* Chiết tách fucoidan từ rong nâu
Các mẫu rong được cắt nhỏ (2-3 cm), xử lý loại màu và các phân đoạn trọng lượng phân tử thấp với hỗn hợp (96% EtOH : Cloroform : H2O = 89 : 1 : 10) theo tỉ lệ w/v= 1/10 trong thời gian 10-15 ngày, hỗn hợp được lọc tách, rong được phơi khơ trong khơng khí ở nhiệt độ phịng.
Mẫu rong sau khi đã loại chất béo và các hợp chất màu (500 g) được tiến hành chiết 3 lần với 20 lít dung dịch 0,1N HCl (pH 2-3) ở nhiệt độ 60oC trong thời gian 2h với mỗi lần chiết. Dịch chiết được lọc tách thơ qua vải lọc, dịch chiết chứa các polysacarit tan trong nước của 3 lần chiết được gộp lại và trung hịa bằng dung dịch NaHCO3 8% đến pH = 6-7. Dịch chiết sau trung hịa thay vì được cơ đặc bằng cơ quay chân khơng ở nhiệt độ 50-60 oC sau đĩ thẩm tách loại muối và các tạp chất trọng lượng phân tử thấp bằng màng thẩm tách trong thời gian kéo dài (48 giờ) theo phương pháp [98], chúng tơi tiến hành cơ đặc và làm sạch dịch chiết bằng màng siêu lọc kích thước 10kDa. Với màng siêu lọc cho phép loại nước, loại muối, các hợp chất màu, các hợp chất trọng lượng phân tử thấp ở nhiệt độ phịng trong thời gian chỉ từ 8-10 giờ, điều đĩ sẽ giúp bảo tồn được cấu trúc tự nhiên của fucoidan khơng bị ảnh hưởng bởi yếu tố nhiệt độ và thời gian.
Dịch chiết sau khi được làm sạch và cơ đặc tới 1/10 thể tích ban đầu được kết tủa bằng EtOH 98% theo tỉ lệ thể tích Vdịch chiết : Vethanol = 1:4 hoặc đơng khơ sử dụng máy đơng khơ chân khơng thu được bột polysacarit dạng thơ chứa fucoidan.
* Phân đoạn tinh chế fucoidan bằng sắc ký trao đổi anion [98]
Bột polysacarit thơ gồm (fucoidan, laminaran và polyuronan) (0,5g) được hịa tan trong dung dịch 0,04N HCl, ly tâm tách phần tủa khơng tan ta loại được polyuronan (PA) dưới dạng kết tủa axít polyuronic, phần dịch trong đưa lên cột
DEAE-Cellulose (dạng Cl-, 3,0 x 32 cm). Đầu tiên rửa cột với dung dịch 0,04N HCl đến khi thử âm tính với hydrat cacbon bằng phương pháp phenol-axít sulfuric [49] ta thu được phân đoạn laminaran, tiếp theo rửa giải cột bằng muối NaCl theo gradient tuyến tính liên tục nồng độ tăng dần từ 0-2N, các phân đoạn fucoidan (F1, F2, F3,…) được tách ra theo các nồng độ rửa giải khác nhau của dung dịch muối NaCl, mỗi phân đoạn thu được cho thẩm tách loại muối bằng màng thẩm tách kích thước 10kDa trong nước cất sau thời gian 24h, sau đĩ đem đơng khơ để thu các phân đoạn fucoidan dạng bột
2.3.2. Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate và thành phần đường
* Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate [49]
Lấy 200 µl dung dịch cần xác định cĩ hàm lượng carbohydrate trong khoảng 20-100 µg/ml, thêm vào 200µl thuốc thử phenol 5% lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt thêm tiếp 1ml axít sulfuric đậm đặc lắc đều rồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút, lấy ra để nguội, đođộ hấp thụ quang ở bước sĩng λ = 490 nm. Sử dụng glucose làm chất chuẩn.
* Phân tích thành phần đường [98]
Mẫu fucoidan (5 mg) cho vào ống nghiệm cĩ nút vặn dung tích 5ml, thêm 1ml TFA (Triflorua acetic axít ) 2M lắc đều cho tan, đem thủy phân ở 100oC trong 6 giờ sau đĩ cho bay hơi đến gần khơ bằng máy cơ quay chân khơng, rửa lặp lại 3 lần với MeOH để đuổi hết TFA dư. Phần cặn cịn lại hịa tan với 1 ml nước đề ion, dung dịch này được dùng để phân tích thành phần đường trên thiết bị phân tích carbohydrate IC-500 Biotronik (Germany), sử dụng cột Shim-pack ISA- 07/S2504 (0.4 x 25 cm), pha động là đệm borat kali, tốc độ rửa giải 0,6 ml/phút. Đường đơn được phát hiện bằng phương pháp bicinchorinate trên hệ phân tích Shimadzu C-R2 AX. Các đường đơn fucose, glucose, galactose, mannose, xylose, rhamnose được sử dụng làm chất chuẩn. Hàm lượng các đường đơn được tính theo % mol dựa vào các chất chuẩn.