Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh nha trang (full)

VIỆN HÓA HỌC    PHẠM ĐỨC THỊNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN, CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU Ở VỊNH NHA TRANG Chuyên ngành: Hóa p

VIỆN HÓA HỌC   

PHẠM ĐỨC THỊNH

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN, CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN

CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI

RONG NÂU Ở VỊNH NHA TRANG

Chuyên ngành: Hóa phân tích

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu nêu trong luận án là trung thực Những kết luận khoa học của luận án là chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, 2015

Tác giả

Phạm Đức Thịnh

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được rất

nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học thuộc nhiều

lĩnh vực cùng bạn bè và đồng nghiệp

Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS

Bùi Minh Lý và PGS.TS Lê Lan Anh đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt

nhất giúp tôi hoàn thành bản luận án này

Tiếp theo, tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ Nafosted (Đề tài nghiên cứu khoa

học cơ bản, mã số: 104.01.59.09) và Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam (Đề tài hợp

tác quốc tế, mã số: VAST.HTQT.NGA 06/13-14) đã hỗ trợ kinh phí cho việc thực

hiện Luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của các cô

chú, các anh chị em của phòng:

- Phòng Hóa phân tích và Triển khai công nghệ nói riêng cũng như Viện Nghiên

cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang nói chung

- Phòng Hóa phân tích, Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng - Viện Hóa

học Phòng thử nghiệm hoạt tính sinh học - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên

- Phòng Hóa enzym, Phòng cộng hưởng từ hạt nhân và khối phổ- Viện Hóa sinh

Hữu cơ Thái Bình Dương, Viện Hàn lâm Khoa học Nga, Chi nhánh Viễn Đông,

Liên Bang Nga

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hóa học, Phòng Quản lý

Đào tạo sau Đai học - Viện Hóa học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn

thành các học phần của luận án và mọi thủ tục cần thiết

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn

bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn

thành luận án

Hà Nội, ngày 20 tháng 04 năm 2015 Tác giả Luận án

Phạm Đức Thịnh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ viii

DANH MỤC PHỤ LỤC ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

2.3 RONG BIỂN 3

1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển 3

1.1.2 Phân loại và phân bố của rong biển 4

1.1.3 Thành phần hóa học có trong rong biển 5

1.2 FUCOIDAN 6

1.2.1 Giới thiệu chung về fucoidan 6

2.3.1 Thành phần của fucoidan trong rong nâu 7

1.2.3 Đa dạng cấu trúc của fucoidan 9

1.2.4 Các phương pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu 13

1.2.5 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan 15

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA FUCOIDAN 20

1.3.1 Phương pháp phân tích thành phần đường 20

1.3.2 Phương pháp phân tích liên kết 21

1.3.3 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) 22

1.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 23

1.3.5 Phương pháp phổ khối lượng (MS) 26

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN 32

1.4.1 Tình hình nghiên cứu fucoidan trên thế giới .32

1.4.2 Tình hình nghiên cứu fucoidan ở Việt Nam .34

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

VÀ THỰC NGHIỆM 36

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 36

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.2.1 Phương pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan 37

2.2.2 Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate và thành phần đường 38

2.2.3 Phương pháp phân tích hàm lượng sulfate 38

2.2.4 Phương pháp khử sulfate 38

2.2.5 Phương pháp phân tích hàm lượng uronic axít 38

2.2.6 Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa 38

2.2.7 Phương pháp thủy phân tạo oligosacarit 39

2.2.8 Phương pháp phổ hồng ngoại IR 39

2.2.9 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 39

2.2.10 Phương pháp phổ khối lượng MS 39

2.2.11 Phương pháp thử hoạt tính sinh học và xử lý số liệu 39

2.3 THỰC NGHIỆM 40

2.3.1 Chiết tách và phân đoạn tinh chế fucoidan từ rong nâu 40

2.3.2 Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate và thành phần đường 41

2.3.3 Phân tích hàm lượng sulfate 41

2.3.4 Phân tích hàm lượng uronic axít 42

2.3.5 Khử sulfate 42

2.3.6 Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa 42

2.3.7 Thủy phân tạo fucoidan oligosacarit 43

2.3.8 Phổ khối MALDI-TOF/MS và ESI-MS của fucoidan oligosacarit 43

2.3.9 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan 44

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

3.1 CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU 47

3.2 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN 48

3.3 TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN 51

3.4 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN 62

3.4.1 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của fucoidan 62

3.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn fucoidan được phân lập từ rong Sargassum swartzii và Sargassum mcclurei 64

3.5 ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN 69

3.5.1 Các đặc trưng cấu trúc thu được từ phổ IR 69

3.5.2 Các đặc trưng cấu trúc thu được từ phổ NMR 72

3.6 PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN SmF3 ĐƯỢC CHIẾT TÁCH TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI 77

3.7 ĐÁNH GIÁ MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN 97

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 99

MỞ ĐẦU

Trong đa dạng và vô tận của thảm thực vật đại dương, rong nâu là một trong

số các loài thực vật biển có thể tự tái tạo đáng lưu ý nhất mà con người đã phát hiện

ra Rong nâu chứa rất nhiều polysacarit sinh học quí như alginate, laminaran, fucoidan với khả năng ứng dụng hết sức rộng lớn [29,103]

Trong số đó fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu do có nhiều hoạt tính sinh học quý như: hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối, chống virus, chống ung thư và điều biến miễn dịch, chống viêm, giảm lipid máu, chống oxy hóa và các đặc tính chống bổ thể (anticomplementary), chống lại các bệnh về gan, về đường tiết niệu (uropathy renalpathy), tác dụng bảo vệ dạ dày và khả năng điều trị trong phẫu thuật [69,88] Fucoidan là một sulfate polysacarit có cấu trúc hóa học rất phức tạp bởi tính đa dạng của liên kết glycoside và khả năng phân nhánh với các vị trí nhóm sulfate được sắp xếp không theo quy luật trên mạch polymer Thành phần của nó bao gồm nhiều loại đường, chủ yếu là fucose và một

số các gốc đường khác như galactose, glucose, manose, xylose , đôi khi còn có axít uronic[23,36,69,71]

Mặc dù có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc chi tiết của fucoidan, nhưng các kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của chúng về trật tự liên kết giữa các gốc đường, sự phân nhánh và vị trí các gốc sulfate vẫn còn rất hạn chế [23,34,35,36,48] Mặt khác, mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ [88,36,38,48,69] Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của fucoidan lên các

tế bào sinh vật và tiến tới sử dụng fucoidan để làm dược liệu thì việc xác định chính xác thành phần và cấu trúc hóa học của fucoidan là điều tiên quyết và đang thu hút

sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới

Nước ta có hơn 3.200 km bờ biển trải dài từ Bắc xuống Nam, với diện tích mặt nước rộng hơn 1.000.000 km2 được thiên nhiên ban tặng cho nguồn tài nguyên rong nâu rất đa dạng và phong phú, hiện tại đã có khoảng 147 loài rong nâu được

phân loại [1,8], trong đó các loài rong thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất

với hơn 60 loài và sản lượng ước tính đạt tới 10.000 tấn rong khô/năm [58] Tuy nhiên cho đến nay ở nước ta vẫn chưa có một công trình nghiên cứu có tính hệ thống về thành phần hóa học, cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan rong nâu Việt Nam

Do vậy, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh Nha Trang” nhằm hoàn chỉnh thêm những nghiên cứu về fucoidan của rong nâu

Việt Nam theo định hướng tìm kiếm những nguồn dược liệu mới phục vụ sức khỏe cộng đồng và phát triển kinh tế xã hội

Mục tiêu của luận án:

Chiết tách và phân đoạn fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam Phân tích thành phần, xác định đặc điểm cấu trúc và mối quan hệ giữa cấu trúc với hoạt tính sinh học của fucoidan

Để đạt được mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm:

- Thu thập các loài rong nâu có trữ lượng lớn ở vùng biển vịnh Nha Trang

- Tách chiết và phân đoạn fucoidan từ các loài rong thu được

- Phân tích thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của fucoidan

và các phân đoạn của chúng

- Xác định cấu trúc của fucoidan có hoạt tính quan tâm

- Đánh giá mối tương quan giữa hoạt tính sinh học với đặc trưng cấu trúc của fucoidan

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

2.3 RONG BIỂN

1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển

Hàng năm đại dương cung cấp cho trái đất khoảng 200 tỷ tấn rong biển Nhiều nhà khoa học cho rằng trên 90% cacbon trên trái đất được tổng hợp nhờ quang hợp, trong đó 20% có nguồn ngốc từ rong biển [83,97]

Việc tiêu thụ sản phẩm từ rong biển (tảo đa bào ở biển) đã trải qua thời kì lịch sử rất lâu dài Các dấu vết khảo cổ học cho thấy, người Nhật đã dùng rong biển

từ hơn 10.000 năm trước Trong nền văn hoá Trung Quốc cổ đại, rong biển được coi

là đặc sản dùng trong các món ăn của triều đình và chỉ hoàng tộc hay khách của hoàng thân, quốc thích mới được thưởng thức Dù rong biển được coi là món ăn đặc trưng của châu Á, nhưng trên thực tế các quốc gia có bờ biển trên thế giới như Scotland, Ireland, Newzealand, quần đảo nam Thái Bình Dương và các nước Nam

Mỹ ven biển cũng đã sử dụng rong biển từ rất lâu

Rong biển cũng được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác Chúng là nguồn nguyên liệu tự nhiên cho công nghiệp thực phẩm (Cải biển Ulva lactuca, bột rong biển, chất tạo gel E400, E401 Alginate–Agar E406, E407, Carrageenan ), mỹ phẩm (chất tạo kết cấu và hoạt hóa), công nghiệp (Phycocolloids, hydrocolloids tạo

độ sánh, gel hoặc chất ổn định), thức ăn gia súc, nông nghiệp Qua các tài liệu tham khảo trong lịch sử và trong thời gian sử dụng lâu dài, không có nguy cơ gây hại sức khỏe nào được đề cập đến rong biển Vì vậy, rong biển được xếp vào loại thực phẩm chức năng ngày càng được sử dụng rộng rãi trên thế giới

Hiện nay, Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc là những nước tiêu thụ rong biển thực phẩm lớn nhất và nhu cầu của họ là cơ sở của một nghề nuôi trồng thủy sản với sản lượng hằng năm trên toàn thế giới khoảng 6 triệu tấn rong tươi, trị giá lên đến 5 tỉ USD [97] Các nước và lãnh thổ cung cấp rong biển thực phẩm chính là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan Các nước cung cấp chính rong biển cho công nghiệp là Đan Mạch, Pháp, Na Uy, Tây Ban Nha, Mỹ và Nhật

1.1.2 Phân loại và phân bố của rong biển

* Phân loại và phân bố của rong biển trên thế giới

Dựa vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái và màu sắc, rong biển có thể được chia thành 3 ngành rong chính [30]:

1 Ngành rong nâu (Phaeophyta)

2 Ngành rong đỏ (Rhodophyta)

3 Ngành rong lục (Chlorophyta)

Trong số 03 ngành rong trên, rong nâu là ngành rong có trữu lượng lớn nhất

và phân bố đa dạng nhất với hơn 1800 loài đã được phân loại Trên thế giới hiện

nay chỉ riêng các loài rong thuộc họ Sargassaseae, bộ Fucales đã phân loại được

khoảng hơn 400 loài [1, 8]

Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chile, Achentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha Trong đó bộ Fucales, đối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu đại diện là họ

Sargassaceae với hai loài Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng cận

nhiệt đới Sản lượng rong nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên

667.000 tấn khô, với 3 chi chính là Laminaria, Udaria, Ascophyllum Hàn Quốc khoảng 96.000 tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria Nhật Bản khoảng 51.000 tấn Laminaria, Udaria, Cladosiphon, Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile khoảng

27.000 tấn [5]

* Phân loại và phân bố các loài rong nâu ở Việt Nam

Ở Việt Nam đến nay có khoảng 147 loài rong nâu đã được phân loại, trong

đó các loài rong thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất với khoảng 68 loài phân

bố dọc ven biển Việt Nam và sản lượng ước tính trên 10.000 tấn khô/năm [9] Theo

điều tra tới năm 2011 có 39 loài rong nâu thuộc chi Sargassum phân bố ở vùng biển

Khánh Hòa, tập trung nhiều nhất và có trữ lượng lớn nhất là ở vịnh Nha Trang với

21 loài phổ biến và sản lượng ước tính gần 4.800 tấn khô/năm [1]

Rong nâu phân bố phổ biến ở các vùng biển Đà Nẵng (chân đèo Hải Vân, bán đảo Sơn Trà), Quảng Nam (Cù Lao Chàm, Núi Thành), Quảng Ngãi (Bình

Châu, đảo Lý Sơn, Sa Huỳnh), Bình Định (Phù Mỹ, Qui Nhơn), Phú Yên (vịnh Xuân Đài, Cù Mông), Khánh Hòa (vịnh Vân Phong, Hòn Khói, vịnh Nha Trang, vịnh Cam Ranh), Ninh Thuận (huyện Ninh Hải, Ninh Phước) Trong khi đó vùng bờ biển từ Bình Thuận đến Bà Rịa-Vũng Tàu không phát hiện sự có mặt của rong nâu Đoạn bờ biển Tây Nam Bộ thuộc tỉnh Kiên Giang từ Hòn Chông, Hòn Trẹm (xã Bình An) đến thị xã Hà Tiên, Mỹ Đức, giáp biên giới Campuchia là vùng biển có nhiều điều kiện thuận lợi cho rong nâu phát triển [1]

Nhìn một cách tổng quan hai khu vực ở ven biển phía Nam Việt Nam rong nâu phân bố tập trung là vùng ven biển và đảo từ Đà Nẵng đến Vũng Tàu và huyện

Hà Tiên (từ xã Bình An đến Mỹ Đức Hà Tiên) [8]

1.1.3 Thành phần hóa học có trong rong biển

Rong biển có chứa đa dạng các thành phần hoá học, chúng đều là các thành phần rất có giá trị về mặt dinh dưỡng cũng như dược liệu bao gồm: các axít amin, các axít béo nhiều nối đôi, các vitamin và khoáng chất, polyphenol, các hợp chất chứa iốt, laminaran, alginat và fucoidan (bảng 1.1) Trong số các hợp chất polysacarit của rong biển thì fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu do chúng sở hữu rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị (kháng u, kháng đông tụ máu, kháng virus, kháng viêm, chống oxi hóa,…) với tiềm năng ứng dụng rất lớn để làm dược liệu [69, 132] Từ kết quả các số liệu trong bảng 1.1, ta thấy fucoidan chỉ

có trong thành phần của ngành rong nâu mà không có trong thành phần của hai ngành rong đỏ và rong lục [5]

Bảng 1.1: Thành phần hoá học (%) của một số loài rong biển

Ascophyllum

nodosum

Laminaria digitata

Alaria esculenta

Palmaria palmata

Porphyra

sp

Porphyra yezoensis

Ulva

sp

Nước 70-85 73-90 73-86 79-88 86 Nd 78 Tro 15-25 73-90 73-86 15-30 8-16 7,8 13-22 Alginic axít 15-30 20-45 21-42 0 0 0 0

Natri 3-4 0,9-2,2 nd 2,0-2,5 Nd 0,6 3,3 Magie 0,5-0,9 0,5-0,8 nd 0,4-0,5 2,0 nd nd Iod 0,01-0,1 0,3-1,1 0,05 0,01-0,1 0,0005 nd nd

1.2 FUCOIDAN

1.2.1 Giới thiệu chung về fucoidan

Fucoidan là một anion polysacarit sulfate hóa nằm trong thành tế bào của rong nâu, hợp chất này được phân lập và mô tả lần đầu tiên bởi Kylin vào năm 1913 [67], khi đó nó được đặt tên là “fucoidin” theo tên gọi của gốc đường fucose là thành phần chính cấu tạo nên polysacarits này Nhưng theo danh pháp carbohydrate nghiêm ngặt, thuật ngữ này là không chính xác, vì các polysacarit được tạo nên bởi fucose và sulfate được đặt tên là sulfate fucan Các polysacarit như vậy trên thực tế chỉ có mặt trong ngành Da gai, cụ thể là cầu gai và hải sâm [125] Ngược lại, thành phần và cấu trúc của các polysacarit rong nâu phức tạp hơn nhiều Ngoài hai thành phần chính là fucose và sulfate, trong phân tử của fucoidan còn có thể chứa thêm các đường đơn khác như: galactose, xylose, manose, glucuronic axít , đồng thời có thể bị acetyl hóa một phần Cấu trúc hóa học chi tiết của các polyme sinh học phức tạp này trong nhiều trường hợp còn chưa được biết đến Chính vì vậy, tên gọi phổ thông “fucoidan” là thích hợp nhất nhằm dùng cho tất cả các polysacarit sulfate hóa

của rong nâu, nó không liên quan đến thành phần của chúng, nhưng hiển nhiên không được sử dụng cho fucan sulfate hóa có nguồn gốc động vật [125]

Nhờ sự đa dạng về thành phần và cấu trúc mà fucoidan sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị như: kháng đông tụ máu, kháng huyết khối, kháng virut, chống kết dính tế bào, chống tạo mạch (antiangiogenic), kháng viêm, kháng u, kháng bổ thể (anticomplementary), điều biến hệ miễn dịch, v.v [69] Nhờ vậy, fucoidan đã trở thành đối tượng thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới với tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các lĩnh vực như thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ dưỡng và dược liệu Cùng với đó số các công trình nghiên cứu về fucoidan đã tăng vọt trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây (Hình 1.1) [81]

Hình 1.1 Số các công trình công bố có liên quan đến fucoidan từ năm 1980-2010

Thành phần của fucoidan trong rong nâu

Hàm lượng của fucoidan phụ thuộc vào loài rong, địa điểm và thời gian thu hoạch rong Năm 1997, Park và cộng sự đã công bố hàm lượng fucoidan từ 1-20% trọng lượng rong khô và phụ thuộc vào loài rong [100] Trước đó, công bố của Stewart và cộng sự (1961) cho rằng hàm lượng fucoidan của rong nâu không thay đổi nhiều khi thu rong ở các mùa vụ khác nhau [120] Tuy nhiên, sau đó công bố

này đã được hiệu chỉnh lại trong nhiều nghiên cứu, theo các công bố [100,126] hàm

lượng fucoidan phụ thuộc vào vùng địa lý, loài rong và thời điểm thu hoạch Năm

1994, Koo đã công bố hàm lượng fucoidan được phân lập từ các loài rong

L religiosa, U pinnatifida, H fusiforme và S fulvellum lần lượt là 2,7%; 6,7%;

2,5% và 1,6% [66]

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của một số fucoidan [69]

Rong nâu Thành phần hóa học (tỉ lệ mol)

F vesiculosus Fucose/sulfate (1/1,20)

F evanescens Fucose/sulfate/acetate (1/1,23/0,36)

F distichus Fucose/sulfate/acetate (1/1,21/0,08)

F serratus L Fucose/sulfate/acetate (1/1/0,1)

Lessonia vadosa Fucose/sulfate (1/1,12)

Macrocytis pyrifera Fucose/galactose (18/1)

Pelvetia wrightii Fucose/galactose (10/1)

Undaria pinnatifida (Mekabu) Fucose/galactose (1/1,1)

Ascophyllum nodosum Fucose/xylose/GlcA (4,9/1/1,1)

Laminaria angustata Fucose/galactose/sulfate (9/1/9)

Ecklonia kurome Fucose/galactose/mannose/xylose (1/0,67/0,03/0)

Sargassum stenophyllum Fucose/galactose/mannose/xylose (1/0,2/0,02/0,24)

Adenocytis utricularis Fucose/galactose/mannose (1/0,38/0,15)

Hizikia fusiforme Fucose/galactose/mannose/xylose/GlcA

(1/0,72/0,72/0,2/0,25)

Dictyota menstrualis Fucose/xylose/uronic acid/galactose/sulfate

(1/0,8/0,7/0,8/0,4) và (1/0,3/0,4/1,5/1,3)

Spatoglossum schroederi Fucose/xylose/galactose/sulfate (1/0,5/2/2)

Fucoidan là một sulfate polysacarit dị thể với thành phần cấu tạo hết sức

phức tạp Lần đầu tiên thành phần của fucoidan trong dịch chiết nước được xác định

là một polysacarit có chứa L-fucose và D-xylose, trong khi đó D-galactose và

uronic axít được xem là các tạp chất [102] Tuy nhiên, trong cô bố của Percival và

Ross (1950) cho thấy fucoidan trong dịch chiết nước nóng của các loài rong Fucus vesiculosus, Fucus spiralis and Himanthalia lorea có chứa 38% ester sulfate, 56,7%

fucose, 4% galactose, 1,5% xylose, 3% uronic axít và 8% khoáng [103] Tỉ lệ fucose/galactose trong phân tử fucoidan cũng phụ thuộc vào các loài rong [80,92,102] Dillon và cộng sự (1953) đã phân lập được fucoidan từ loài rong

Ascophyllum nodosum có tỉ lệ fucose: galactose là 8:1 [43], trong khi fucoidan được phân lập từ rong Macrocystis pyrifera có tỉ lệ fucose:galactose = 18:1 [69] Ngoài

ra, các thành phần đường khác (như xylose, mannose, ) cũng được xác nhận là hợp

phần của fucoidan [102] Thành phần của fucoidan từ rong F vesiculosus là 44,1%

fucose, 26,3% sulfate, 31,1% tro và một lượng nhỏ amino-glucose [69,103] Như vậy, thành phần của fucoidan phụ thuộc vào các loài rong (bảng 1.2) [69,81] Ngoài

ra phương pháp chiết cũng có thể ảnh hưởng tới thành phần của fucoidan [81] Theo

công bố [81], tác giả Percival (1968) đã phân lập fucoidan từ rong Ascophyllum nodosum bằng cách chiết với nước nóng và dung dịch kiềm loãng nóng, kết quả thu

được fucoidan có thành phần gồm fucose, xylose, sulfate và uronic axít , trong khi

đó cũng với loài rong Ascophyllum nodosum tác giả Marais và Joseleau (2001) đã

tiến hành chiết bằng dung dịch 0,01% NaCl và 1% CaCl2 thu được fucoidan có thành phần là fucose, glucose, galactose và sulfate [80]

1.2.3 Đa dạng cấu trúc của fucoidan

Việc phân tích cấu trúc của các polysacarit nói chung và fucoidan nói riêng

là một trong những thách thức lớn trong hóa học các chất hữu cơ có gốc đường Cấu trúc của fucoidan rong biển là vô cùng phức tạp và không đồng nhất [23] với những thay đổi về mô hình liên kết (linkages), sự phân nhánh (branching), vị trí nhóm sulfate cũng như các gốc đường trong polysacarit này phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng [25,34,35] Vì vậy, việc phân tích cấu trúc của chúng vẫn còn là vấn đề nan giải, ngay cả khi sử dụng các kỹ thuật phổ NMR phân giải cao mới nhất [88] Đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc chi tiết của fucoidan được công

bố, nhưng mới chỉ có một vài kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của fucoidan

SO3

-Hình 1.2 Cấu trúc của fucoidan từ F vesiculosus được mô tả vào năm 1950 [103] Percival và Ross (1950) đã mô tả cấu trúc fucoidan từ rong Fucus vesiculosus là một polysacarit có bộ khung mạch chính là -L-fucose(12), vị trí

mạch nhánh là gốc đường -L-fucose(13) và nhóm sulfate chủ yếu gắn ở vị trí

C-4 của gốc đường L-fucospynanose (hình 1.2) [103] Mô hình cấu trúc fucoidan này

tồn tại hơn 40 năm Năm 1993, cấu trúc fucoidan của rong F.vesiculosus đã được

nghiên cứu lại bởi Patankar và công sự, kết quả cho thấy có sự khác nhau ở bản chất liên kết glycoside của fucoidan này với mạch chính là -L-fucose(13) thay vì -L-fucose(12), nhóm sulfate được tìm thấy chủ yếu ở vị trí 4, phù hợp với mô hình

đã công bố trước [101] Sự khác nhau về cấu trúc fucoidan so với công bố của Percival và Ross được Pantakar giải thích như sau: đầu tiên là kỹ thuật chiết tách khác nhau, fucoidan được Percival và Ross chiết trong dung môi nước nóng, thay vì được chiết trong dung môi axít như Pantakar; thứ hai là sự khác nhau về phương pháp methyl hóa và cuối cùng là sự khác nhau về phương pháp phân tích cấu trúc Percival và Ross phân tích cấu trúc fucoidan dựa trên các tính chất về sắc ký và hóa học của sản phẩm methyl hóa, trong khi đó các sản phẩm methyl hóa được Patankar phân tích bằng phương pháp GC-EI/MS

Cấu trúc fucoidan từ loài rong Ascopphyllum nodosum (A nodosum) đã

được công bố trong các nghiên cứu [34,35,40,42] Năm 2001, Chevolt và cộng sự

đã phân lập được fucoidan từ rong nâu Ascorphylum nodosum [35], cấu trúc

fucoidan oligosacarit (bậc polyme hóa từ 8-14) của loài rong này được cấu thành bởi các liên kết luân phiên (13) và (14) (hình 1.3) [35]

Cấu trúc fucoidan từ A.nodosum cũng đã được Daniel và cộng sự nghiên cứu

khi sử dụng các enzym đặc hiệu làm xúc tác sinh học để thủy phân tạo fucoidan oligosacarit, kết quả cho thấy sự có mặt của lượng lớn các liên kết glycoside của gốc -L-fucose(13) và -L-fucose(14) [40]

Cấu trúc fucoidan từ loài rong Ecklonia kurome đã được công bố năm 1991

bởi Nishino và Nagumo Do tính dị thể trong phân tử của fucoidan nên phổ NMR của chúng quá phức tạp để có thể giải thích cấu trúc một cách trực tiếp Cấu trúc phân tử trung bình của fucoidan này chủ yếu được tạo thành bởi liên kết α-L-fucose(13) với phần lớn nhóm sulfate gắn ở vị trí C-4 và một phần ở C-2 hoặc vị trí C-2 là các điểm chẻ nhánh (hình 1.4) [91]

Năm 1999, cấu trúc fucoidan của 3 loài rong Cladosiphon Okamuranus (Chordariales) [89], Chorda filum (Laminariales) và Ascophyllum nodosum (Fucales) [34,41] đã được công bố Cấu trúc fucoidan của rong Cladosiphon

[3)-α-L-Fucp (2SO3-)-(14)-α-L-Fucp (2,3SO3-)-1]n

1 -

Hình 1.3 Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan

tách và phân lập từ rong nâu A nodusum

Hình 1.4 Cấu trúc fucoidan có sulfat ở vị trí 4

và liên kết 3-O-linked của loài rong E.kurome

okamuranus và Chorda filum được tạo thành bởi các gốc α-L-fucose(13) lặp lại

đều đặn, với một số nhóm sulfate ở vị trí C-2 (2-O-sulfateation) hoặc vị trí C-4 O-sulfateation) (hình 1.5) Sự xuất hiện của các nhóm O-acetyl và các mạch nhánh trong phân tử fucoidan càng làm tăng thêm tính dị thể về cấu trúc của chúng

(4-Năm 2002, cấu trúc fucoidan trọng lượng phân tử cao được phân lập từ rong

Fucus evanescens đã được nghiên cứu bởi Bilan và cộng sự, kết quả họ đã phát hiện

thấy có sự tương đồng giữa cấu trúc fucoidan này với cấu trúc fucoidan của rong

A.nodosum [23] Sau đó vào các năm 2004 và 2006, nhóm tác giả này tiếp tục công

bố thêm hai cấu trúc fucoidan từ rong Fucus distichus L và Fucus serratus được tạo thành bởi các gốc 1→3)α-L-Fucp và 1→4)α-L-Fucp liên kết lặp lại một cách tuần

tự, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C-2 và C-2,4 (hình 1.6 và hình 1.7) [24,25]

Hình 1.5 Cấu trúc trung bình của fucoidan được

phân lập từ rong Chorda filum [36]

R2 = SO3

hoặc H-

[3)--L-Fucp-(2,4 SO3-)-(14)--L-Fucp-(2SO3-)-(1]n

Như vậy, mặc dù có mối liên hệ rõ ràng giữa các loài rong và cấu trúc fucoidan, nhưng chưa đủ bằng chứng để thiết lập bất cứ mối tương quan hệ thống giữa cấu trúc fucoidan với các Bộ rong (algal order) Hầu hết các công bố về cấu trúc của fucoidan được phân lập từ các loài rong ở vùng ôn đới, thành phần hóa học của các loại fucoidan này nhìn chung là đơn giản với chỉ một gốc đường fucose và sulfate Tuy nhiên, fucoidan của các loài rong ở vùng nhiệt đới thì thành phần hóa học của chúng phức tạp hơn nhiều khi trong phân tử của chúng thường tồn tại đồng thời nhiều gốc đường khác nhau điều đó gây ra rất nhiều khó khăn cho việc phân tích cấu trúc của những loại fucoidan này Đó cũng là lý do tại sao không có nhiều công bố về cấu trúc của fucoidan rong biển ở vùng nhiệt đới, cho dù hoạt tính sinh học của chúng vô cùng thú vị

1.2.4 Các phương pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu

Một số quy trình khác nhau đã được sử dụng để chiết fucoidan Mối bận tâm chính trong quy trình tách chúng là nhiễu gây bởi các polysacarit khác như

Hình 1.6 Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan

được phân lập từ rong Nâu Fucus distichus L

R1 = H, R2 = -L-fucp-(14)--L-fucp(2SO3-)-(13)-L-fucp(2SO3-)-(1 chiếm 50%

Hình 1.7 Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus

laminaran và alginat Những thử nghiệm chiết đầu tiên được tiến hành với dung môi

là nước

Năm 1950, fucoidan từ rong Fucus vesiculosus và Fucus spiralis đã được

Percival và Ross chiết tách bằng nước sôi trong 24 giờ, sau đó loại bỏ alginate và protein bằng Pb-acetate, tiếp theo fucoidan được kết tủa dưới dạng phức hydroxide khi cho phản ứng với Ba(OH)2 Phức thu được, đem thủy phân trong dung dịch

H2SO4 loãng, fucoidan được tách ra và làm sạch bằng màng thẩm tách [103]

Năm 1952, Black đã khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, thời gian chiết và

tỷ lệ dung dịch chiết với rong nguyên liệu đến hiệu suất thu hồi fucoidan Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu để chiết fucoidan bao gồm khuấy huyền phù rong với dung dịch HCl ở pH: 2,0-2,5 (tỷ lệ 1:10) tại 70oC trong 1h Bằng cách xử lý này chỉ

1 lần chiết có thể phân lập được cỡ 50% fucoidan trong khi 3 lần chiết có thể tách ra được hơn 80% fucoidan Fucoidan còn có thể được chiết bằng đun nóng một phần rong khô với 10 phần H2O tại 100oC trong 3-7,5h, bằng cách này có thể thu được 55-60% fucoidan Khi tăng tỉ lệ H2O : rong, thời gian chiết hoặc số lần chiết có thể tăng được hiệu suất chiết Theo tác giả chiết nước đôi khi không thích hợp do khó tách cặn rong khỏi dung dịch nước Fucoidan thô được tách khỏi dịch chiết axít bằng trung hòa và cho bay hơi đến khô, hòa tan lại trong nước và kết tủa thu các phân đoạn fucoidan với cồn ở nồng độ 30% và 60% (v/v) Phân đoạn 60%, fucoidan thô có chứa 30-36% fucose Có thể tách được fucoidan với hàm lượng fucose lớn hơn 40% từ sản phẩm thô bằng cách xử lý rong nguyên liệu với formaldehyde [29]

Những nỗ lực đầu tiên nhằm đưa ra một phương pháp chiết fucoidan có hệ thống đã được thực hiện bởi Mian và Percival [84] Họ đã tiến hành chiết tuần tự, đầu tiên là xử lý rong nguyên liệu với formaldehyde, tiếp theo xử lý với cồn ở nồng

độ 80% để loại bỏ mannitol, các hợp chất màu và các sản phẩm khối lượng phân tử thấp, sau đó rong được chiết bằng cách khuấy trộn với dung dịch CaCl2 2% (ở nhiệt

độ phòng và 70oC) để phân lập laminaran và fucoidan (alginate được cố định dưới dạng muối Ca-alginat không tan) Fucoidan được chiết tiếp với dung dịch HCl loãng (pH: 2) Sau cùng bã rong được chiết với 3% Na2CO3 để thu lại alginate dưới dạng muối tan Na-alginat Hai dung môi bổ sung cuối cùng nhằm chiết ra thêm các

phân đoạn fucoidan Quy trình chiết tuần tự phức tạp này hầu như không được sử dụng về sau, nhưng đã trở thành cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo

Các tách giả Zvyagintseva và Duarte [48,143] đã sử dụng các phương pháp chiết fucoidan đơn giản nhưng lại áp dụng các bước làm sạch phức tạp tốn nhiều công sức

Fucoidan từ rong Adenocystis utricularis đã được phân lập bởi Ponce và

cộng sự [96] như sau: đầu tiên rong được xử lý với cồn 80% Sau đó để thu nhận fucoidan, rong được chiết riêng biệt với ba dung môi khác nhau thường được sử dụng để thu nhận fucoidan là nước cất, dung dịch CaCl2 2% và dung dịch HCl loãng (pH: 2) Trong cả 3 trường hợp việc chiết được thực hiện ở nhiệt độ phòng và sau đó ở 70oC Hiệu suất chiết và đặc tính của các sản phẩm thu được trong ba trường hợp là tương tự nhau với chỉ một số ít khác biệt Các dung dịch chiết ở nhiệt

độ phòng cho ra sản phẩm fucoidan giàu L-fucose, D-galactose và ester sulfate được gọi đặt tên là “galactofucan”, thể hiện đặc tính ức chế chống lại herpes simplex virus 1 và 2 nhưng không gây độc tế bào Sản phẩm khác là thành phần chính của dịch chiết thu được ở 70oC, bao gồm chủ yếu là fucose cùng với các monosacarit khác (phần lớn là Man, nhưng đồng thời có cả Glc, Xyl, Rha, Gal), một lượng đáng kể axít uronic và lượng nhỏ sulfate ester, được gọi chung là

“uronofucoidan”, không thể hiện hoạt tính kháng virus, nhưng lại thể hiện hoạt tính gây độc tế bào

Như vậy có thể thấy phương pháp chiết có ảnh hưởng rất lớn đến thành phần, cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của fucoidan Hiện nay vẫn chưa có phương pháp chuẩn áp dụng để chiết tách fucoidan từ các loài rong khác nhau Hầu hết các phương pháp chiết fucoidan hiện nay đều hướng đến mục tiêu bảo toàn cấu trúc tự nhiên vốn có của fucoidan, đồng thời hạn chế tối đa sự nhiễm tạp của các thành phần không mong muốn

1.2.5 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan

a Hoạt tính kháng đông tụ máu và kháng huyết khối

Fucoidan có phổ hoạt tính sinh học rộng và đa dạng, nhưng hoạt tính chống đông máu của chúng được nghiên cứu sớm nhất Nishino và cộng sự, đã thử nghiệm

hoạt tính chống đông máu của fucoidan được phân lập từ các loài rong E Kurome, H.fusiforme, L.angustata var longissima kết quả cho thấy chúng có hoạt tính kháng

đông tụ máu cao hơn so với Heparin [92] Hàm lượng sulfate có ảnh hưởng lớn đến

hoạt tính kháng đông tụ máu của fucoidan từ một số loài rong (E.kurome, H.fusiforme, vv…), hàm lượng sulfate càng cao thì hoạt tính kháng đông tụ càng

lớn [31,38,70,91,93,108] Vị trí của các nhóm sulfate trên các gốc đường cũng rất quan trọng với hoạt tính kháng đông tụ của fucoidan Theo các nghiên cứu [34,35,48,118,137] fucoidan sulfate hóa ở vị trí C-2 hoặc C-2, C-3 thể hiện hoạt tính kháng đông tụ, trong khi đó nhóm sulfate ở vị trí C-4 không thể hiện hoạt tính này

Trọng lượng phân tử fucoidan cũng có ảnh hưởng lên hoạt tính kháng đông

tụ máu của chúng Fucoidan tự nhiên từ Lessonia vadosa (Phaeophyta) có khối

lượng phân tử (320.000 Da MW) cho thấy hoạt tính chống đông máu tốt hơn các fucoidan đề polymer hóa có khối lượng phân tử (32.000 MW) [31,35]

Một số nghiên cứu khác cho thấy thành phần đường (fucose, galactose, v.v) của fucoidan có ảnh hưởng đến hoạt tính chống đông máu [44,95,104,105,106] Thành phần axít uronic không ảnh hưởng trực tiếp lên hoạt tính chống đông máu, nhưng nó gián tiếp làm tăng hoạt tính chống đông máu của fucoidan thông qua việc làm cho chuỗi đường trở nên linh động hơn [70]

Hoạt tính chống huyết khối của fucoidan cũng đã được thử nghiệm in vivo theo mô hình ngẽn tĩnh mạch và động mạch ở động vật thí nghiệm [87] Sulfate

galactofucan được phân lập từ rong Spatoglossum schroederi không thể hiện hoạt

tính chống đông máu trên một số thử nghiệm in vitro Tuy nhiên, nó lại thể hiện hoạt tính kháng huyết khối mạnh khi thực hiện thí nghiệm in vivo, điều này có thể được giải thích do ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hoạt tính kháng huyết khối của fucoidan [110]

Như vậy có thể thấy rằng fucoidan có tiềm năng rất lớn để sử dụng làm thuốc chống đông máu, thuốc chống huyết khối hoặc thực phẩm chức năng và dược liệu

mà hầu như không có tác dụng phụ [33,70,87]

b Hoạt tính chống virus

Trong những năm gần đây, các thử nghiệm về hoạt tính kháng virus của

fucoidan đã được thực hiện bằng cả “in vitro” và “in vivo” yếu tố gây độc tế bào

thấp của chúng so với các thuốc kháng virus khác đang được quan tâm xem xét sử

dụng trong y học lâm sàng Fucoidan từ các loài rong Laminaria japonica [75],

Adenocytis utricularis [107], Undaria pinnatifida (Mekabu) [68], Stoechospermum

marginatum [13], Undaria pinnatifida [55], Cystoseira indica [79] và Undaria

pinnatifida [54] cho thấy hoạt tính kháng virus HSV-1 và HSV-2 mà không gây độc

cho tế bào Vero [79] Hơn nữa, fucoidan còn cho thấy hoạt tính ức chế chống lại sự

tái tạo nhiều loại virus màng bao gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch của người và

cytomegalovirus [107] Hoạt tính antiprion và kìm hãm sự khởi phát bệnh khi bị

nhiễm trùng prion đường ruột của fucoidan đã được công bố bởi Doh-ura và cộng

sự [46]

c Hoạt tính kháng u và điều hòa miễn dịch

Hoạt tính kháng u của nhiều polysacarit đã được công bố trong những năm

gần đây Fucoidan từ rong Eisenia bicyclics và Laminaria japonica có tác dụng

chống u báng 180 [115,119,127] Fucoidan được phát hiện có khả năng ức chế sự

tăng sinh và gây chết tế bào trong dòng tế bào u lympho HS-Sultan của người [14]

Fucoidan từ các loài rong L saccharina, L digitata, F serratus, F distichus và F

vesiculosus có tác dụng khóa chặt tế bào ung thư vú MDA-MB-231 ngăn kết dính

với các tiểu cầu, tác dụng này có ý nghĩa quan trọng trong quá trình di căn khối u

[38, 52, 82]

Khả năng phục hồi các chức năng miễn dịch của fucoidan từ rong

L japonica đã được thử nghiệm in vivo [131] Fucoidan giúp thúc đẩy sự phục hồi

chức năng miễn dịch trên các con chuột bị chiếu xạ [133,134] Fucoidan có thể làm

tăng khả năng sản xuất interleukin-1 (IL-1) và interferon-γ (IFN-γ) trong các thử

nghiệm in vitro, tăng cường các chức năng của tế bào lympho T, tế bào B, đại thực

bào, tế bào giết tự nhiên (NK tế bào) và thúc đẩy các kháng thể chính phản ứng lại

với tế bào hồng cầu máu cừu (SRBC) trong thí nghiệm in vivo [136] Fucoidan

trọng lượng phân tử cao được điều chế từ Okinawa Mozuku (Cladosiphon

okamuranus) thúc đẩy sự gia tăng tỷ lệ gây độc tế bào T ở chuột [117] Fucoidan từ rong F.vesiculosus có các tác dụng lên sự trưởng thành và điều hòa miễn dịch trên

các tế bào tua (DCs), đây là các tế bào có kháng nguyên mạnh mẽ, thông qua con đường liên quan ít nhất đến yếu tố nhân tế bào (Nuclear factor - κB (NF- κB)) [65]

d Hoạt tính chống oxy hóa

Rất nhiều công bố cho thấy rằng fucoidan thể hiện hoạt tính chống oxy hóa quan trọng trong các thí nghiệm in vitro Nó là một chất chống oxy hóa tự nhiên tuyệt vời để ngăn ngừa các bệnh gây ra bởi các gốc tự do [139] Tác dụng ức chế sự hình thành các gốc tự do hydroxyl và gốc peoxit của fucoidan (homofucan) từ

F.vesiculosus và fucan (heterofucans) từ Padina gymnospora đã được nghiên cứu

bởi Micheline và cộng sự, kết quả cho thấy fucan có hoạt tính chống oxy hóa thấp

so với fucoidan [85]

Hoạt tính chống oxy hóa liên quan đến trọng lượng phân tử và hàm lượng

sulfate của fucoidan [23] Các phân đoạn fucoidan từ L japonica có khả năng làm

mất gốc peoxit và axít hypochlorous tuyệt vời [140] Cả khối lượng phân tử và hàm lượng sulfate của fucoidan đều đóng vai trò rất quan trọng trong việc tác động lên các gốc azo 2-2'-Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) gây ra quá trình oxy hóa LDL [76]

e Giảm lipid máu

Fucoidan là hợp chất có hoạt tính tương tự như axít sialic, nó có thể làm tăng các điện tích âm của bề mặt tế bào đến mức có hiệu lực với sự tích tụ của cholesterol trong máu, kết quả làm giảm lượng cholesterol trong huyết thanh Các

nghiên cứu [73,74,77,130] cho thấy fucoidan từ rong L japonica giảm đáng kể

cholesterol toàn phần, triglyceride và LDL-C mà không có tác dụng phụ gây tổn hại cho gan và thận Hoạt tính giảm lipid máu của fucoidan phụ thuộc vào trọng lượng phân tử của chúng, trọng lượng phân tử càng thấp thì hoạt tính càng cao [51]

viêm, hiệu quả chống viêm của fucoidan trong mô hình này không bị ảnh hưởng nhiều bởi hàm lượng của gốc fucose và sulfate cũng như các đặc tính cấu trúc khác của bộ khung mạch polysacarit của chúng [38] Ngoài ra hoạt tính kháng viêm của fucoidan cũng đã được nghiên cứu bởi các tác giả [82,135]

g Bảo vệ dạ dày

Fucoidan từ Cladosiphon okamuranus tokida là một chất an toàn với khả

năng bảo vệ dạ dày [116] Fucoidan như là một tác nhân chống viêm loét và ức chế

kết dính với vi khuẩn Helicobacter pyroli (một loại vi khuẩn gây viêm loét dạ dày) [59] Fucoidan từ rong Cladosiphon okamuranus có khả năng ức chế sự tăng trưởng

của tế bào ung thư dạ dày nhưng không cho thấy bất kỳ ảnh hưởng nào lên tế bào bình thường [62]

h Chống lại bệnh về gan

Fucoidan ngăn chặn tổn thương gan gây ra bởi concanavalin A bằng việc gián tiếp sinh ra interleukin (IL)-10 nội sinh và ức chế yếu tố tiền viêm (proinflammatory cytokine) ở chuột [113] Một số nghiên cứu [54,63,64] thấy cho fucoidan có thể là một chất chống xơ rất tốt năng nhờ sở hữu chức năng kép, cụ thể là: bảo vệ tế bào gan và ức chế sự tăng sinh tế bào gan hình sao

i Các ứng dụng của fucoidan

Những nghiên cứu trong suốt thập niên vừa qua đã đưa ra số lượng lớn bằng chứng khoa học về những lợi ích sức khỏe của fucoidan, một loại polysacarit sulfat hóa giàu fucose từ rong nâu Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của fucoidan chiết xuất từ rong nâu đã mở ra những cơ hội tiềm năng cho ngành công nghiệp dược phẩm, thực phẩm dinh dưỡng, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng Hiện nay, trên thị trường đã xuất hiện nhiều loại fucoidan với thành phần, tác dụng và nhãn mác khác nhau như: LCR fucoidan của Larson Century Ranch, INC, Mỹ có tác dụng điều trị các bệnh ung thư vú, ruột kết, buồng trứng, cũng như tác dụng chống dị ứng, chống lão hóa, chống đái tháo đường, giảm cholesterol, loét dạ dày,… Fucoidan Tongan Limu Moui của công ty AHD International, LLC, Mỹ có tác dụng trị tim mạch, chống lão hóa, tăng cường miễn dịch, … U-Fucoidan sản phẩm của tập đoàn Pharmaceutical Grade Nutritional & Dietary Anti-aging Supplements, Mỹ gây ra

sự giáng hóa các tế bào ung thư,… Fucoidan của tập đoàn Qingdao Yijia Huayi

Import & Export Co.,Ltd., Trung Quốc được sử dụng để phục hồi khả năng kháng

ung thư, sản phẩm thuốc kháng virut, điều trị ung thư và tim mạch,… [5] Sản phẩm Best fucoidan 70% của công ty Doctor’best INC., Mỹ có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư, ngăn ngừa lão hóa, tăng cường hệ miễn dịch,…[57]

Ở nước ta hiện nay, các sản phẩm fucoidan từ rong nâu Việt Nam đã xuất hiện trên thị trường dưới dạng thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư và viêm loét dạ dày do Công ty Cổ phần Fucoidan Việt Nam sản xuất là: FucoUmi, FucoAntiK và Fucogastro Ngoài ra, fucoidan cũng được sử dụng như một thành phần chức năng trong sản phẩm sữa chua fucoidan và nước yến fucoidan của Công

ty Sannet Khánh Hòa

Như vậy có thể thấy, fucoidan với rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị cũng như tiềm năng ứng dụng hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống đang ngày càng thu hút sự quan tâm nghiên cứu mạnh mẽ của các nhà khoa học trên toàn thế giới

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA FUCOIDAN

Việc phân tích cấu trúc của các polysacarit nói chung và fucoidan nói riêng

là một trong những thách thức lớn trong hóa học các chất hữu cơ có gốc đường Cấu trúc của fucoidan chiết từ rong biển thường hết sức phức tạp, bao gồm nhiều vấn đề như thành phần các đường đơn, các dạng đồng phân của đường, mức độ phân nhánh

và polyme hóa của chúng Vì vậy, để xác định được cấu trúc của fucoidan cần phải phân tích, xác định được các thông số sau:

- Thành phần các gốc đường và hàm lượng sulfate

- Vị trí nhóm sulfate trong các gốc đường

- Vị trí liên kết giữa các gốc đường

- Trật tự sắp xếp của các gốc đường

1.3.1 Phương pháp phân tích thành phần đường

Phân tích thành phần các đường đơn của fucoidan là bước quan trọng đầu tiên trong nghiên cứu cấu trúc của fucoidan Quy trình chung để xác định các đường đơn là thủy phân fucoidan thành các monosacarit (hình 1.8) và sau đó phân tích

thành phần của từng monosacarit bằng phương pháp sắc ký Hai phương pháp sắc

ký phổ biến nhất được sử dụng để phân tích thành phần các đường đơn là phân tích trực tiếp bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phân tích gián tiếp thông qua các dẫn xuất acetyl hóa của chúng bằng sắc ký khí (GC): Fucoidan được thủy phân

→ Khử → Acetyl hóa → Sắc ký [12]

Hình 1.8 Quy trình phân tích thành phần đường đơn của fucoidan

1.3.2 Phương pháp phân tích liên kết

Xác định vị trí của các liên kết trong polysacarit (fucoidan) chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp metyl hóa [44] Nguyên tắc của phương pháp dựa vào xác định dạng và số lượng dẫn xuất metyl eter của các đại lượng đường sau khi metyl hóa các nhóm hydroxy tự do trong chúng [44], phản ứng này luôn thực hiện trong dung môi DMSO Ví dụ: nếu sản phẩm thủy phân sau khi metyl hóa là dạng 2,3,6 tri-O-methyl α-D-glucopyranose (hình 1.9) có nghĩa là các gốc glucose liên kết với nhau qua liên kết (1→4) [12]

Hình 1.9 Quy trình methyl hóa phân tích liên kết glycoside trong polysacarit

1.3.3 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)

Dựa vào vùng phổ hấp thụ đặc trưng của nhóm sulfate trong phổ hồng ngoại

mà ta có thể xác định được vị trí liên kết của nhóm sulfate trong các gốc đường ở vị trí axial hay equatorial (bảng 1.3) [12] Với axial ta chỉ có một vị trí là C4, còn với

equatorial có hai vị trí là C2 và C3, do vậy cần phải dựa vào phổ NMR để xác định các vị trí này

Bảng 1.3 Các đỉnh phổ đặc trưng của fucoidan trên phổ hồng ngoại

775 Dao động dãn vòng của - anome

802-810 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí C6

822 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí

equatorial

845 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí axial

847 Dao động của liên kết C1-H của -anome

893 Dao động của liên kết C1-H của  anomer

917 Dao động vòng của -anome

1030-1167 Dao động hoá trị của hemiacetal

1034 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-C

1255-1264 Dao động hoá trị của S=O

1420 Dao động hoá trị đối xứng của COO

1430 Dao dộng gấp của C-H

1730 Dao động hoá trị của C=O

3300-3440 Dao động hoá trị của O-H

1.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Trong phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton, tất cả proton của carbohydrate (bao gồm cả mono-, oligo- và polysacarit-) có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng từ 1-6 ppm Các proton anomeric của mỗi monosacarit có độ dịch chuyển hóa học phụ thuộc vào cấu dạng α- hoặc β- của chúng Ví dụ, hầu hết các proton của α-anomeric xuất hiện trong vùng từ 5-6 ppm, trong khi đó các proton β-anomeric xuất hiện ở vùng 4-5 ppm

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton được coi như một phương pháp đặc trưng để nhận biết fucoidan dựa vào nhóm methyl ở vị trí C6 với tín hiệu  từ 1,2 đến 1,4 ppm là vùng là vùng đặc trưng H-6 của nhóm methyl, các tín hiệu có độ dịch chuyển hóa học  từ 5,0 đến 5,5ppm là vùng của H-1 (H-) của fucoidan

Mặc dù phổ 13C-NMR có tín hiệu yếu hơn nhiều, nhưng lại có nhiều thuận lợi hơn phổ 1H-NMR trong phân tích cấu trúc của polysacarit do các tín hiệu trong phổ 13C-NMR có độ dịch chuyển hóa học rộng hơn (0-220 ppm) so với phổ 1H-NMR Vì vùng giá trị  lớn nên các tín hiệu ít chồng lấp lên nhau như trong phổ proton NMR Các tín hiệu của C-anomeric trong phổ 13C-NMR thường xuất hiện trong vùng từ 90-100 ppm, trong khi đó các tín hiệu của C-nonanomeric xuất hiện trong vùng từ 60-85 ppm Với fucoidan thì vùng tín hiệu đặc trưng để nhận biết trong phổ 13C-NMR là vùng trường cao từ 15-20 ppm thuộc về nhóm methyl (C-6) của vòng α-L-fucopyranose Các tín hiệu của cacbon α-anomeric thường xuất hiện trong vùng từ 95-103 ppm, trong khi cacbon của β-anomeric xuất hiện trong vùng

từ 101-105 ppm Với nguyên tử cacbon carboxyl của axít uronic các tín hiệu sẽ xuất hiện ở vùng trường thấp hơn từ 170-180 ppm (hình 1.10) Các tín hiệu của nguyên tử cacbon có gắn với nhóm -OH, như C-6 của vòng pyranose và C-5 của vòng furanose xuất hiện trong vùng trường cao hơn từ 60-64 ppm, trong khi các tín Hình 1.10 Độ dịch chuyển hóa học trong phổ NMR của polysacarit

hiệu của các nguyên tử cacbon với nhóm hydroxyl thứ cấp (C2,3,4 trong vòng pyranose và C2,3 trong vòng furanose) xuất hiện trong vùng 65-87 ppm

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 13C và 1H của polysacarit thường có

độ phân giải thấp, các tín hiệu trùng lấp nhau khi trong phân tử của chúng có chứa nhiều gốc đường tương tự nhau Điều này gây ra rất nhiều khó khăn trong việc giải thích chi tiết cấu trúc của polysacarit Khi đó, phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều

sẽ giúp xác định thêm những thông tin về các liên kết trong phân tử, thông qua các tương tác giữa proton với proton và giữa proton với cacbon Phổ 1H, 1H-COSY (Correlation spectroscopy) biểu diễn mối tương quan giữa 1H và 1H của hạt nhân cùng loại, phổ 1H, 13C-COSY (hay cũng được gọi là phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) hay HECTOR (Heteronuclear Correlated Spectroscopy)) biểu diễn mối tương quan giữa 1H và 13C của các hạt nhân khác loại Phổ hai chiều 2D-NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) thể hiện sự tương tác về mặt không gian của các proton nằm trên các nguyên tử cacbon ở cách

xa nhau nhưng khoảng cách không gian giữa chúng nhỏ hơn 4Å Phổ 2D-HMBC (Hecteronuclear Multiple Bond Coherence) thể hiện mối tương quan của tín hiệu 1H

ở một nguyên tử 13C với tín hiệu của nguyên tử 13C khác cách xa nó 2 hoặc 3 liên kết, ngược lại phổ 13C-1H HMQC hay HETCOR thể hiện mối tương tác của 1H với

13

C liên kết trực tiếp với nhau Phổ 2D-TOCSY (Totally Correlated Spectroscopy)

là phổ tương quan toàn phần biểu diễn sự tương quan của các proton liên kết và không liên kết trực tiếp nhưng trong cùng một hệ spin giống nhau Ví dụ: tất cả proton của một gốc đường là thuộc cùng một hệ spin giống nhau Tóm lại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều sẽ cho ta thêm những thông tin để xác định trình tự và

vị trí của các liên kết trong phân tử polysacarit thông qua các tương tác giữa proton với proton và proton với cacbon trong các liên kết trực tiếp đồng hạt nhân hoặc các liên kết dị hạt nhân không trực tiếp

Như vậy, có thể thấy việc phân tích cấu trúc của các polysacarit là rất khó khăn, nhưng với polysacarit sulfate hóa từ rong biển còn khó khăn hơn rất nhiều do chúng có cấu trúc rất phức tạp, có mạch nhánh và chuỗi liên kết có mức độ lặp lại không cao nên việc phân tích cấu trúc chỉ dựa vào phổ 1H-NMR và 13C-NMR là

không đủ và đôi khi không mang lại hiệu quả Để phân tích cấu trúc các polysacarit phức tạp này các tác giả [5,12,23,24,34,48] thường kết hợp các phương pháp hóa học như chiết phân đoạn hoặc tách phân đoạn dựa vào sắc ký trao đổi ion, sau đó làm đơn giản hóa cấu trúc bằng các phản ứng đề sulfate hóa, metyl hóa, đề acetyl hóa, tiếp theo kết hợp các phương pháp phổ NMR, đôi khi cả phương pháp khối phổ (MS) để phân tích cấu trúc

1.3.5 Phương pháp phổ khối lượng (MS)

Phổ khối là kỹ thuật phân tích dựa trên việc xác định số khối của các phân tử hoặc các mảnh phân tử mang điện tích Nó là một trong những phương pháp quan trọng trong phân tích cấu trúc của các polysacarit Việc ứng dụng các phương pháp phân tích khối phổ hiện đại trong phân tích cấu trúc của hợp chất carbohydrate phức tạp đã dẫn đến những tiến bộ nhanh chóng trong lĩnh vực khoa học sự sống suốt hai thập kỷ qua của thế kỷ 21 Các kỹ thuật ion hóa truyền thống như: ion hóa bằng va chạm điện tử, ion hóa hóa học,… là những kỹ thuật ion hóa chỉ sử dụng được cho các hợp chất dễ bay hơi Các kỹ thuật ion hóa mới như: bắn phá nguyên tử nhanh (fast atom bombardment-FAB), ion hóa phun mù điện tử (electrospray ionization-ESI) và gần đây là kỹ thuật ion hóa phản hập thụ laser được hỗ trợ bởi chất nền (matrix-assisted laser desorption ionization-MALDI) đã được phát triển để ứng dụng phân tích cấu trúc của các hợp chất không bay hơi như các oligosacarit, các hợp chất polysacarit trọng lượng phân tử nhỏ, protein, glycoprotein và các glycolipid Các kỹ thuật ion hóa mới có khả năng ứng dụng phân tích được nhiều hợp chất hơn với độ nhạy và độ chính xác khối cao hơn các kỹ thuật ion hóa truyền thống Hiện nay, cấu trúc của nhiều hợp chất polymer sinh học phức tạp đã được phân tích thành công nhờ ứng dụng các kỹ thuật phân tích khối phổ hiện đại này [17-20,32,42,53,60,86,124,138,141]

a Kỹ thuật ESI (ElectroSpray Ionization - ion hóa phun mù điện tử): trong

kỹ thuật phun mù điện tử, dung dịch có chứa phân tử mẫu được phun ra khỏi đầu của mao quản mảnh vào buồng nhiệt ở áp suất giảm (gần bằng áp suất khí quyển) Mao quản mà dung dịch mẫu đi qua có điện thế cao dọc theo bề mặt của nó và những giọt nhỏ tích điện được tách ra, đi vào buồng ion hóa Các giọt tích điện nhập

với dòng khí khô (thường là khí nitơ), làm bay hơi các phân tử dung môi ra khỏi giọt mẫu Do vậy, mật độ điện tích của mỗi giọt tăng lên cho đến khi lực đẩy tĩnh điện trội hơn sức căng bề mặt (giới hạn Rayleigh), làm cho các giọt mẫu bị vỡ ra thành các giọt nhỏ hơn Quá trình này tiếp tục cho đến khi các ion mẫu không còn dung môi ở lại trong pha khí

b MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionization): Kỹ thuật MALDI sử

dụng các chất nền hỗ trợ để ion hóa mẫu dưới tác dụng của năng lượng laser lớn Trong kỹ thuật này, mẫu cần phân tích được hòa tan hay phân tán trong một chất nền (mạng lưới) được đặt trên đường đi của chùm photon có cường độ cao Hầu hết các máy MALDI đều sử dụng nguồn laser nitơ phát xạ ở 337 nm, có một số ứng dụng sử dụng nguồn laser hồng ngoại (laser IR) để phân tích trực tiếp các mẫu chứa trong gel hay trong bản sắc ký lớp mỏng Sự va chạm của các photon với mẫu sẽ ion hóa một vài phân tử mẫu và tách chúng ra khỏi bề mặt với chất nền (mạng lưới-matrix) Các ion bị tách ra sau đó được tăng tốc về phía bộ phận phân tích khối lượng (hình 1.11) Các hợp chất nền được sử dụng trong MALDI được chọn để sao cho chúng có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại từ xung laser nitơ (337 nm) Các hợp chất của axít nicotinic, picolinic, 2,5-Dihydroxybenzoic,… thường được sử dụng làm chất nền Chất nền hấp thu phần lớn năng lượng từ xung laser, do vậy cho phép tạo ra các ion mẫu nguyên vẹn được tách ra khỏi mạng lưới chất nền Phép đo phổ MALDI-MS dùng để phân tích một khoảng rộng trọng lượng phân tử, từ polymer với trọng lượng phân tử vài ngàn dalton (Da) cho tới các oligosacarit, oligonucleotit và polypeptit, kháng thể và các protein nhỏ với trọng lượng phân tử vào khoảng 300.000 Da Hơn nữa, kỹ thuật MALDI đòi hỏi chỉ vài femtomol mẫu chất (1.10-15 mol)

Hình 1.11 Nguyên lý hoạt động của phổ khối MALDI-MS

Cho đến nay một số cấu trúc của oligo-fucoidan đã được xác định bằng phương pháp khối phổ [5,17-20,141] Với những đoạn mạch ngắn, có thành phần monosacarit và nhóm sulfate đã biết thì việc xác định trật tự liên kết giữa các gốc đường, số nhóm sulfate trên mỗi gốc đường hầu như có thể giải quyết được bằng phương pháp khối phổ Trong phương pháp khối phổ người ta thường sử dụng hai chế độ đo khác nhau cho mục đích phân tích cấu trúc của polysacarit là chế độ ion dương (Positive mode) và chế độ ion âm (Negative mode) Với chế độ ion dương mức năng lượng chủ yếu đủ để cắt đứt các liên kết đường và hạn chế không phá vỡ

nó thành các mảnh nhỏ hơn, chế độ đo này được sử dụng để xác định thành phần và trật tự các liên kết đường [61] Trong khi đó chế độ ion âm với mức năng lượng lớn hơn để phá vỡ các vòng đường, được sử dụng để xác định vị trí nhóm sulfate trên các gốc đường Cơ chế phân mảnh carbohydrate và hệ thống danh pháp các ion mảnh được đề xuất bởi Domon và Costello (hình 1.12) [47]

Hình 1.12 Cơ chế phân mảnh của carbohydrate

* Cơ chế phân mảnh trong khối phổ:

 Các ion mảnh có chứa đầu cuối không khử được miêu tả bởi các chữ cái viết hoa đầu tiên trong hệ thống bảng chữ cái alphabet (A, B, C,…)

 Các ion mảnh có chứa đầu cuối khử của oligosacarit hoặc aglycon được miêu tả bởi các chữ cái từ cuối bảng hệ thống chữ cái alphabet (X, Y, Z,…)

R O O

OH

CH2OH

O

O OH

khử

 Các ion dạng A và X được sinh ra bởi sự phân mảnh cắt ngang vòng đường và ký hiệu phía trên bên trái của ion được quy định theo số mỗi liên kết vòng

và được tính theo chiều kim đồng hồ như được miêu tả trên hình 1.12

 Các ion được sinh ra từ sự phân cắt lần lượt các gốc đường được ký hiệu là

Am, Bm, Cm với m = 1 tính từ phía đầu không khử và Xn, Yn, Zn với n = 1 được tính

từ phía đầu khử

 Y0 và Z0 được quy ước cho sự phân mảnh của liên kết được liên kết với aglycone

* Các đặc trưng phân mảnh: Theo hệ thống danh pháp, quy tắc sau đây được

áp dụng chung cho sự phân mảnh của các oligosacarit:

 Ở sự phân cắt liên kết glycoside sinh ra các ion Bn, Cn, Yn, Zn dễ xảy ra ở mức năng lượng thấp và đây là sự phân mảnh phổ biến nhất, chúng biểu lộ chi tiết

về trình tự và sự phân nhánh của các hợp phần monosacarit

 Sự phân cắt ngang vòng đường thường xảy ra bởi sự va chạm ở mức năng lượng cao hơn Sự phân mảnh này mang đến những thông tin về kiểu liên kết

 Các dẫn xuất có mang nhóm methyl tạo ra phổ mang nhiều thông tin nhất,

sự phân tách cũng đặc trưng hơn và các tín hiệu cũng phong phú hơn Thêm nữa, mức độ bẻ gẫy liên kết phức tạp trong trường hợp này là thấp Các oligosacarit có chứa nhóm methyl có thể tăng độ nhạy lên gấp 10 lần Các ion thường được quan sát thấy ở dạng [M+Na]+

 Việc phân tích các carbohydrate không được chuyển hóa cho ra kết quả phổ phức tạp hơn, trường hợp này được thực hiện khi khối lượng mẫu bị hạn chế

 Các gốc đường chứa nhóm sulfate thường bị cắt đến monomer trước khi vòng đường bị phá vỡ Theo Tissot và cộng sự, vị trí nhóm sulfate có ảnh hưởng đến sự phân mảnh cắt ngang vòng đường Tùy theo vị trí các gốc sulfate trong vòng đường chiếm vị trí C-2, C-3 hoặc C-4 sẽ xuất hiện một số mảnh đặc trưng tương ứng Cơ chế phân mảnh các gốc đường xảy ra như trình bày trên hình 1.13 Các mảnh đặc trưng được sinh ra do sự phân mảnh cắt vòng fucose sulfate được thể hiện trong bảng 1.4 [124]

Bảng 1.4 Các mảnh đặc trưng cho các sulfate fucose có nhóm sulfate

ở các vị trí khác nhau trong phổ khối dạng ion âm

A, n,mX: cắt theo liên kết n,m của vòng đường như hình 1.13

● Trong trường hợp có mặt của ion kim loại, các oligosacarit sẽ phân mảnh theo các cơ chế sau (hình 1.14) [60]

H O

O

OSO3O

-O OH

O O

O H

C

H3

S

O OH

O

O H

C

H3

HSO-4

O OH

OH O

c Các phương pháp phân tích khối

Vai trò của bộ phận phân tích khối là phân tách hỗn hợp ion sinh ra bởi bộ phận ion hóa thành từng loại riêng biệt theo số khối m/z để đưa các ion này đến detector Có 05 kỹ thuật phân tích khối chính là: Tứ cực (Quadrupol-Q), Bẫy ion (Ion Trap-IT), Thời gian bay (Time of Flight-TOF), Cung từ (Magnetic Sector), Cộng hưởng bằng gia tốc ion biến đổi Fourie (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance-FT-ICR) Trong đó hai phương pháp phân tích khối chủ yếu được sử dụng trong phân tích cấu trúc của polymer và các hợp chất có khối lượng phân tử lớn là IT và TOF

* Phương pháp bẫy ion (Ion trap):

Hệ phân tích khối gồm 3 điện cực: điện cực xuyến và hai điện cực đáy có biên dạng hyperbol Điện cực ở giữa là điện cực xuyến được đặt điện áp dao động chính là 730 Hz dùng để tạo hố thế 2 chiều để ion đi vào và chuyển động ở tâm của Trap Hai điện cực đáy có tần số bổ sung có tác dụng cô lập ion, phân rã ion bằng

va chạm (CID) và phóng ion theo cộng hưởng phi tuyến Khí He được đưa vào bên trong Trap có tác dụng đệm cho chuyển động của ion trong quá trình bẫy ion, CID

và phân giải khối Ion Trap có khả năng tích lũy các ion, phân tích khối, phân lập ion và phân rã ion bằng va chạm do vậy đây là phương tiện rất thuận lợi cho việc nghiên cứu cơ chế phân mảnh

Hình 1.14 Cơ chế phân mảnh oligosacarit với sự có mặt của ion kim loại

MÊt ion kim lo¹i

Ph©n c¾t vßng

Ph©n c¾t liªn kÕt glycoside

* Phương pháp thời gian bay (Time of Flight-TOF):

Bộ phân tích khối lượng theo thời gian bay (TOF) dựa trên ý tưởng đơn giản

là tốc độ của hai ion được tạo ra trong cùng thời điểm với động năng như nhau sẽ thay đổi phụ thuộc vào khối lượng của các ion: Ion nhẹ hơn sẽ có tốc độ cao hơn và chuyển động về phía detector của phổ kế nhanh hơn, chạm tới detector sớm hơn Sự phân tách ion trong bộ phân tích TOF dựa theo nguyên lí là các ion có năng lượng ban đầu như nhau sẽ có tốc độ tỉ lệ với giá trị m/z của chúng Phổ kế TOF hiện nay được sử dụng rất phổ biến Vì thời gian giữa các xung ion ở nguồn ion có thể điều chỉnh theo mong muốn, nên các thiết bị TOF có thể phân tích các ion có giá trị m/z hầu như bất kì Khi ghép với nguồn ion hóa sung laser như MALDI, phổ kế TOF có các ứng dụng phổ biến trong phân tích cấu trúc của các oligosacarit, protein, các mảnh DNA, các phân tử sinh học và các polymer với khối lượng cỡ kDa

Tóm lại: Phân tích cấu trúc của oligosacarit bao gồm xác định thành phần

monosacarit, kiểu liên kết, mô hình phân nhánh và trật tự liên kết giữa các gốc đường Vì vậy, không có phương pháp khối phổ duy nhất nào có thể giúp xác định được tất cả các thông số trên Tuy nhiên, phổ khối kết hợp với một số phương pháp khác có thể giúp phân tích thành công cấu trúc của các oligosacarit phức tạp

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN

1.4.2 Tình hình nghiên cứu fucoidan trên thế giới

Qua tham khảo các tài liệu đã công bố về nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan trên thế giới, chúng tôi nhận thấy fucoidan từ rong nâu là một polymer sinh học có cấu trúc rất phức tạp bởi tính đa dạng và sự không đồng nhất

về thành phần đường cũng như vị trí nhóm sulfate trên các gốc đường [2,4,5,23-27]

Vì vậy, dù đã có rất nhiều công trình công bố về cấu trúc của fucoidan, nhưng chỉ

có một số công bố đưa ra được cấu trúc một cách rõ ràng mà phần lớn chỉ đưa ra cấu trúc của một phân đoạn có độ lặp lại cao của chúng Cho đến nay những công

bố về cấu trúc của fucoidan một cách rõ ràng nhất là fucoidan được phân lập từ các

loài rong nâu sinh trưởng ở vùng ôn đới như Fucus evnescens C.Ag, Fucus vesiculosus, Fucus distichus, Ascophyllum nodosum,… trong thành phần đường của

fucoidan từ những loài rong này hầu như chỉ có 01 gốc đường là fucose và một lượng rất nhỏ các gốc đường pyranose khác Trong khi đó các công trình nghiên cứu về cấu trúc fucoidan từ các loài rong nâu sinh trưởng ở vùng nhiệt đới không nhiều và phần lớn chỉ dừng lại ở việc đưa ra thành phần hóa học và vị trí của nhóm sulfate trên các gốc đường, thành phần hóa học của chúng tương đối phức tạp ngoài fucose và sulfate, còn có các gốc đường khác như galactose, xylose, mannose, rhamnose, glucose,… và cả gốc acetyl

Trong số các công bố về cấu trúc của fucoidan, đáng lưu ý nhất là nhóm nghiên cứu do Giáo sư Usov đứng đầu thuộc Viện Hóa Hữu cơ, Viện Hàn lâm Khoa học Nga đi tiên phong trong việc sử dụng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1-D) và hai chiều (2-D) để nghiên cứu cấu trúc của fucoidan Kết

quả đã có 04 loại cấu trúc của fucoidan từ các loài rong nâu Laminaria saccharina, Fucus evanescen, Fucus serratus, Fucus distichus L của Nga được công bố [23-

26] Gần đây, với việc áp dụng các phương pháp phân tích khối phổ hiện đại MALDI-TOF/MS/MS và ESI-MS/MS để phân tích cấu trúc của các polysacarit nói chung và fucoidan nói riêng đã tạo ra một bước đột phá mới trong phân tích cấu trúc phức tạp của polysacarit rong biển Một trong những điểm mạnh của phương pháp này là khả năng phân tích nhanh và chính xác vị trí của nhóm sulfate cũng như trật

tự giữa các gốc đường trong phân tử fucoidan Việc áp dụng thành công phương pháp này nhóm nghiên cứu của Anastyuk ở Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương, Viện Hàn lâm Khoa học Nga, Chi nhánh Viễn Đông, Liên Bang Nga đã

công bố lại cấu trúc fucoidan từ loài rong Fucus evanescens [18] và thêm 03 loại cấu trúc fucoidan mới từ các loài rong Costaria costata, Laminaria cichorioides và Coccophora langsdorfii đã được công bố [17, 19, 20]

Do sự đa dạng về cấu trúc và hoạt tính sinh học với khả năng ứng dụng rất lớn trong lĩnh vực công nghiệp dược liệu [69,81,88] Nên mặc dù đã được bắt đầu nghiên cứu từ hơn 100 năm trước, hiện nay fucoidan vẫn luôn thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới nhằm tìm kiếm các loại thuốc mới Cho đến nay, phần lớn các công bố về hoạt tính sinh học của fucoidan được thực hiện trên các sản phẩm fucoidan thương mại hoặc chiết thô nên mối quan hệ

giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế vẫn chưa được nghiên cứu một cách rõ ràng Vì vậy, để có thể sử dụng fucoidan làm thuốc thì yếu tố tiên quyết

và quan trọng nhất là phải xác định được cấu trúc chi tiết của chúng

1.4.2 Tình hình nghiên cứu fucoidan ở Việt Nam

Ở trong nước, fucoidan mới chỉ được biết đến và nghiên cứu trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây bởi các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Năm 2006, lần đầu tiên tại Việt Nam, Phân viện Khoa học Vật liệu tại Nha Trang (nay là Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang) đã đưa ra quy trình công nghệ chiết xuất và phân lập fucoidan từ rong nâu Việt Nam Đây là một quy trình công nghệ cao, sử dụng màng siêu lọc cho phép đồng thời cô đặc và loại bỏ tạp chất khỏi dung dịch fucoidan tại nhiệt độ phòng, nhờ vậy giữ nguyên được hoạt tính sinh học

tự nhiên vốn có của chúng [2]

Nước ta với nguồn tài nguyên rong nâu vô cùng đa dạng và phong phú, riêng

chi Sargassum đã phát hiện được trên 60 loài với sản lượng ước tính tới 10.000 tấn khô/năm [58], hàm lượng fucoidan trong các loài rong chi Sargassum từ 1-2,5%

trọng lượng rong khô, đây có thể được coi là nguồn dược liệu tiềm năng rất lớn của biển Việt Nam Tuy nhiên, các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan rong nâu Việt Nam vẫn còn rất hạn chế Các nghiên cứu công bố về fucoidan từ rong nâu Việt Nam chủ yếu đưa ra các đặc điểm về cấu trúc như thành phần đường, vị trí nhóm sulfat và phần lớn chúng thực hiện trên các mẫu fucoidan chiết thô [4,5] Cho tới nay mới chỉ có 03 công bố về cấu trúc tương đối rõ ràng của

fucoidan từ các loài rong Sargassum swartzii, Sargassum polycystum và Turbinaria ornata ở Việt Nam cụ thể là:

Năm 2008, tác giả Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự, đã công bố thành phần và

cấu trúc của phân đoạn fucoidan F20 được phân lập từ rong Sargassum swartzii với

thành phần chủ yếu là fucose (> 45%), bên cạnh đó các đường đơn khác như rhamnose, mannose và galactose cũng chiếm hàm lượng đáng kể (10,81-22,07%), tác giả chỉ đưa ra trình tự liên kết giữa các gốc đường hexose, uronic axít và fucose, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4 trong phân đoạn F20 [4]