Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của polysacarit từ một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hoà

Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của polysacarit từ một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hoà

25 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC Nguyễn Duy Nhất TÊN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA POLYSACARIT TRONG MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU Ở TỈNH KHÁNH HOÀ Chuyên ngành: HOÁ HỮU CƠ Mã số: 62 44 27 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC HÀ NỘI - 2008 26 Công trình được hoàn thành tại:. VIỆN HOÁ HỌC Người hướng dẫn khoa học: . GS.TSKH. TRẦN VĂN SUNG TS. NGUYỄN MẠNH CƯỜNG Phản biện 1: PGS.TS. VĂN NGỌC HƯỚNG Trường ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà Nội Phản biện 2: PGS.TS. LÊ THỊ ANH ĐÀO Trường ĐH Sư phạm Hà Nội Phản biện 3: GS.TS.PHẠM THANH KỲ Trường ĐH Dược Hà Nội Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà nước họp tại: . . VIỆN HOÁ HỌC Vào hồi 9 giờ 00 ngày 03 tháng 06 năm 2008 Có thế tìm hiểu luận án tại thư viện: THƯ VIỆN QUỐC GIA . 1 I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1.1 Tính cấp thiết của luận án: Việt Nam có hơn 3.000 km bờ biển với sự thay đổi môi trường sinh thái rất đa dạng, phong phú. Trong số các tài nguyên sinh vật biển của Việt Nam thì nguồn rong biển, đặc biệt là rong nâu có ý nghĩa rất quan trọng. Theo thống kê chưa đầy đủ thì chỉ riêng chi Sargassum của ngành rong nâu ở nước ta đã có hơn 70 loài với sản lượng ước tính trên 10.000 tấn khô/năm. Trong số các chất polysacarit có hoạt tính sinh học quí từ rong nâu thì fucoidan rất đáng được quan tâm nghiên cứu. Fucoidan là một polysacarit sulfat có cấu tạo gồm mạch chính chứa α-L-fucose sulfat, ngoài ra có thể có D- galactose, D-mannose, D-xylose, L-rhamnose, D-glucose và axít D-uronic. Những nghiên cứu gần đây cho thấy fucoidan có hoạt tính chống đông cục máu, kháng khuẩn, kháng virus (kể cả HIV), chống nghẽn tĩnh mạch, chống ung thư, chống viêm khớp, giảm mỡ máu, ức chế miễm dịch… Fucoidan chiếm khoảng 4-8% trọng lượng rong nâu khô. Theo đó nước ta có thể khai thác 400 đến 800 tấn fucoidan thô mỗi năm. Ngoài ra, trong rong nâu còn có những chất polysacarit khác như alginat, laminaran. Đây cũng là những sản phẩm quý dùng trong ngành chế biến thực phẩm và sản xuất mỹ phẩm. Đẩy mạnh nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của các loài rong biển Việt Nam, trong đó có rong nâu, tìm ra các công nghệ sử dụng, khai thác có hiệu quả chúng là hoàn toàn phù hợp với chiến lược phát triển kinh tế của Đảng và Chính phủ. Đây là vấn đề có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và kinh tế xã hội rất cao, phù hợp với xu hướng phát triển của quốc tế. Từ những lý do nêu trên, để hoàn chỉnh thêm những nghiên cứu về fucoidan, nhằm khai thác nguồn tài nguyên biển dồi dào và để tạo ra những chế phẩm phục vụ chăm sóc sức khoẻ cộng đồng chúng tôi đặt vấn đề thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của polysacarit trong một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hoà” 1.2.Mục tiêu của của luận án là: - Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất polysacarit từ một số loài thuộc ba ngành rong biển là: rong đỏ, rong lục và rong nâu thu tại tỉnh Khánh Hoà. - Nghiên cứu thành phần polysacarit gồm: alginat, laminaran và fucoidan của những loài rong nâu thu tại tỉnh Khánh Hoà có hoạt tính gây độc tế bào ung thư. - Nghiên cứu xác định đặc điểm cấu trúc của phân đoạn fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào từ rong nâu thu ở tỉnh Khánh Hoà. 2 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án: ¾ Tìm ra một số loài rong nâu phổ biến ở tỉnh Khánh Hoà chứa fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào ung thư nhằm định hướng sử dụng làm nguyên liệu điều chế thuốc trị bệnh ung thư. ¾ Tổng hợp các phương pháp chiết tách fucoidan trên thế giới, khảo sát các đặc tính hoá lý của fucoidan từ rong nâu Việt nam cung cấp các số liệu thực nghiệm nhằm định hướng cho việc sản xuất fucoidan ở Việt Nam. ¾ Từ việc nghiên cứu xác định cấu trúc fucoidan, cung cấp những định hướng về phương pháp nghiên cứu cấu trúc fucoidan và định lượng fucoidan từ rong nâu Việt Nam. ¾ Qua nghiên cứu quan hệ cấu trúc hoạt tính gây độc tế bào ung thư của fucoidan, cung cấp thêm cơ sở dữ liệu định hướng cho phương pháp sản xuất fucoidan dùng làm thuốc hỗ trợ điều trị bệnh ung thư từ rong nâu Việt nam. 1.4 Những đóng góp mới của luận án: Luận án là công trình đầu tiên hoàn thành được các nghiên cứu sau: ¾ Đã phát hiện được 6 loài rong nâu phổ biến tại Khánh Hoà có hoạt tính gây độc tế bào ung thư và đã xác định được thành phần hoá học bao gồm các polysacarit (alginat, fucoidan, laminaran) của chúng. ¾ Đã hoàn thành qui trình chiết fucoidan thô và tách một số phân đoạn fucoidan tinh hơn từ 5 loài rong nâu phổ biến ở tỉnh Khánh Hoà. ¾ Đã nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và gây độc tế bào với tế bào ung thư màng tim, ung thư phổi và tế bào ung thư gan của một số loài rong biển phổ biến của Khánh Hoà và một số phân đoạn fucoidan từ chúng. ¾ Đã sử dụng chương trình pascal và thiết bị LC-ESI-MS nhiều lần để nghiên cứu xác định được cấu trúc của phân đoạn fucoidan từ sargassum swartzii và sargassum polycystum. ¾ Xác định được khi fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào thì nhóm sulfat ở vị trí axial (C-4) là chủ yếu và trong mạch có chứa đơn vị cấu trúc hexose-axít glucuronic . 1.5 Bố cục của luận án: Luận án dày 142 trang với 19 bảng số liệu, 37 hình vẽ và 138 tài liệu tham khảo được kết cấu như sau: Danh mục các từ viết tắt, danh mục bảng và hình vẽ: 8 trang. Đặt vấn đề: 2 trang. Tổng quan (chương I): 40 trang. Đối tượng nghiên cứu và thực nghiệm (chương II): 23 trang. Kết quả và thảo luận (chương III): 56 trang. Danh mục các công trình đã công bố của tác giả có liên quan đến luận án: 1 trang. Tài liệu tham khảo: 12 trang. Ngoài ra luận án còn có phần phụ lục gồm 80 trang. 3 II. NỘI DUNG LUẬN ÁN Chương I: TỔNG QUAN Trên cơ sở nghiên cứu tài liệu tham khảo phần tổng quan trình bày các vấn đề sau: - Giới thiệu chung về rong biển, thành phần hoá học, phân bố, sản lượng của rong biển trên thế giới. - Các cấu trúc của fucoidan đã được nghiên cứu. - Các nghiên cứu hoạt tính sinh học của fucoidan. - Các phương pháp chiết và sản xuất fucoidan trên thế giới. - Các phương pháp xác định thành phần hoá học của rong nâu và xác định cấu trúc của fucoidan đã được công bố. - Nhận xét chung về các phương pháp nghiên cứu cấu trúc fucoidan đã công bố, các khó khăn khi ứng dụng các phương pháp này vào nghiên cứu cấu trúc fucoidan từ rong nâu Việt nam, đề xuất giải pháp nghiên cứu cấu trúc fucoidan từ rong nâu Việt nam. Chương II: ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM. 2.1 Đối tượng nghiên cứu: Rong nâu gồm các loài phổ biến tại tỉnh Khánh Hoà, các loài rong khác ở Khánh Hoà và các vùng lân cận . Bảng 2.1 Tên loài rong và ký hiệu mẫu trong các thực nghiệm: Loài rong Ký hiệu polysacarit sulfat trong khảo sát hoạt tính Ký hiệu fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào ung thư Sargassum polycystum FA1 FC03 Sargassum mcclurei FA2 FC01 Sargassum olygocystum FA3 FC04 Sargassum xuanmaii FA4 Sargassum ilicifolium FA5 Sargassum swartzii FA6 FC02 Sargassum denticarpum FA7 FC05 Sargassum emarginatum W2 Turbinaria ornata G1 Kappaphycus alvarezii G2 Gracilaria bailiniae G3 Ulva reticulata G4 Eucheuma spp G5 Ulva frenestrata G6 Gracilaria tenuistipitata G7 Gracilaria asiatica G8 4 2.2 Phương pháp nghiên cứu: Chiết và tách phân đoạn các polysacarit: Chiết các polysacarit : Dựa vào các phương pháp chính để chiết polysacarit sulfat đã được công bố, chúng tôi tiến hành chiết theo phương pháp sử dụng dung dịch axít loãng, kết tủa fucoidan từ dịch chiết bằng dung dịch Cetavlon 10% trong nước. Kết tủa được ly tâm, rửa với nước để tách laminaran và mannitol. Dịch sau khi tủa fucoidan được cho chạy qua cột IRA-480, fucoidan còn sót lại sẽ được hấp phụ lên cột, nước qua cột được kết tủa laminaran bằng cách thêm vào 8 lần thể tích EtOH, dùng hệ thống màng siêu lọc (MWCO) ta xác định được trọng lượng phân tử trung bình của laminaran tách chiết theo phương pháp này nhỏ hơn 10kDa. Với loài S. polycystum ta thu được mẫu laminaran ký hiệu là 50down. Laminaran từ loài S. swartzii ký hiệu là 50up, từ loài S. mcclurei ký hiệu là Revf. Kết tủa cetavlon-fucoidan được cho vào dung dịch CaCl 2 3M, NaCl 3M và đun nóng 60 0 C khuấy liên tục trong 2 h, để yên qua đêm. Kết tủa Cetavlon-fucoidan bị phá huỷ giải phóng ra fucoidan tan trong dung dịch, đồng thời canxi alginat được tách ra dưới dạng kết tủa nếu có lẫn axít alginic. Ly tâm để thu dịch có chứa fucoidan. Hai lần thể tích EtOH so với thể tích dịch lọc được đưa vào và khuấy trộn trong 30 phút. Để yên qua đêm, kết tủa fucoidan được tạo thành. Gạn lọc thu kết tủa và tiếp tục rửa bằng EtOH 80% (v/v) đến khi không còn ion Cl - trong nước rửa, hút chân không đến khan nước và sấy kết tủa ở 45 0 C, áp suất -1 bar trong 18 giờ ta thu được các fucoidan có trọng lượng phân tử khác nhau, 9 fucoidan thô từ 9 mẫu rong nâu có ký hiệu là A1 đến A7, W2 và G1, 7 polysacarit sulfat từ 5 loài rong đỏ và 2 loài rong lục được ký hiệu là G2 đến G8. Hiệu suất chiết trung bình của fucoidan khoảng 40g /kg rong khô đối với rong khô. Tách phân đoạn fucoidan: 5g fucoidan thô chiết từ rong nâu Sargassum swartzii được hoà tan vào 1lít nước. Vừa khuấy vừa thêm cetavlon (cetyltrimetylammoniumbromid) 10% vào đến khi không còn tủa tạo thành (khoảng 60-80ml). Khuấy tiếp tục qua đêm. Kết tủa được ly tâm lấy ra. Hoà tan tủa trong 600ml NaCl 0.5M khuấy đều qua đêm, tủa được tách riêng, Hai lần thể tích EtOH so với thể tích dịch lọc được đưa vào dịch lọc và khuấy trộn trong 30 phút. Để yên qua đêm, kết tủa fucoidan được tạo thành. Gạn lọc thu kết tủa và tiếp tục rửa bằng EtOH 80% (v/v) đến khi không còn ion Cl - trong nước rửa, sau đó tiếp tục rửa kết tủa bằng aceton và sấy kết tủa ở 45 0 C, áp suất -1 bar trong 30 phút ta thu được phân đoạn F05. Tương tự như vậy với dung dịch 1, 1.5, 2, 2.5M NaCl thu được phân đoạn F10, F15, F20, F25. Fucoidan từ Sargassum polycystum được giải phóng trên kết tủa với cetavlon bằng các dung dịch NaCl 1M và 2M thu được hai phân đoạn PF10 và PF20. 5 FUCOIDAN + CETAVLON (dung dịch) (dung dịch) Dung dịch cetavlon dư FUCOIDAN-CETAVLON (k ết tủa ) Dung dịch NaCl 0.5M khuấy 24 giờ, ly tâm Dung dịch 05 FUCOIDAN-CETAVLON (kết tủa 1) Dung dịch 10 FUCOIDAN-CETAVLON (kết tủa 2) Dung dịch NaCl 1M khuấy 24 giờ, ly tâm Dung dịch 15 FUCOIDAN-CETAVLON (kết tủa 3) Dung dịch NaCl 1.5M khuấy 24 giờ, ly tâm Dun g dÞch 20 FUCOIDAN-CETAVLON (kết tủa 4) Dung dịch NaCl 2M khuấy 24 giờ, ly tâm Dung dịch 25 FUCOIDAN-CETAVLON (kết tủa 5) Dung dịch NaCl 2.5M khuấy 24 giờ, ly tâm Thêm 2 lần thể tích EtOH, ly tâm, rửa kết tủa với EtOH 80%(v/v) cho đến F05 h ếtionCl - ,lytâm,r ửath êm 1 l ầnv ơiaceton,s ấy chân không ở 45 0 C. F10 F15 F20 F25 (Nếu kết tủa còn thì tiếp tục rửa giải bằng dung dịch NaCl có nồng độ cao hơn) Hình 2.2.1: Sơ đồ tách phân đoạn fucoidan trên kết tủa cetavlon 6 Sàng lọc hoạt tính: Đánh giá hoạt tính kháng sinh (Antimicrobial assay) Để tiến hành sàng lọc các chất có hoạt tính kháng sinh, chúng tôi đã tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các mẫu polysacarit trên phiến vi lượng 96 giếng theo phương pháp của Vanden Berghe và Vlietlinck. Mẫu thô có MIC ≤ 200μg/ml, mẫu tinh có MIC ≤ 50μg/ml là có hoạt tính. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity activity assay) Chất có hoạt tính thì giá trị IC 50 ≤20μg/ml đối với chế phẩm thô và ≤4 μg/ml đối với chế phẩm tinh. Xác định thành phần hoá học: Xác định độ ẩm, hàm lượng protein thô, chất béo thô theo AOAC. Chiết polysacarit từ rong nâu để xác định thành phần trong rong: Thành phần các polysacarit của rong nâu được xác định theo các phương pháp của A. I. Usov và Tatiana N. Zvyagintseva. Bột rong khô được khuấy với dung dịch HCl 0.2M ở 70 0 C trong 1giờ (tỉ lệ rong:dung dịch axít=1:200 w/v), ly tâm tách bã rong và chiết lại thêm một lần nữa điều kiện như lần trước. Ly tâm tách dịch lọc trộn chung với lần chiết trước, thẩm tách với nước cất bằng MWCO 1kDa. Dung dịch này dùng phân tích thành phần fucoidan và laminaran (ddA). Bã rong còn lại nấu với dung dịch Na 2 CO 3 3M cũng với tỉ lệ nước : rong như trên, đun ở 70 0 C 1giờ dung dịch thu được dùng xác định hàm lượng alginat (ddB). Xác định hàm lượng fucoidan bằng phương pháp so màu: Đưa vào 1ml dung dịch sau khi thuỷ phân với H 2 SO 4 0.5M ở 95 0 C trong 2.5 giờ có chứa ít nhất 50μg methylpentose được đựng trong ống thử (16x150mm) đã làm lạnh với nước đá 4,5ml hỗn hợp 1 thể tích nước và 6 thể tích axít sulfuric đậm đặc. Hỗn hợp sau đó được làm ấm lên 20-22 o C trong vài phút, giữ 3phút trong nước đang sôi, cuối cùng được làm lạnh bằng nước máy. Đưa vào dung dịch để nguội 0.1ml dung dịch cystein hydrochloride (3% w/w trong nước), lắc đều. Một màu vàng xanh nhạt xuất hiện và bền vững trong 24h. Hiệu số hấp thụ E 3960 -E 4300 tỉ lệ với nồng độ methylpentose trong dịch đo, nồng độ methylpentose được tính theo chuẩn là dung dịch fucose. Hàm lượng fucoidan trong mẫu rong bằng tỉ số hàm lượng fucose trong mẫu rong chia cho hàm lượng fucose trong fucoidan chuẩn. % fucose trong dịch chiết (w/w) % fucoidan trong dịch chiết (w/w)= % fucose trong fucoidan chuẩn (w/w) (fucoidan chuẩn được chuẩn bị ở phần chiết và phân đoạn polysacarit) Xác định hàm lượng laminaran. Tách laminaran ra khỏi dung dịch chứa polysacarit ion âm: Dung dịch A chứa laminaran polyuronan và fucoidan được đưa qua cột polyteflon. Laminaran bị giữ lại trên cột, rửa nước qua cột đến khi hết tạo kết tủa 7 với cetavlon. Dung dịch EtOH 15-20% được dùng để giải hấp laminaran, dung dich rửa giải đươc thêm 8 lần thể tích EtOH để kết tủa laminaran. Ly tâm loại EtOH, sau đó acetone được đưa vào rửa tiếp hai lần nữa, kết tủa được sấy khô trong chân không, đây chính là lượng laminaran có trong dung dịch A Xác định hàm lượng alginat: Dung dịch B, polyuronat được tách khỏi dung dịch hỗn hợp polysacarite của rong nâu bằng kết tủa với axít acetic, tỉ lệ dung dịch: acid =50:30. Tủa keo axít alginic được ly tâm lấy ra, rửa bằng axít acetic40%, trung hoà bằng NaOH 1M, sau đó kết tủa alginat bằng 2 lần thể tích ethanol so với dung dịch alginat hoà tan, rửa kết tủa bằng ethanol 80%, tiếp theo aceton, sấy chân không ta thu được natri alginat . Xác định hàm lượng polyphenol trong rong biển: 6-10g bột rong được chiết với 250ml EtOH 80%(v/v) trong Soxhlet 32 giờ. Hàm lượng polyphenol tổng được xác định bằng phương pháp so màu với thuốc thử Folin-Ciocalteau. 1ml dịch chiết, 2.5ml thuốc thử Folin-Ciocalteau được thêm vào trong ống 50ml. Sau khi khuấy và để yên 3 phút; 7.5ml dung dịch Na 2 CO 3 20% được đưa thêm vào. Sau khi lắc mạnh và để yên hai giờ ở nhiệt độ phòng, đo độ hấp thụ của dung dịch màu xanh trong cuvét có độ dày 0,5 cm tại bước sóng 765nm, đối chứng với mẫu trắng trên máy quang phổ UV-VIS. Hàm lượng các hợp chất polyphenol được tính theo tanic axít. Phân tích thành phần đường của fucoidan: a. Mẫu fucoidan khô (0.2 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn, thêm vào 0.02mg inositol, 0.3 ml TFA 2M, thuỷ phân trong 2h ở 120 o C. Cho bay hơi đến khô trong dòng khí ở nhiệt độ 40 o C rồi thêm 0.5 ml MeOH cho bay hơi, lặp lại hai lần. b. Cho vào trong ống nghiệm, có chứa sản phẩm fucoidan đã thuỷ phân, 0.3ml NaBH 4 0.25M vừa pha xong trong NH 4 OH 1M rồi để yên 30 phút ở 20 o C. Thêm vào hỗn hợp phản ứng 0.5ml axít axetic 10% trong metanol, cho bay hơi đến khô, lặp lại lần nữa. Cho vào ống nghiệm 0.5 ml MeOH, bay hơi đến khô, lặp lại hai lần. c. Axetyl hoá các đường bằng 0.2ml dung dịch Ac 2 O:pyridin = 1:1(v/v) ở 100 o C trong 20 phút. Cho bay hơi hỗn hợp phản ứng, thêm vào 0.5ml toluen, cho bay hơi đến khô, lặp lại hai lần. Chiết sản phẩm đã axetyl hoá bằng axetat etyl. Xác định thành phần đường bằng sắc ký khí trên máy GC-17A Shimadzu, với các đường chuẩn Fuc, Rha, Xyl, Man, Glc, Gal được xử lý tương tự như xỷ lý mẫu. Xác định dạng của axít uronic. a. Mẫu fucoidan khô (0.2 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn, thêm vào 0.02 mg inositol, 0.3 ml TFA 2M, thuỷ phân trong 2h ở 120 o C. Cho bay hơi đến khô trong dòng khí ở nhiệt độ 40 o C rồi thêm 0.5 ml MeOH, cho bay hơi, lặp lại hai lần. b. Cho vào ống nghiệm có chứa sản phẩm fucoidan đã thuỷ phân, 0.3ml NaBH 4 0.25M vừa pha xong trong NH 4 OH 1M rồi để yên 30 phút ở 20 o C. Thêm vào hỗn hợp phản ứng 0.5ml axít axetic 10% trong metanol cho bay hơi đến khô, lặp lại lần nữa. Cho vào ống nghiệm 0.5 ml MeOH, bay hơi đến khô, lặp lại hai lần. 8 URONIC AXIT +C¸C ALDOSE ALDONIC AXIT +C¸C ALDITOL ALDONIC AXIT +NHùA ALDONIC AXIT +HCl ALDONOLACTON NHùA ANIONIT HCl NHùA HCl C¸C ALDITOL ALDITOL1 NaBH 4 NaBH 4 C¸C ALDITOL ACETAT ACETYL HO¸ ACETYL HO¸ ALDITOL1 ACETAT fucoidan H + Hình 2.2.2: Sơ đồ xác định dạng của axít uronic c. Sản phẩm khô trong ống nghiệm được hoà tan bằng 3ml nước cất, dung dịch đó được đưa vào cốc có chứa sẵn khoảng 0.3g nhựa trao đổi ion dạng acetat, khuấy đều trong một giờ, tách lấy phần dịch, lặp lại một lần nữa với khoảng 0.2g nhựa mới. Nhựa của hai lần khuấy gom lại, rửa với nước cất khoảng 5 lần khối lượng nhựa. d. Lacton hoá axít aldonic.Nhựa đã hấp thụ axít aldonic được rửa giải với 2ml HCl 1N khuấy 30 phút ở nhiệt độ phòng, nhựa đã giải hấp được lọc bỏ bằng giấy lọc Whatman GFA. Dịch lọc được cho bay hơi đến khô ở 40 0 C trong dòng khi đã được lọc sạch. Giai đoạn bay hơi dung dịch HCl 1N này đã chuyển hoá axít aldonic thành aldonolacton. Phần khô trong ống nghiệm được tiếp tục sấy khô trong chân không khoảng12 giờ có mặt KOH để loại bỏ hoàn toàn HCl. e. Aldonolacton được hoà tan bằng vài giọt natri borat 10mM, pH=7.5 và 10mg NaBH 4 trong 0.5ml đệm borat. Phản ứng khử mở vòng lacton diễn ra trong 1giờ ở nhiệt độ phòng. NaBH 4 được loại bỏ bằng cách cho bay hơi với axít acetic băng đến khô, sau đó thêm 1ml axít axetic 10% trong metanol cho bay hơi đến khô, lặp lại lần nữa. Cho vào ống nghiệm 0.5 ml MeOH, bay hơi đến khô, lặp lại hai lần. f. Acetyl hoá giống như trong phần phân tích thành phần đường. Xác định thành phần acetat alditol bằng sắc ký khí trên máy GC-17A Shimadzu FID với cột không phân cực. Chế độ nhiệt: 160 0 C, giữ 2 phút. Tăng đến 280 0 C, 10 0 C/phút, giữ 20 phút để rửa cột. Các pic đường sẽ ra hết sau khoảng 7 [...]... cho thấy polysacarit sulfat của cả 3 ngành rong đều có hoạt tính gây độc tế bào và kháng vi sinh vật kiểm định Điều này phù hợp với các nghiên cứu đã được cơng bố về hoạt tính sinh học của rong đỏ và rong lục Bảng 3.2.2: kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng sinh các polysacarit sulfat Ký hiệu mẫu Vi khuẩn Gr(-) Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC:μg/ml) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc E.coli Số tt P.aeruginosa B.subtilis... tách từ fucoidan của lồi rong Sargassum swartzii (Dựa theo nồng độ dung dịch NaCl giải hấp fucoidan trên kết tủa với cetavlon tăng dần) Các phân đoạn tách từ fucoidan của lồi rong Sargassum polycystum Lồi rong tương ứng dùng chiết laminaran S polycystum S swartzii S mcclurei 3.2 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA POLYSACARIT SULFAT TỪ MỘT SỐ LỒI RONG Qua kết quả từ bảng 3.2.1 đã xác định được 10 lồi rong chứa polysacarit. .. luận rút ra từ luận án: 1- Đã sàng lọc các polysacarit chiết từ 9 lồi rong nâu, 5 lồi rong đỏ, 2 lồi rong lục thu ở tỉnh Khánh Hồ và 7 phân đoạn fucoidan, 3 laminaran kết quả cho thấy có 5 lồi rong nâu (S polycystum, S mcclurei, S oligocystum, S swartzii, S denticaprum và Turbinaria ornata), 3 lồi rong đỏ (Gra bailinea, G tenuispitata và G asiatica) và 1 lồi rong lục (Ulva fenestrata) có hoạt tính gây... fucoidan có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn các polysacarit thơ Các phân đoạn F20, F25 ức chế B.subtilis, S.aureus và E.coli tương ứng mạnh hơn các fucoidan và các phân đoạn khác, F05 ức chế B.subtilis và S.aureus, F15 chỉ ức chế S.aureus và F10 khơng có hoạt tính nào 3- Đã xác định được thành phần hố học chính của 6 lồi rong nâu chứa fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào ung thư , thành phần gồm: protein... Đã xác định đặc tính cấu trúc của 5 fucoidan chiết từ 5 lồi rong nâu: S mcclurei, S swartzii, S polycystum, S oligocystum, S denticarpum và 5 phân đoạn fucoidan tách từ fucoidan tổng số của S swartzii, 2 phân đoạn tách từ fucoidan tổng số của S polycystum Tồn bộ các fucoidan từ 5 lồi rong nâu đã khảo sát đều có thành phần đường bao gồm Fuc, Rha, Gal, Glc, Man và GlcA, liên kết đường trong mạch chủ yếu... 0,49 0,12 3.4 ĐẶC TÍNH CẤU TRÚC CỦA 5 FUCOIDAN CĨ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO VÀ CỦA 7 PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN TÁCH TỪ 2 TRONG 5 FUCOIDAN Khảo sát trọng lượng phân tử các fucoidan và một số phân đoạn tách ra từ chúng, kết quả (bảng 3.4.1) cho thấy cùng phương pháp chiết bằng dung dịch axít lỗng, các giá trị trọng lượng phân tử khác nhau ở fucoidan của các lồi rong khác nhau gần như chỉ là sai số của phương pháp... 3.3 THÀNH PHẦN HỐ HỌC CHÍNH CỦA 6 LỒI RONG NÂU CHỨA FUCOIDAN CĨ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ: Kết quả phân tích hàm lượng các chất chính của 6 lồi rong nâu được đưa ra trong bảng 3.2.3 Bảng 3.2.3 cho thấy đối với 6 lồi sargassum đang khảo sát, hàm lượng alginic axit dao động từ 11 đến 20%, fucoidan từ 2.9 đến 4%, laminaran từ 3.6 đến 5% so với trọng lượng khơ Với hàm lượng tổng các polysacarit từ. .. có mặt ở cả 2 vị trí equtorial và axial 5- Đã xác định cấu trúc của fucoidan phân đoạn PF20 chiết từ rong nâu sargassum polycystum và phân đoạn F20 chiết từ sargassum swartzii Sơ bộ nhận xét mối liên quan giữa hoạt tính gây độc tế bào ung thư và cấu trúc của fucoidan là: Phân đoạn fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào ung thư thì trong phân tử có đơn vị cấu trúc hex-uro và nhóm sulfat có mặt ở vị trí... Nghiên cứu tách chiết fucoidan từ rong nâu Khánh Hồ làm dược liệu phòng và trị các chứng bệnh nan y Báo cáo hội thảo “Khoa học cơng nghệ với sự phát triển kinh tế-xã hội của tỉnh Khánh Hồ” Khối các viện trung ương Tháng 11-2005 Trang 109-112 5) Nguyễn Duy Nhứt, Trần Thị Thanh Vân, Bùi Minh Lý, Thành Thị Thu Thuỷ, Nguyễn Mạnh Cường, Trần Văn Sung Nghiên cứu cấu trúc một phân đoạn fucoidan chiết từ rong. .. KIẾN NGHỊ Cần có thêm các chương trình, dự án nghiên cứu sâu rộng về fucoidan từ nguồn rong biển của Việt nam và hướng sử dụng fucoidan trong các ngành y sinh học và cơng nghiệp 24 Các cơng trình liên quan đến luận án: 1) Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Nguyễn Mạnh Cường, Trần Văn Sung Phân lập và đặc điểm của fucoidan từ 5 lồi rong mơ miền trung Tạp chí hố học số 3, tập 45(2007) trang 399-343 2) Nguyễn . “ Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của polysacarit trong một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hoà 1.2.Mục tiêu của của luận án là: - Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào, hoạt. hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất polysacarit từ một số loài thuộc ba ngành rong biển là: rong đỏ, rong lục và rong nâu thu tại tỉnh Khánh Hoà. - Nghiên cứu thành phần polysacarit. VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC Nguyễn Duy Nhất TÊN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA POLYSACARIT TRONG MỘT SỐ