thứ cấp tìm thấy chỉ trong một số loài thực vật hoặc trong nhóm loài có liên quan nhau, trong khi đó các hợp chất sơ cấp được tìm thấy trong hầu hết các loài [153] Trong vài thập kỷ qua, những bằng chứng từ thực nghiệm và thực tế cho thấy, các hợp chất thứ cấp ở thực vật có các chức năng cơ bản sau: Bảo vệ cơ thể chống lại các loài động vật ăn cỏ; Kháng nấm,

vi khuẩn, virus; Chống lại sự canh tranh về ánh sáng, nước và chất dinh dưỡng; Thu hút các loài động vật trong quá trình thụ phấn và phát tán hạt; Tạo ra các tín hiệu trong giao tiếp giữa thực vật với các loài vi sinh vật cộng sinh; Chống lại tia tử ngoại và các tác nhân vật lý bất lợi khác [177] Arnason và cs (1995) đã công bố thực vật sản xuất hơn 80.000 hợp chất khác nhau thông qua con đường trao đổi thứ cấp Các sản phẩm thứ cấp được dự trữ chủ yếu trong các cấu trúc đặc biệt hoặc các cơ quan dự trữ như rễ, các tế bào dự trữ, không bào, hệ thống màng…[19] Các hợp chất hóa học này được dùng trong dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, thuốc nhuộm, gia vị, chất tạo mùi, thuốc trừ sâu; chúng đã đóng góp nhiều tỷ đô la trong sản xuất công nghiệp [47]

1.2.2 Các nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu ở thực vật

Các hợp chất thứ cấp của thực vật có thể phân thành ba nhóm chính đó là terpene, phenol và các hợp chất chứa nitrogen

1.2.2.1 Nhóm terpene

Terpene, terpenoid hoặc isoprenoid là các dimer, trimer hoặc polymer của các đơn vị isoprene Các đơn vị isoprene thường liên kết để hình thành nên các hợp chất mạch thẳng hoặc mạch vòng phổ biến với 10 carbon (monoterpenoid), 15 carbon (sesquiterpenoid), 20 carbon (diterpenoid) hoặc 30 carbon (triterpenoid) và rất hiếm dạng terpenoid được tìm thấy với 25 carbon [153] Các monoterpene được tìm thấy rộng rãi trong tinh dầu thực vật, ví dụ như menthol, borneol, linalool… Chúng được sử dụng như là các chất kháng côn trùng và các chất có hoạt tính dược

lý như giảm đau và kháng viêm Sesquiterpene là thành phần của tinh dầu ở nhiều loài thực vật, những hợp chất này có hoạt tính như kháng khuẩn, kháng nấm, diệt trừ giun sán, chống sốt rét…[51] Diterpennoid được tìm thấy trong nhiều loài thực vật và động vật Một số chất của chúng được ứng dụng trong điều trị bệnh, chẳng hạn như taxol và các dẫn xuất của chúng được dùng làm thuốc điều trị ung thư, forskolin chống tăng huyết áp Triterpene là hợp chất terpene chứa 30 carbon, chúng cũng được sử dụng nhiều trong dược phẩm [51]

1.2.2.3 Các hợp chất chứa nitrogen

Phần lớn các hợp chất thứ cấp của thực vật đều có chứa nitrogen trong cấu trúc của chúng Các hợp chất này được biết đến như là các hợp chất chống lại các động vật ăn cỏ như alkaloid và cyanogenic glycoside Chúng

được quan tâm nhiều bởi tính độc đối với con người và các thành phần dược chất của chúng [153]

Các alkaloid có dạng tinh thể, có hoạt tính sinh lý trên tất cả các động vật

và được sử dụng trong công nghiệp dược Alkaloid thường độc với liều lượng lớn nhưng với liều lượng nhỏ, chúng được sử dụng làm thuốc chữa bệnh [104] Các cyanogenic glycoside là vũ khí bảo vệ của thực vật Chúng không độc cho chính bản thân thực vật mà sẵn sàng hình thành các phân tử bay hơi có tính độc khi thực vật bị đe doạ Một số chất trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm, chất mùi thực phẩm và dược phẩm [79]

1.2.3 Những nghiên cứu sản xuất các hợp thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật

1.2.3.1 Những nghiên cứu ngoài nước

Nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy đã được tiến hành bởi các nhà khoa học thực vật và vi sinh vật ở nhiều quốc gia Hầu hết các ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong công nghệ sinh học đều nhằm vào mục đích sản xuất các hợp chất thứ cấp và gần đây là sản xuất các chất điều trị ung thư quan trọng như taxol, vinblastine và vincristine [113] Những thành tựu đạt được trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất dùng

để chữa bệnh đã tạo ra khả năng có thể sản xuất trên qui mô lớn các chất alkaloid, terpenoid, steroid, saponin, phenol, flavonoid và các amino acid [167]

Taxol là một trong những tác nhân kháng ung thư triển vọng nhất được biết đến bởi dạng hoạt động độc nhất của nó trên hệ thống vi tế bào hình ống [113]

Hiện nay, sản xuất taxol nhờ nuôi cấy tế bào của các loài Taxus đã trở thành một trong những ứng dụng rộng rãi trong nuôi cấy tế bào thực vật và đang làm chủ các

giá trị thương mại to lớn của taxol, một chất chỉ có dạng vết trong cây thủy tùng

và tổng hợp hóa học rất đắt tiền [65] Christen và cs (1989) công bố đầu tiên về

sản xuất taxol (paclitaxel) bởi nuôi cấy tế bào Taxus [34] Fett-Neto và cs (1995)

đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và các yếu tố khác lên sản xuất trong nuôi cấy tế bào, kết quả sản xuất paclitaxel đạt 0,02% khối lượng khô [41]

Kim và cs (1995) cũng đã tạo ra paclitaxel trong nuôi cấy tế bào cây Taxus

brevifolia sau 10 ngày trên môi trường tối ưu chứa 6% fructose [74] Bên cạnh sự

tích lũy paclitaxel, một số toxoid cũng đã được tìm thấy cả trong tế bào và môi

trường nuôi cấy tế bào Taxus [71] Parc và cs (2002) đã sản xuất toxoid bằng nuôi cấy callus của các cây Taxus được chọn lọc [121] Để tăng sản xuất toxoid, bổ

sung các amino acids vào môi trường nuôi cấy cũng đã được khảo sát, kết quả cho

thấy, phenylalanine đã tăng sản xuất taxol tối đa trong nuôi cấy tế bào cây T

cuspidata [92]

Từ xưa, rễ của cây nhân sâm đã được sử dụng rộng rãi như một vị thuốc bổ, một dược phẩm quí giá [148] Ginseng đã được biết đến như là nhân tố kỳ diệu để tăng cường sức khoẻ và kéo dài tuổi thọ Thành phần hoạt chất chính có trong nhân sâm được xác định là ginsenoside, thuộc nhóm saponin triterpenoid [167] Furuya (1988) đã nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường và ĐHST để tăng lượng ginsenoside [45] Nuôi cấy tế bào cây nhân sâm trên quy mô lớn đã được Yasuda và cs (1972) công bố [180] Sau đó, quy trình nuôi cấy ở quy mô công nghiệp đã được công ty Nitto Denko (Ibaraki, Osaka, Nhật Bản) thực hiện trong hệ lên men có cánh khuấy với dung tích 2000 và 20.000 L, năng suất ginsenoside đạt được là 500-700 mg/L/ngày [60] Quy trình này được xem như là một bước ngoặc quan trọng trong thương mại hóa nuôi cấy mô và tế bào ở quy mô lớn Wang và Zhong (2002) nhận thấy bổ sung methyljasmonate hoặc dihydro-methyl jasmonate vào môi trường nuôi cấy đã tăng khả năng hiệu suất ginsenoside của tế bào cây

nhân sâm [173] Nuôi cấy rễ được gây nhiễm Agrobacterium rhizogenes đã được

tiến hành và hiệu suất ginsenoside đạt được cao hơn 3 lần so với nuôi cấy loại callus tạo từ rễ bình thường [60] Các kết quả nghiên cứu này cho thấy, nuôi cấy tế bào cây nhân sâm vẫn là lĩnh vực thu hút nhằm thương mại hóa trên thế giới và là tiềm năng to lớn cho công nghiệp hóa sinh [138]

L-DOPA là một tiền chất của các alkaloid, betalain và melanine; được

tách chiết từ các cây Vinca faba, Mucuna, Baptisia và Lupinus [148] Nó còn là

một tiền chất của catecholamine ở động vật và được sử dụng như là một loại thuốc tiềm năng cho điều trị bệnh Parkinson [62] L-DOPA được dùng rộng rãi trong điều trị bệnh nên có nhu cầu lớn và giá thành cao, chính vì thế nuôi cấy tế bào được xem như là phương thức thay thế để sản xuất L-DOPA nhiều hơn [26]

Teramoto và Komamine (1988) đã tạo callus của cây Mucuna hassjoo, M

pruriense, M deeringia và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy Kết quả nghiên cứu

cho thấy, nồng độ cao nhất của L-DOPA thu được khi nuôi cấy tế bào của cây

M hassjoo trên môi trường MS bổ sung 0,025 mg/L 2,4-D và 10 mg/L kinetin

[156] Hàm lượng L-DOPA trong tế bào nuôi cấy đạt khoảng 80 mmol/g khối lượng tươi cũng đã được Vanisree và cs (2004) công bố [162]

Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong rễ của cây Coptis japonica

và trong vỏ của cây Phellondendron amurense Bằng cách chọn dòng có năng

suất cao, nhóm nghiên cứu của Mitsui và cs đã tạo ra berberine trên quy mô lớn với năng suất 1,4 g/L sau hơn 2 tuần nuôi cấy [167] Với việc sử dụng chất kích kháng polysaccharide của nấm men, Sarin (2005) đã thành công trong việc sản

xuất với mức tương đối cao của berberine trong nuôi cấy tế bào cây T rugosum

[138] Ảnh hưởng của permidine lên sản xuất berberine trong nuôi cấy tế bào cây

T minus cũng đã được công bố bởi Hara và cs (1991) [57]

Diosgenin là tiền chất cho tổng hợp hóa học của thuốc steroidal và cực kỳ quan trọng trong công nghiệp dược phẩm [39] Tal và cs (1983) đã nghiên cứu

sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào cây D deltoidea Họ nhận thấy rằng

hàm lượng carbon và nitrogen ảnh hưởng lớn đến sự tích lũy diosgenin trong một dòng tế bào nuôi cấy [154] Ishida (1988) nhận thấy sản xuất diosgenin được

kích thích khi tiến hành nuôi cấy cố định tế bào cây D deltoidea, với sản lượng tăng 25% Kaul và cs (1969) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên sản xuất diosgenin trong nuôi cấy callus và huyền phù tế bào cây D deltoidea [70]

Campothecin là một alkaloid kháng ung thư tiềm năng có trong cây

Camptotheca acuminate (Padmanabha, 2006) Sakato và Misawa (1974) đã

nghiên cứu tạo callus của cây C acuminata trên môi trường MS bổ sung 0,2

mg/L 2,4-D và l mg/L kinetin và nuôi cấy lỏng với sự có mặt của gibberellin và L-tryptophan; hàm lượng camptothecin thu được khoảng 0,0025% khối lượng khô [136] Nghiên cứu của Thengane và cs (2003) cho thấy, khi nuôi cấy tế bào

cây C acuminata trên môi trường MS có bổ sung 4 mg/L NAA thì sự tích lũy

camptothecin đạt được là 0,998 mg/L [160]

Vincristine và vinblastine là các indole alkaloid nhị trùng ngưng đã trở thành thuốc có giá trị trong hóa trị liệu ung thư bởi hoạt tính kháng ung thư tiềm năng của chúng chống lại nhiều khối u rắn và bạch cầu Những hợp chất này chiết tách thương mại từ số lượng lớn của cây dừa cạn Do hàm lượng vincristine

và vinblastine chứa trong cây thấp (0,0005%), vì vậy nuôi cấy tế bào đã được nghiên cứu như một sự thay thế cho sản xuất một lượng lớn các alkaloid này [113] Vinblastine hợp thành từ catharanthine và vindoline Vì vindoline có nhiều catharanthin trong cây hoàn chỉnh nên nó ít đắt tiền hơn [20] Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiều hợp chất như vanadyl sulphate, abscisic acid và sodium chloride lên sản xuất catharanthin cũng đã được công bố bởi Smith và cs (1987) [146] Ảnh hưởng của nhiều yếu tố như stress, bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, các chất kích kháng và các tiền chất tổng hợp lên sản xuất indole alkaloid cũng đã được Zhao và cs (2001a; 2001b) công bố [189], [190]

Các chất tanshinone thuộc nhóm quinoid diterpenoid được cho là những

chất có hoạt tính của cây Salvia miltiorrhiza, chúng được dùng làm dược liệu

truyền thống của Trung Quốc [174] Nakanishi và cs (1983) đã thiết lập được

một dòng tế bào có chứa một lượng lớn cryptotanshinone từ cây S miltiorrhiza [110] Shimomura và cs (1991) nghiên cứu nuôi cấy rễ bất định cây S

miltiorrhiza và khảo nghiệm các điều kiện nuôi cấy cho hiệu suất tanshinone cao

[141] Sản xuất diterpenoid ở rễ tơ của cây S miltiorrhiza cũng đã được Hu và

Alfermann (1993) nghiên cứu [61]

Podophyllotoxin là nguyên liệu khởi đầu cho việc điều chế các dẫn xuất bán tổng hợp như toposide, teniposide và được dùng rộng rãi trong điều trị

kháng khối u [31] Các cây Podophyllum peltatum và Podophyllum hexandrum

sinh trưởng rất chậm, việc thu hồi podophyllotoxin từ tự nhiên cũng gặp khó khăn Do đó, những hạn chế trong việc cung cấp podophyllotoxin từ tự nhiên cần

phải được khắc phục [117] Nuôi cấy tế bào cây P peltatum để sản xuất

podophyllotoxin được nghiên cứu đầu tiên bởi Kadkade (1982) [69] Để tăng sản

lượng của podophyllotxin, Woerdenberg và cs (1990) đã sử dụng phức chất conifery1 alcohol và b-cyclodextrin để nuôi cấy huyền phù tế bào cây P

hexandrum [178]

1.2.3.2 Những nghiên cứu trong nước

Ở nước ta, công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật phát triển vào những năm

1970 và đến nay đã đạt được một số thành công Một trong những kết quả nuôi

cấy tế bào thành công nhất đó là nuôi cấy tế bào cây sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis) Sâm Ngọc Linh có tác dụng phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào

gan, kích thích hệ miễn dịch, chống stress và trầm cảm, chống oxy hóa, lão hóa Hiện nay, loài cây này bị khai thác cạn kiệt và có nguy cơ tuyệt chủng [157] Thanh và cs (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường lên sản xuất sinh khối và ginsenoside trong nuôi cây huyền phù tế bào cây sâm Ngọc Linh Kết quả cho thấy, môi trường ½MS và MS thích hợp cho cả sản xuất sinh khối cũng như ginsenoside, sinh khối và ginsenoside đạt lần lượt là 9,8 g/L và 6,81 mg/g khối lượng khô Nồng độ sucrose tăng từ 20-50 g/L đã tăng sản xuất sinh khối, tuy nhiên khi sucrose tăng đến 70 g/L thì ức chế cả sinh trưởng và tích lũy ginsenoside của tế bào Nồng độ nitrogen thích hợp cho cả sinh trưởng và tích lũy ginsenoside là 30 mM [157] Nghiên cứu của Thanh và cs (2008) cũng cho thấy, NH4NO3 nồng độ 0,5 g/L cho sinh khối lớn nhất và hàm lượng ginsenoside đạt cao nhất là 6,5 mg/g khối lượng khô Nồng độ 1,0 g/L của KNO3thích hợp cho sinh trưởng tế bào nhưng ginsenoside thu được lớn nhất (6,1 mg/g

khối lượng khô) lại ở nồng độ 2,0 g/L KNO3 Nghiên cứu còn cho thấy, sinh trưởng cũng như hàm lượng ginsenoside của tế bào tăng đáng kể khi bổ sung CaCl2 vào môi trường nuôi cấy [158]

Nghiên cứu sản xuất taxol từ các hệ thống tế bào in vitro cũng đã và đang

được quan tâm bởi các nhà khoa học trong nước Lê Thị Thuỷ Tiên và cs ( 2006)

đã nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây thông đỏ (Taxus wallichiana) Callus hình

thành và sinh trưởng tốt trên môi trường B5 có bổ sung auxin và cytokinin Môi trường có 4 mg/L 2,4-D và 1 mg/L kinetin thích hợp cho sự hình thành và sinh trưởng callus từ thân non Callus từ lá non sinh trưởng tốt trên môi trường có 3 mg/L NAA và 0,25 mg/L kinetin Nuôi cấy tế bào được thiết lập trên môi trường lỏng có cùng thành phần với môi trường nuôi cấy callus; phân tích cho thấy, có

sự hiện diện của taxol trong callus và huyền phù tế bào, và không tìm thấy taxol trong môi trường nuôi cấy [16] Ảnh hưởng của các nguồn carbon lên sinh trưởng của tế bào cây thông đỏ đã được Nhut và cs (2006) nghiên cứu Kết quả cho thấy, môi trường nuôi cấy có bổ sung 30g/L glucose và 30 g/L fructose là thích hợp nhất cho sinh trưởng của tế bào [112] Dương Tấn Nhựt và cs (2007) cũng đã nghiên cứu thiết lập điều kiện nuôi cấy tế bào cây thông đỏ và tái sinh callus từ tế bào dịch huyền phù Các tế bào và callus thu nhận được có thể sử dụng để nhân, định lượng và tách chiết taxoid [11]

Cà gai leo (Solanum hainanense) là một cây thuốc quý, rễ của chúng

thường được dùng làm thuốc chữa các bệnh phong thấp, đau nhức xương, ho…[4] Rễ cây cà gai leo là nơi tích lũy chủ yếu glycoalkaloid, tuy nhiên chúng

có hàm lượng thấp và phụ thuộc nhiều vào nguồn nguyên liệu tự nhiên [15] Lê Thị Hà Thanh và cs (2009) đã nghiên cứu sản xuất glycoalkaloid từ tế bào cây cà gai leo Kết quả cho thấy, môi trường MS rắn có 30 g/L sucrose, bổ sung thêm 0,1 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D thích hợp nhất để tạo callus Huyền phù tế bào

cà gai leo sinh trưởng tốt nhất trên môi trường MS có 40 g/L sucrose; 1,0 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D, với tốc độ lắc 150 vòng/phút Hàm lượng glycoalkaloid

toàn phần tích lũy cao nhất trong tế bào sau 4 tuần nuôi cấy đạt 48,41 mg/g khối lượng khô, cao gấp 5,9 lần hàm lượng glycoalkaloid trong rễ cây cà gai leo tự nhiên 1 năm tuổi [13] Loc và cs (2010) cũng đã khảo sát sự tích lũy glycoalkaloid trong nuôi cấy callus của cây cà gai leo [88]

Cây rau má (Centella asiatica) là loài dược thảo có chứa asiaticoside và

madecassoside Asiaticoside có hoạt tính chống oxy hóa, chữa bỏng, bảo vệ tế bào thần kinh và sinh tổng hợp collagen [9] Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2008) đã nghiên cứu tạo callus và khảo sát khả năng tích lũy asiaticoside trong callus cây rau má Kết quả cho thấy, môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/L NAA và 2,0 mg/L BAP thích hợp nhất để cảm ứng tạo callus; môi trường có 1,5 mg/L NAA

và 0,5 mg/L kinetin kích thích callus sinh trưởng mạnh Hàm lượng asiaticoside tích lũy cao nhất trong callus là 3,12 mg/g tương đương với 0,31% khối lượng khô [8] Thiết lập nuôi cấy huyền phù tế bào cây rau má và khảo sát sự tích lũy asiaticoside trong tế bào nuôi cấy cũng đã được nghiên cứu Loc và An (2010) nghiên cứu [87]

Cây dừa cạn là một trong những loài cây dược liệu chứa nhiều alkaloid, diển hình là các chất chữa ung thư rất tốt như vincristine và vinblastine Bùi Văn

Lệ và Nguyễn Ngọc Hồng (2006) đã nghiên cứu sinh trưởng và tích lũy alkaloid toàn phần của tế bào cây dừa cạn Kết quả cho thấy, trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L NAA và 0,5 mg/L Kin, sinh khối tế bào và alkaloid toàn phần đạt cao nhất; nồng độ sucrose 60 g/L tối ưu cho sự tích lũy alkaloid toàn phần Khi kết hợp nồng độ chất ĐHST tối ưu Các tác giả đã thu được lượng vincristin cao trong tế bào khi nuôi cấy trên môi trường có 1 mg/L NAA; 0,5 mg/L Kin và 60 g/L sucrose, trong khí đó lá của cây dừa cạn tự nhiên không tìm thấy loại alkaloid

này [5] Cây đinh lăng (Polyscias fruticosa) là một loài thực vật chứa nhiều

saponin Phạm Thị Tố Liên và Võ Thị Bạch Mai (2007) đã tạo callus từ các mẫu cây con trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L 2,4-D Callus tạo thành sau 14 tuần được chuyển sang nuôi cấy trên môi trường lỏng bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D và 20% nước dừa để thu sinh khối và chiết rút saponin [6]

Như vậy, nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp ở nước ta cũng có được một số kết quả nhất định Tuy nhiên, những nghiên cứu nói trên vẫn còn ở quy mô phòng thí nghiệm Phát triển các kỹ thuật nuôi cấy trong các hệ lên men ở quy mô công nghiệp để sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học vẫn còn là một con đường đầy tiềm năng chưa được khai phá hết của nền công nghệ nuôi cấy tế bào của Việt Nam

1.3 GIỚI THIỆU VỀ CÂY NGHỆ ĐEN

1.3.2 Thành phần hóa học

Nghệ đen là loài cây thảo dược không độc, chứa nhiều các hợp chất hóa học có giá trị dược liệu cao Nhiều nghiên cứu đã công bố về thành phần hóa học của cây nghệ đen Từ năm 1928, Rao và cs đã khảo sát sơ bộ thành phần hóa học tinh dầu từ thân rễ của nghệ đen và tìm thấy các hợp chất như -pinen, camphen, cineol, camphor và borneol bên cạnh các sesquiterpene, tuy nhiên không phân lập

và xác định được một sesquiterpene nào [131] Shiobara và cs (1985) đã tách chiết

từ củ nghệ đen được 3 loại sesquiterpenoid đó là curcumeone, curcumanolide-A, curcumanolide-B [143] Xingyi (1999) đã nghiên cứu cho thấy, tinh dầu nghệ đen

có chứa 37 thành phần khác nhau, trong đó chủ yếu là curzerenone, curcumenol, b-elemene, isocurcumenol [179] Singh và cs (2002) đã khảo sát thành phần tinh dầu của một số loài nghệ của Ấn Độ cho thấy, nó có chứa các thành phần chính như: 1,8 cineol, cymene, α-phellandrene (14,9%) [145] Mau và cs (2003) đã xác định được 36 hợp chất từ nghệ đen gồm 17 terpenes, 13 alcohol, và 6 ketones [100] Garg và cs (2005) đã nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu từ lá cây nghệ đen Ấn Độ Kết quả cho thấy, tinh dầu có chứa 23 hợp chất khác nhau [46] Makabe và cs (2006) đã xác định được hơn 10 loại sesquiterpene từ củ nghệ đen [94] Champakaew và cs (2007) phân tích tinh dầu bay hơi của củ nghệ đen nhận thấy, thành phần chính của tinh dầu bao gồm β-tumerone, 1,8-cineole và 7-zingiberene [28]

Bên cạnh các nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu nghệ đen, các nghiên cứu về thành phần hợp chất màu vàng có trong nghệ đen cũng đã được tiến hành Syu và cs (1998) đã nghiên cứu nhận thấy dịch chiết ethanol của

củ nghệ đen có chứa curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin [152] Paramapojn và Gritsanapan (2007) đã nghiên cứu về thành phần curcuminoid trong củ nghệ đen ở các vùng sinh thái khác nhau của Thái Lan Kết quả cho thấy, hàm lượng curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin lần luợt từ 1,46% đến 5,73% w/w (trung bình 2,73% w/w); từ 3,15% đến 10,98% w/w (trung bình 7,37%) và từ 0,49% đến 2,99% w/w (trung bình 1,40% w/w) [119]

Ở nước ta, khảo sát thành phần hóa học của nghệ đen cũng đang rất được quan tâm Tuy nhiên, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào đánh giá thành phần hóa học của tinh dầu nghệ đen trồng ở các vùng khác nhau Phan Minh Giang và cs (1997) đã công bố thành phần chính trong tinh dầu thân rễ nghệ đen ở Sóc Sơn (Hà Nội) là zurumbon (chiếm 79,08%) [2] Lê Quý Bảo

và cs (2004) đã công bố thành phần tinh dầu trong thân rễ nghệ đen ở Đô Lương (Nghệ An) và Hương Sơn (Hà Tĩnh) [1] Trần Thị Việt Hoa và cs (2007) đã nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu củ nghệ đen trồng ở

Đà Lạt được trích ly theo phương pháp gia nhiệt thông thường và phương pháp gia nhiệt bằng lò vi sóng Kết quả nghiên cứu cũng đã chỉ ra sự khác biệt lớn về thành phần sesquiterpene của nghệ đen ở Việt Nam và các nước khác [3]

Tóm lại, nghệ đen là cây thảo dược có chứa các nhóm chất như tinh dầu bao gồm các chất thuộc sesquiterpene và monosesquiterpene; curcuminoid bao gồm: curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin Ngoài ra, nghệ đen còn chứa các chất như tinh bột, chất dẻo và một số chất có vị đắng khác như tannin và flavonoiod [82]

1.3.3 Công dụng

Ngoài nghệ vàng, loài cây được nghiên cứu liên tục và được xem là loại thảo dược tiềm năng có nhiều hoạt chất sinh học, nghệ đen cũng đang được quan tâm ngày càng nhiều nhờ các hoạt chất mới được xác định từ nó [32]

1.3.3.1 Công dụng cổ truyền

Cây nghệ đen được trồng rộng rãi dùng làm rau hoặc đồ gia vị ở các quốc gia Đông, Nam và Đông Nam Á bao gồm Trung Quốc, Việt Nam, Ấn Độ, Nhật Bản và Thái Lan [137], [58] Từ lâu, nghệ đen đã được con người dùng trong bài thuốc Đông y cổ truyền để chữa bệnh Nghệ đen có trong Dược điển XIII của người Nhật Bản và sử dụng trong thuốc cổ truyền của người Trung Quốc Nghệ đen đã từng được kê trong các đơn thuốc dùng để chữa bệnh dạ dày, điều kinh, điều trị hội chứng “Oketsu” gây ra do tắt ngẽn mạch máu và cải thiện kinh nguyệt trong nhiều dạng thuốc pha chế khác nhau [98], [99], [182] Từ lâu ở Thái Lan, nghệ đen đã được dùng để làm dịu cơn đau dạ dày, chống tiêu chảy, chống nôn mửa và sốt Nó cũng được dùng ngoài da như chất làm se các vết thương [137] Người Ấn Độ đã dùng củ nghệ đen để trị chứng viêm da, bong gân, ung nhọt và vết thương Củ nghệ đen giàu tinh bột, được dùng như là nguồn thay thế cho tinh bột của cây hoàng tinh, lúa mạch và được chú ý dùng làm thực phẩm cho trẻ sơ sinh, người đang dưỡng bệnh Bột màu đỏ gọi là “Abir” làm từ

củ nghệ đen khô xử lý với nước sắc cây tô mộc được dùng trong nghi lễ tôn giáo Hindu Nó cũng được dùng để sản xuất rượi, nhiều loại nước hoa, mỹ phẩm và các loại hương liệu khác [36] Ngoài ra, củ nghệ đen còn được dùng để chữa giun sán ở trẻ em; bột nghệ dùng để chống dị ứng; lá nghệ có tác dụng chữa bệnh phù [108], phong hủi [68]

1.3.3.2 Các hoạt tính sinh học

- Hoạt tính giảm đau

Shin và cs (1994) khảo sát hoạt tính dược lý của 2 sesquiterpene: