Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh Nha Trang

1 I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN I.1. Đặt vấn đề Fucoidan là một sulfate polysacarit chỉ có trong thành phần của ngành rong nâu mà không có trong thành phần của các loài thực vật hay động vật khác. Fucoidan có cấu trúc hóa học phức tạp bởi tính đa dạng của liên kết glycoside và khả năng phân nhánh với các vị trí nhóm sulfate được sắp xếp không theo quy luật trên mạch polymer. Thành phần chính của fucoidan là fucose và sulfate, ngoài ra chúng còn có thêm các gốc đường khác như galactose, glucose, manose, xylose,…và đôi khi là cả gốc acetyl. Nhờ sự đa dạng về cấu trúc mà fucoidan sở hữu nhiều hoạt tinh sinh học quý như kháng đông tụ máu, kháng ung thư, kháng viêm, kháng virút, chống oxi hóa,… với tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các lĩnh vực mỹ phẩm, thực phẩm chức năng và dược phẩm. Mặc dù có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc chi tiết của fucoidan, nhưng các kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của chúng về trật tự liên kết giữa các gốc đường, sự phân nhánh và vị trí các gốc sulfate vẫn còn rất hạn chế. Mặt khác, mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ. Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của fucoidan lên các tế bào sinh vật và tiến tới sử dụng fucoidan để làm dược liệu thì việc xác định chính xác thành phần và cấu trúc hóa học của fucoidan là điều tiên quyết và đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Ở nước ta hiện tại đã có khoảng 147 loài rong nâu được phân loại, trong đó các loài rong thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất với hơn 60 loài và sản lượng ước tính đạt tới 10.000 tấn rong khô/năm. Tuy nhiên cho đến nay ở nước ta vẫn chưa có một công trình nghiên cứu có tính hệ thống về thành phần hóa học, cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ rong nâu Việt Nam. Do vậy, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh Nha Trang” nhằm hoàn chỉnh thêm những nghiên cứu về fucoidan của rong nâu Việt Nam theo định hướng tìm kiếm những nguồn dược liệu mới phục vụ sức khỏe cộng đồng và phát triển kinh tế xã hội. I.2. Mục tiêu của luận án Nghiên cứu chiết tách và phân đoạn fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam. Phân tích thành phần, xác định đặc điểm cấu trúc và mối quan hệ giữa cấu trúc với hoạt tính sinh học của fucoidan. 2 I.3. Những đóng góp mới của luận án 1/ Việc khử trùng ngưng được thực hiện bằng phương pháp tự thủy phân (autohydrolysis) sử dụng chính các nhóm (-SO 3 H) của phân tử fucoidan làm nguồn axít để chuyển hóa fucoidan polysacarit về dạng fucoidan oligosacarit dưới điều kiện rất nhẹ nhàng, nên hạn chế tối đa quá trình bẻ ngắn mạch quá mức về dạng các monomer không mong muốn. Nhờ vậy đã thu được các sản phẩm fucoidan oligosacarit phù hợp cho phân tích khối phổ. 2/ Lần đầu tiên tại Việt Nam đã kết hợp cả 02 kỹ thuật phân tích khối phổ nhiều lần MALDI-TOF/MS/MS và ESI-MS/MS trong phân tích cấu trúc của polysacarit. Việc kết hợp này giúp chúng ta nhận được đầy đủ hơn các thông tin về cơ chế phân mảnh các ion carbohydrate trong phổ khối, nhờ vậy đã cho phép giải được một cách tường minh cấu trúc phức tạp của fucoidan có nguồn ngốc từ rong nâu Việt Nam 3/ Lần đầu tiên cấu trúc của phân đoạn fucoidan SmF3 có hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ rong S. mcclurei đã được thiết lập. Mạch chính của fucoidan SmF3 gồm →3)-Fucp(4,2SO 3 - )-(1→3)-Fucp(4,2SO 3 - )-(1→ họa tiết xen vào các gốc (1→4)-Fucp(3SO 3 - ) và (→6)-Galp ở cuối đầu khử. 4/ Tất cả các phân đoạn fucoidan từ Sargassum mcclurei ít gây độc tế bào và ức chế sự hình thành các tế bào ung thư kết tràng DLD-1, chính vì vậy chúng là các tác nhân kháng ung thư tiềm năng I.4. Bố cục của luận án Luận án gồm 113 trang: Mở đầu (02 trang), Nội dung chính gồm 98 trang được chia làm 03 chương gồm: Chương 1. Tổng quan (33 trang), Chương 2. Đối tương, phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm (11 trang), Chương 3. Kết quả và thảo luận (52 trang), Kết luận và kiến nghị (2 trang), Danh mục các công trình công bố có liên quan đến luận án (01 trang), 143 tài liệu tham khảo (12 trang). II. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần mở đầu đề cập tính thực tiễn, ý nghĩa khoa học, đối tượng nghiên cứu, mục tiêu và nhiệm vụ của luận án. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Giới thiệu sơ lược về phân bố và phân loại rong nâu trên thế giới và ở Việt Nam Giới thiệu về fucoidan, tình hình nghiên cứu cấu trúc, hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan từ rong nâu trên thế giới và ở Việt Nam. Các phương pháp chiết tách và phân tích cấu trúc của fucoidan. 3 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng được lựa chọn nghiên cứu là 08 loài rong nâu phổ biến và có trữ lượng lớn nhất ở vùng biển vịnh Nha Trang bao gồm các loài rong Sargassum denticapum, Sargassum polycystum, Sargassum binderi, Sargassum oligocystum, Sargassum swartzii, Sargassum mcclurei, Turbinaria ornata, Padina australis, các mẫu rong được thu thập, phân loại và định danh bởi chuyên gia phân loài rong biển TS. Lê Như Hậu. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp chiết tách và phân đoạn tinh chế fucoidan từ rong nâu: fucoidan được thu nhận bằng cách chiết rong trong dung môi axit loãng (pH: 2-3), sau đó sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi anion để tách phân đoạn tinh chế fucoidan. 2.2.2. Các phương pháp phân tích thành phần của fucoidan: phương pháp trắc quang, đo độ đục và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 2.2.3. Các phương pháp phân tích cấu trúc của fucoidan: phân tích liên kết bằng methyl hóa, phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR), phổ khối nhiều lần Negative-ion tandem ESI-MS/MS và MAILDI-TOF/MS/MS. 2.2.4. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan: được thực hiện theo phương pháp của Likhitwitaywid và Colburn 2.3. Thực nghiệm 2.3.1. Phương pháp chiết và tách phân đoạn fucoidan từ rong nâu Phương pháp chiết fucoidan: Fucoidan được thu nhận bằng cách chiết rong trong dung môi axit HCl loãng (pH: 2-3) ở 70 o C, trong thời gian 2 giời (chiết lặp lại 3 lần). Dịch chiết được gom lại và cô đặc bằng màng siêu lọc 10kDa, dịch chiết sau đó được kết tủa trong cồn 98% hoặc đông khô để thu bột fucoidan. Phương pháp tách phân đoạn fucoidan: Fucoidan sau khi được phân lập từ rong nâu sẽ được tiến hành tách phân đoạn tinh chế bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose. 2.3.2. Các phương pháp phân tích thành phần của fucoidan Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate: được thực hiện bằng phương pháp so màu với phenol và axit sulfuric đậm đặc, ở λ = 490 nm. Phân tích thành phần đường đơn: được thực hiện bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sau khi fucoidan được thủy phân bằng trifluoroacetic axít. 4 Phân tích hàm lượng sulfate: được thực hiện bằng phương pháp đo độ đục với BaCl 2 /gelatin, ở bước sóng λ = 360 nm Phân tích hàm lượng axít uronic: được thực hiện bằng phương pháp so màu với thuốc thử Carbazol, ở bước sóng λ = 525 nm. 2.3.3. Các phương pháp phân tích cấu trúc fucoidan Phân tích liên kết bằng methyl hóa: fucoidan được methyl hóa bằng methyl iodua trong dung môi dimethylsulfoxide, sau đó tiến hành thủy phân, khử mở vòng và acetyl hóa. Sản phẩm sau khi acetyl hóa được phân tích bằng GC-MS. Thủy phân tạo oligosacarit-fucoidan sử dụng cho phân tích khối phổ: được tiến hành bằng phương pháp tự thủy phân (autohydrolysis). CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU Fucoidan từ 08 loài rong nâu thuộc 3 chi rong Sargassum, Padina và Turbina đã được chiết tách và phân tích hàm lượng (bảng 3.1). Kết quả cho thấy hàm lượng fucoidan dao động từ 0,82 % (Sargassum swartzii) đến 2,57 % (Sargassum polycystum), hàm lượng fucoidan trong hai loài rong Padina australis và Turbina ornata tương ứng là 1,93 % và 1,23 %. Như vậy, ta thấy hàm lượng fucoidan trong các loài rong thuộc các chi khác nhau là khác nhau và trong cùng một chi (Sargassum) cũng không giống nhau. Sự khác nhau về hàm lượng fucoidan trong các loài rong có thể được giải thích là do ảnh hưởng của các yếu tố sinh trưởng của rong như vị trí địa lý, thời gian thu rong và cả phương pháp chiết. Bảng 3.1. Hàm lượng và thành phần monosacarit của fucoidan từ 08 loài rong nâu Việt Nam Thành phần đường đơn của fucoidan (% mol) Stt Loài rong Hàm lượng fucoidan % * Fuc Man Gal Xyl Glc SO 4 2- % w/w ** Axít uronic % w/w ** 1 S.swartzii 0,82 35,8 19,2 32,3 9,9 2,8 20,40 14,28 2 S.oligocystum 1,78 42,3 8,9 38,3 7,1 3,4 22,46 21,54 3 S.denticapum 2,00 40,1 15,9 38,7 5,3 nd 25,69 21,20 4 S.mcclurei 2,37 38,5 4,2 33,1 3,6 20,6 33,15 17,87 5 S.polycystum 2,57 42,4 12,6 23,5 1,3 10,2 25,60 23,74 6 S.binderi 1,13 42,2 10,3 38,0 9,5 nd 21,47 5,35 7 Turbina ornata 1,23 55,8 9,2 24,8 9,0 1,2 25,30 7,50 8 Padina australis 1,93 47,1 2,5 22,3 11,5 16,6 21,90 21,02 * Hàm lượng tính theo khối lượng rong khô đã loại chất béo ** Hàm lượng tính theo khối lượng của fucoidan; nd: không phát hiện thấy 5 3.2. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN Để xác định thành phần hóa học của fucoidan chúng tôi tiến hành thủy phân fucoidan thành các monomer trong môi trường axít. Việc thủy phân hoàn toàn để xác định thành phần các đường đơn của fucoidan trên thực tế rất khó xảy ra, do đó chúng tôi tiến hành xác định theo tỉ lệ mol giữa các gốc đường đã được thủy phân. Sắc ký đồ của các mẫu đường chuẩn được trình bày trên hình 3.1. Kết quả phân tích thành phần monosacarit, hàm lượng sulfate và uronic axít của các mẫu fucoidan được trình bày trên bảng 3.1 Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đường đơn chuẩn Kết quả bảng 3.1 cho thấy fucose chiếm hàm lượng đáng kể từ 35,8-55,8 % trong tất cả các mẫu fucoidan, trong đó cao nhất là fucoidan từ rong Turbina ornata (55,8%) và thấp nhất là fucoidan từ rong S.swartzii (35,8%). Hàm lượng galactose của fucoidan chiết từ các loài rong thuộc chi Sargassum chiếm tỉ lệ gần bằng hàm lượng fucose, ngoại trừ fucoidan từ rong S.polycystum có tỉ lệ fucose:galactose = 2:1. Trong khi đó, các mẫu fucoidan từ hai chi rong khác là Turbina ornata và Padina australis cũng giống như fucoidan của loài rong S.polycystum hàm lượng galactose chiếm gần bằng một nửa so với fucose. Ngoài hai thành phần chính là fucose và galactose, tất cả các mẫu fucoidan của 08 loài rong nghiên cứu đều có chứa các đường đơn khác với hàm lượng nhỏ hơn là mannose (2,5-19,2%), xylose (1,3-11,5%) và glucose (0-20,6%). Hàm lượng các gốc đường này biến đổi theo từng chi rong và từng loài rong, tuy nhiên trong cùng chi rong chúng biến đổi không nhiều. Các kết quả này cũng hoàn toàn phù hợp với các công bố trước đó về sự đa dạng của thành phần hóa học của fucoidan. Bên cạnh thành phần là các gốc 6 đường, trong phân tử của fucoidan còn chứa các gốc sulfate và axít uronic. Hàm lượng sulfate của các mẫu fucoidan khác nhau không nhiều (bảng 3.1), dao động trong khoảng 20,40-33,15%, trong đó lớn nhất là fucoidan của rong S.mcclurei (33,15%) và nhỏ nhất là fucoidan từ rong S.swartzii (20,40%), Do sự phức tạp trong thành phần cũng như cấu trúc, nên việc xác định các đặc trưng cấu trúc của fucoidan là hết sức khó khăn. Phân đoạn tinh chế fucoidan là một bước quan trọng làm đơn giản hóa việc phân tích các đặc trưng cấu của chúng. 3.3. TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN 05 loại fucoidan được phân lập từ các loài rong Sargassum swartzii, Sargassum mcclurei, Sargassum polycystum, Sargassum denticapum và Turbina ornata được chúng tôi lựa chọn để tiến hành phân đoạn và phân tích các đặc trưng cấu trúc của chúng. Vì đây là những loài rong phổ biến, có trữ lượng lớn và có khả năng khai thác ở quy mô công nghiệp. Kết quả phân đoạn tinh chế các mẫu fucoidan bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose (3,2x32 cm) được chỉ ra trên hình 3.2- hình 3.6. Kết quả tách phân đoạn của các mẫu fucoidan cho thấy fucoidan từ các loài rong S.denticapum, S.polycystum và S.mcclurei đều thu được 03 phân đoạn khác nhau. Kết quả này cho thấy fucoidan từ mỗi loài rong này sẽ tồn tại ít nhất 03 kiểu cấu trúc khác nhau. Trong khi đó fucoidan từ hai loài rong Turbinaria ornata và S.swartzii lần lượt thu được 04 và 05 phân đoạn khác nhau, như vậy fucoidan từ hai loài rong này cũng sẽ tồn tại ít nhất là 04 và 05 dạng cấu trúc khác nhau. Tuy nhiên, các phân đoạn tương ứng với mỗi loài rong được rửa giải ra ở các nồng độ muối NaCl khác nhau, như vậy có thể đặc điểm cấu trúc của các phân đoạn tương ứng với mỗi loài rong sẽ không giống nhau. Kết quả phân tích thành phần hóa học của mỗi phân đoạn fucoidan từ 05 loài rong nghiên cứu ở trên (bảng 3.2-3.6) cho thấy thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan giữa các loài rong là khác nhau và trong cùng một loại rong cũng khác nhau. Tuy nhiên, chúng đều có đặc điểm chung là hàm lượng sulfate trong các phân đoạn fucoidan tăng dần theo nồng độ rửa giải của muối NaCl, hàm lượng fucose và galactose tăng tỉ lệ nghịch với hàm lượng của các gốc đường khác, đặc biệt trong phân đoạn SmF3 từ rong S.mcclurei chỉ tồn tại hai gốc đường là fucose và galactose. Như vậy với phần chính là fucose, galactose và sulfate fucoidan từ 05 loài rong trên được xếp vào nhóm các sulfated galactofucan, khác với các sulfate fucan từ rong ôn đới 7 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 100 200 300 400 500 600 700 V, ml A, 490nm 0 0,5 1 1,5 2 NaCl, M 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 100 200 300 400 500 600 700 800 V, ml A, 490nm 0 0,5 1 1,5 2 NaCl, N Bảng 3.2. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong S.denticapum thu được bằng sắc ký trao đổi anion Thành phần monosacarit , mol% Phân đoạn fucoidan Hàm lượng (%) * Tổng carbohydrate (%) * SO 4 2- (%) * Fuc Man Gal Xyl SdF1-0,5М NaCl 17,2 48,04 23,67 38,6 22,1 24,6 14,7 SdF2-1,0М NaCl 45,7 54,12 27,64 48,6 12,8 28,2 10,4 SdF3-1,5М NaCl 15,3 54,09 39,14 51,9 5,8 33,4 8,9 *: tính theo khối lượng của fucoidan Hình 3.3. Tách phân đoạn fucoidan từ rong S.swartzii bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 V, ml DO, 490nm 0 0,5 1 1,5 2 NaCl, M SdF1 SdF2 SdF3 Hình 3.2. Tách phân đoạn fucoidan từ rong S.denticapum bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose Hình 3.4. Tách phân đoạn fucoidan từ rong S.polycystum bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose SpF1 SpF2 SpF3 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 V (ml) A 490nm 0 0,5 1 1,5 2 NaCl, M SmF1 SmF2 SmF3 Hình 3.5. Tách phân đoạn fucoidan từ rong S.mcclurei bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-Macroprep SwF2 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 V, ml DO, 490nm 0 0,5 1 1,5 2 NaCl, M SwF1 SwF3 SwF4 SwF5 SwF2 Hình 3.6. Tách phân đoạn fucoidan từ rong Turbinaria ornata bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose ToF1 ToF2 ToF3 ToF4 8 Bảng 3.3. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong S.swartzii thu được bằng sắc ký trao đổi anion Thành phần monosacarit, mol% Phân đoạn fucoidan theo nồng độ NaCl Hàm lượng (%) SO 4 2- (%) Fuc Man Gal Xyl Rham Glc SwF1-0,5 М 2,0 5,6 nd nd nd nd nd nd SwF2-0,8 М 20,2 14,6 49,5 4,7 29,4 2,7 2,7 3,0 SwF3-1,0 М 33,3 18,4 56,0 3,0 28,9 1,9 1,9 3,2 SwF4-1,2 М 26,2 28,0 55,6 3,6 27,9 2,4 3,3 2,8 SwF5-1,5 М 16,0 42,3 57,1 4,0 27,4 0,9 2,0 2,0 nd: không phát hiện thấy Bảng 3.4: Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong S.polycystum thu được bằng sắc ký trao đổi anion Thành phần monosacarit của fucoidan, % mol Phân đoạn fucoidan theo nồng độ NaCl Hàm lượng (%) Tổng carbohydrate (%) SO 4 2- (%) Fuc Man Gal Xyl Rham Glc SpF1-0,5М 18,3 56,43 20,11 28,0 26,7 12,7 11,3 13,1 8,2 SpF2-1,0М 43,2 59,15 25,67 59,2 6,0 26,6 0,2 8,0 nd SpF3-1,5М 21,0 54,97 33,99 68,6 nd 26,9 4,5 nd nd Bảng 3.5. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong S.mcclurei thu được bằng sắc ký trao đổi anion Thành phần monosacarit, % mol Phân đoạn fucoidan theo nồng độ NaCl Hàm lượng (%) * Tổng carbohydrate (%) * SO 4 2- (%) * Fuc Man Gal Xyl Gluc SmF1-0,8M 8,4 44,65 16,8 27,2 34,0 19,6 6,4 12,8 SmF2-1,2M 18,2 64,59 25,7 44,8 5,4 34,1 5,3 10,4 SmF3-1,6M 10,5 55,62 35,0 58,5 nd 41,5 nd nd Bảng 3.6. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong Turbina ornata thu được bằng sắc ký trao đổi anion Thành phần monosacarit , mol% Phân đoạn fucoidan theo nồng độ NaCl Hàm lượng (%) SO 4 2- (%) Fuc Man Gal Rham ToF1-1,15 М 6,6 23,87 71,9 4,5 23,6 nd ToF2-1,25 М 29,7 43,26 69,6 nd 27,7 2,7 ToF3-1,50 М 10,3 38,75 82,1 2,4 9,4 6,1 ToF4-1,80 М 18,4 32.36 75,6 2,9 18,8 2,7 9 Theo các tài liệu đã công bố, fucoidan rong nâu nói chung và galactofucan sulfate hóa nói riêng sở hữu phổ hoạt tính sinh học rất rộng và đa dạng như hoạt tính kháng ung thư, kháng đông tụ máu, kháng vi rút, Do vậy, trước khi tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các đặc trưng cấu trúc của fucoidan rong nâu Việt Nam nhằm mục đích ứng dụng chúng làm thực phẩm chắc năng và dược liệu. Chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư người. 3.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN 3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của fucoidan Fucoidan từ 06 loài rong S.mcclurei (F-Sm), S.polycystum (F-Sp), S.swartzii (F-Ss), S.denticapum (F-Sd), S.oligocystum (F-So) và Turbinaria ornata (F-To) được chúng tôi lựa chọn thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên 05 dòng ung thư của người là ung thư gan (Hep-G2), ung thư màng tim (RD), ung thư phổi (LU), ung thư ruột kết (DLD-1) và ung thư vú (MDA-MB-231). Thí nghiệm được thực hiện tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Nga và Viện Sinh học và Công nghệ sinh học - Hàn Quốc. Kết quả cho thấy tất cả các mẫu fucoidan thử nghiệm đều cho kết quả dương tính với ít nhất 02 dòng tế bào ung thư, trong đó fucoidan từ rong S.swartzii cho kết quả dương tính trên 04 dòng tế bào ung thư (bảng 3.7 và 3.8). Bảng 3.7. Hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan từ 06 loài rong nâu của Việt Nam Dòng tế bào ung thư của người Fucoidan Hep-G2 RD MDA-MB- 231 LU DLD-1 Kết luận F-Sp + + nd nd nd Dương tính 02 dòng F-Sm + - nd nd + Dương tính 02 dòng F-So + + nd nd nd Dương tính 02 dòng F-Ss + + + + - Dương tính 04 dòng F-Sd + + nd nd - Dương tính 02 dòng F-To + + nd nd nd Dương tính 02 dòng 10 Bảng 3.8. Giá trị IC 50 của các mẫu fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào Giá trị IC 50 (µg/ml) Dòng tế bào Fucoidan Hep- G2 RD LU DLD-1 MDA- MB-231 Kết luận Chứng (+) 0,25 0,1 0,32 0,1 0,2 F-Sp 4,5 7,1 CXĐ CXĐ CXĐ Dương tính 02 dòng F-Sm 2,4 20,0 CXĐ 6,5 CXĐ Dương tính 02 dòng F-So 18,5 10,4 CXĐ CXĐ CXĐ Dương tính 02 dòng F-Ss 3,8 16,7 15,5 CXĐ 5,4 Dương tính 04 dòng F-Sd 8,1 15,4 CXĐ CXĐ CXĐ Dương tính 02 dòng F-To 12,8 10,9 CXĐ CXĐ CXĐ Dương tính 02 dòng 3.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn fucoidan được phân lập từ rong Sargassum swartzii và Sargassum mcclurei Trong số 06 mẫu fucoidan được thử nghiêm hoạt tính gây độc tế bào ở trên, chúng tôi lựa chon các phân đoạn của fucoidan từ S.swartzii và S.mcclurei tiếp tục thử nghiệm với dòng tế bào ung thư vú và ung thư ruột kết. Kết quả cho thấy tất cả các phân đoạn thử nghiệm đều cho kết quả dương tính với các mức độ ức chế khác nhau (hình 3.7 và 3.8). Như vậy có thể thấy hoạt tính sinh học của fucoidan phụ thuộc vào các yếu tố đặc trưng cấu trúc của fucoidan 0 20 40 60 80 100 120 Đối chứng SwF1 SwF2 SwF3 SwF4 SwF5 Nồng độ các phân đoạn fucoidan Sự ức chế phát triển tế bào, % 5 μg/ml 0,5 μg/ml Hình 3.7. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MDA-MB-231 của các phân đoạn fucoidan từ rong Sargassum swartzii [...]... fucoidan là vô cùng khó khăn Do vậy, phân đoạn fucoidan SmF3 từ rong S.mcclurei là phân đoạn có hoạt tính sinh học tốt và có thành phần hóa học đơn gian nhất sẽ được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu chi tiết hơn về cấu trúc hóa học 14 3.6 PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN SmF3 ĐƯỢC CHIẾT TÁCH TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI Theo kết quả ở mục 3.3, phân đoạn SmF3 có thành phần chính là fucose, galactose... này ở trong nước Lần đầu tiên cấu trúc của phân đoạn fucoidan SmF3 có hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ rong Sargassum mcclurei đã được thiết lập Mạch chính của fucoidan SmF3 gồm: →3)-Fucp(4,2SO3-)-(1→3)Fucp(4,2SO3-)-(1→ họa tiết xen vào các gốc (1→4)-Fucp(3SO3-) và (→6)-Galp ở cuối đầu khử KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu phân tích cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của fucoidan từ các loài rong. .. sự có mặt đồng thời của các gốc →3)-α-L-Fucp và gốc →4)-β-D-Galp liên kết luân phiên nhau trong galactofucan từ chi rong Sargassum 3.7 ĐÁNH GIÁ MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN Các nghiên cứu về đặc trưng cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một số loài rong chi Sargassum Việt Nam Bước đầu cho phép đưa ra những nhận xét về mối tương quan giữa hoạt tính. .. Việc phân tích các đặc trưng cấu trúc của các phân đoạn fucoidan có hoạt tính tốt cho phép chúng tôi đưa ra một số nhận định ban đầu về các yếu tố cấu trúc có ảnh hưởng đến hoạt tính kháng u của fucoidan từ một số loài rong thuộc chi Sargassum Việt Nam 6) Bằng phương pháp tự thủy phân (autohydrolysis) sử dụng chính các nhóm (-SO3H) của phân tử fucoidan làm nguồn axít để chuyển hóa polysacarit fucoidan. .. DLD-1 của các phân đoạn fucoidan được chiết tách từ rong Sargassum mcclurei 3.5 ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN 3.5.1 Các đặc trưng cấu trúc thu được từ phổ IR Các phân đoạn SdF3, SwF5, SpF3, SmF3 và ToF2 từ 05 loài rong có hoạt tính sinh học tốt, đồng thời có thành phần đường đơn giản nhất so với các phân đoạn fucoidan còn lại được lựa chọn để phân tích các đặc trưng cấu trúc Kết quả phân. .. cho mục đích phân tích cấu trúc 5) Phân tích các đặc trưng cấu trúc của 05 phân đoạn fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào tốt từ 05 loài rong S.denticapum, S.polycystum, S.swartzii, S.mcclurei và Turbinaria ornata Kết quả chỉ ra rằng: - Cấu trúc mạch chính của 05 phân đoạn fucoidan được tạo thành chủ yếu bởi các gốc 1→3)- α-L-Fucopyranose - Nhóm sulfate gắn chủ yếu ở vị trí C-4 và một phần ở vị trí C-2... fucoidan từ các loài rong nâu khác của Việt Nam nhằm tìm kiế các hợp chất mới có hoạt tính kháng ung thư và các hoạt tính sinh học khác từ đó làm cơ sở cho việc khai thác và sử dụng hiệu quả nguồn tài nguyên rong nâu của Việt Nam - Nghiên cứu chuyển hóa fucoidan bằng con đường xúc tác sinh học (chuyển hóa bằng enzyme) để tạo ra các sản phẩm oligo -fucoidan mới có hoạt tính sinh học đặc hiệu hơn và mạnh... oligosacarit -fucoidan phù hợp cho phân tích khối phổ Đây là một nét mới của luận án 7) Lần đầu tiên tại Việt Nam đã kết hợp 2 kỹ thuật phân tích khối phổ nhiều lần MALDI-TOF/MS/MS và ESI-MS/MS trong phân tích cấu trúc của polysacarit Nhờ vậy đã giúp giải thích được một cách tường minh hơn cấu trúc phức tạp của fucoidan có nguồn gốc từ rong Việt Nam Đây là tính mới của luận án so với các nghiên cứu cùng... quả phân tích phổ hồng ngoại của các phân đoạn fucoidan đều thu được những dải hấp thụ chính ở số sóng từ 12401272cm-1 cho thấy sự có mặt của nhóm sulfate Ngoài ra, các dao động hấp thụ trong vùng số sóng từ 800-845 cm-1 cho biết vị trí của nhóm sulfate trên các gốc đường pyrannose (bảng 3.9) Bảng 3.9 Một số vân phổ đặc trưng trong phổ hồng ngoại của fucoidan được chiết tách từ một số loài rong nâu Việt... 08 loài rong nâu phổ biến nhất ở vịnh Nha Trang gồm: S.oligocystum, S.denticapum, S.swartzii, S.polycystum, S.mcclurei, Padina australis và Turbiaria ornata đã được phân lập 2) Phân tích thành phần hóa học bao gồm thành phần đường, hàm lượng uronic axít và hàm lượng sulfate của 08 mẫu fucoidan Kết quả cho thấy fucoidan của rong nâu Việt Nam thuộc nhóm sulfate galactofucan, trong khi đó fucoidan từ . Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh Nha Trang nhằm hoàn chỉnh thêm những nghiên cứu về fucoidan của rong nâu Việt. của luận án Nghiên cứu chiết tách và phân đoạn fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam. Phân tích thành phần, xác định đặc điểm cấu trúc và mối quan hệ giữa cấu trúc với hoạt tính sinh học. nay ở nước ta vẫn chưa có một công trình nghiên cứu có tính hệ thống về thành phần hóa học, cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ rong nâu Việt Nam. Do vậy, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên