QUAN ĐẾN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu fucoidan trên thế giới.
Qua tham khảo các tài liệu đã cơng bố về nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan trên thế giới, chúng tơi nhận thấy fucoidan từ rong nâu là một polymer sinh học cĩ cấu trúc rất phức tạp bởi tính đa dạng và sự khơng đồng nhất về thành phần đường cũng như vị trí nhĩm sulfate trên các gốc đường [2,4,5,23-27]. Vì vậy, dù đã cĩ rất nhiều cơng trình cơng bố về cấu trúc của fucoidan, nhưng chỉ cĩ một số cơng bố đưa ra được cấu trúc một cách rõ ràng mà phần lớn chỉ đưa ra cấu trúc của một phân đoạn cĩ độ lặp lại cao của chúng. Cho đến nay những cơng bố về cấu trúc của fucoidan một cách rõ ràng nhất là fucoidan được phân lập từ các lồi rong nâu sinh trưởng ở vùng ơn đới như Fucus evnescens C.Ag, Fucus vesiculosus, Fucus distichus, Ascophyllum nodosum,… trong thành phần đường của
fucoidan từ những lồi rong này hầu như chỉ cĩ 01 gốc đường là fucose và một lượng rất nhỏ các gốc đường pyranose khác. Trong khi đĩ các cơng trình nghiên cứu về cấu trúc fucoidan từ các lồi rong nâu sinh trưởng ở vùng nhiệt đới khơng nhiều và phần lớn chỉ dừng lại ở việc đưa ra thành phần hĩa học và vị trí của nhĩm sulfate trên các gốc đường, thành phần hĩa học của chúng tương đối phức tạp ngồi fucose và sulfate, cịn cĩ các gốc đường khác như galactose, xylose, mannose, rhamnose, glucose,… và cả gốc acetyl
Trong số các cơng bố về cấu trúc của fucoidan, đáng lưu ý nhất là nhĩm nghiên cứu do Giáo sư Usov đứng đầu thuộc Viện Hĩa Hữu cơ, Viện Hàn lâm Khoa học Nga đi tiên phong trong việc sử dụng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1-D) và hai chiều (2-D) để nghiên cứu cấu trúc của fucoidan. Kết quả đã cĩ 04 loại cấu trúc của fucoidan từ các lồi rong nâu Laminaria saccharina, Fucus evanescen, Fucus serratus, Fucus distichus L. của Nga được cơng bố [23- 26]. Gần đây, với việc áp dụng các phương pháp phân tích khối phổ hiện đại MALDI-TOF/MS/MS và ESI-MS/MS để phân tích cấu trúc của các polysacarit nĩi chung và fucoidan nĩi riêng đã tạo ra một bước đột phá mới trong phân tích cấu trúc phức tạp của polysacarit rong biển. Một trong những điểm mạnh của phương pháp này là khả năng phân tích nhanh và chính xác vị trí của nhĩm sulfate cũng như trật tự giữa các gốc đường trong phân tử fucoidan. Việc áp dụng thành cơng phương pháp này nhĩm nghiên cứu của Anastyuk ở Viện Hĩa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương, Viện Hàn lâm Khoa học Nga, Chi nhánh Viễn Đơng, Liên Bang Nga đã cơng bố lại cấu trúc fucoidan từ lồi rong Fucus evanescens [18] và thêm 03 loại cấu trúc fucoidan mới từ các lồi rong Costaria costata, Laminaria cichorioides và
Coccophora langsdorfii đã được cơng bố [17, 19, 20].
Do sự đa dạng về cấu trúc và hoạt tính sinh học với khả năng ứng dụng rất lớn trong lĩnh vực cơng nghiệp dược liệu [69,81,88]. Nên mặc dù đã được bắt đầu nghiên cứu từ hơn 100 năm trước, hiện nay fucoidan vẫn luơn thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới nhằm tìm kiếm các loại thuốc mới. Cho đến nay, phần lớn các cơng bố về hoạt tính sinh học của fucoidan được thực hiện trên các sản phẩm fucoidan thương mại hoặc chiết thơ nên mối quan hệ
giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế vẫn chưa được nghiên cứu một cách rõ ràng. Vì vậy, để cĩ thể sử dụng fucoidan làm thuốc thì yếu tố tiên quyết và quan trọng nhất là phải xác định được cấu trúc chi tiết của chúng.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu fucoidan ở Việt Nam.
Ở trong nước, fucoidan mới chỉ được biết đến và nghiên cứu trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây bởi các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng cơng nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam. Năm 2006, lần đầu tiên tại Việt Nam, Phân viện Khoa học Vật liệu tại Nha Trang (nay là Viện Nghiên cứu và Ứng dụng cơng nghệ Nha Trang) đã đưa ra quy trình cơng nghệ chiết xuất và phân lập fucoidan từ rong nâu Việt Nam. Đây là một quy trình cơng nghệ cao, sử dụng màng siêu lọc cho phép đồng thời cơ đặc và loại bỏ tạp chất khỏi dung dịch fucoidan tại nhiệt độ phịng, nhờ vậy giữ nguyên được hoạt tính sinh học tự nhiên vốn cĩ của chúng [2].
Nước ta với nguồn tài nguyên rong nâu vơ cùng đa dạng và phong phú, riêng chi Sargassum đã phát hiện được trên 60 lồi với sản lượng ước tính tới 10.000 tấn khơ/năm [58], hàm lượng fucoidan trong các lồi rong chi Sargassum từ 1-2,5% trọng lượng rong khơ, đây cĩ thể được coi là nguồn dược liệu tiềm năng rất lớn của biển Việt Nam. Tuy nhiên, các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan rong nâu Việt Nam vẫn cịn rất hạn chế. Các nghiên cứu cơng bố về fucoidan từ rong nâu Việt Nam chủ yếu đưa ra các đặc điểm về cấu trúc như thành phần đường, vị trí nhĩm sulfat và phần lớn chúng thực hiện trên các mẫu fucoidan chiết thơ [4,5]. Cho tới nay mới chỉ cĩ 03 cơng bố về cấu trúc tương đối rõ ràng của fucoidan từ các lồi rong Sargassum swartzii, Sargassum polycystum và Turbinaria ornata ở Việt Nam cụ thể là:
Năm 2008, tác giả Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự, đã cơng bố thành phần và cấu trúc của phân đoạn fucoidan F20 được phân lập từ rong Sargassum swartzii với thành phần chủ yếu là fucose (> 45%), bên cạnh đĩ các đường đơn khác như rhamnose, mannose và galactose cũng chiếm hàm lượng đáng kể (10,81-22,07%), tác giả chỉ đưa ra trình tự liên kết giữa các gốc đường hexose, uronic axít và fucose, nhĩm sulfate chủ yếu ở vị trí C4 trong phân đoạn F20 [4].
Năm 2013, Bilan và các cộng sự đã cơng bố cấu trúc của fucoidan từ rong
Sargassum polycystum cĩ thành phần chủ yếu L-fucose, D-galactose và sulfate. Cấu trúc phân tử của fucoidan F4- S.polycystum chứa bộ khung chủ yếu được tạo bởi các gốc 3-linked α-L-fucopyranose 4- sulfate, giữa các chuỗi tương đối ngắn của các gốc này được đặt nằm rải rác bởi các gốc 2-linked α-D-galactopyranose, cũng sulfate hĩa ở vị trí số 4 [27].
Cũng trong năm 2013, Thành Thị Thu Thủy và cộng sự đã cơng bố cấu trúc của fucoidan từ rong Turbinaria ornata cĩ hàm lượng sulfate cao và thành phần đường rất đơn giản chỉ gồm fucose và galactose theo tỉ lệ 3:1, đây là một dạng galactofucan sulfate hĩa. Cấu trúc bộ khung của chúng là các gốc α-L-Fucp liên kết 3, sulfate chủ yếu ở vị trí C2 và một phần ở vị trí C4. Nhĩm sulfate cũng được phát hiện thấy chiếm ưu thế ở vị trí C2 và một phần ở vị trí C4 của gốc galactose trong mạch nhánh được tạo nên bởi các gốc galactose liên kết 4 [122].
Các cơng bố về hoạt tính sinh học cũng mới chỉ được thử nghiệm với hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các mẫu fucoidan chiết thơ. Mặc dù hoạt tính sinh học của fucoidan dạng sulfated galactofucan được dự đốn là rất đa dạng như hoạt tính kháng vi rút, chống nghẽn mạch, bảo vệ dạ dày, kháng ung thư,… nên việc nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và hoạt tính của fucoidan theo định hướng làm thuốc là hết sức cần thiết.
Kết luận:
Tổng quan cho thấy, Việt Nam mặc dù cĩ nguồn tài nguyên rong nâu vơ cùng đa dạng và phong phú [1]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về fucoidan từ rong nâu Việt Nam mới chỉ bắt đầu từ hơn một thập kỉ nay và số các cơng bố về thành phần, cấu trúc và hoạt tính của fucoidan phân lập từ các lồi rong nâu Việt Nam vẫn cịn rất hạn chế [2,5,27,122]. Do vậy, chúng tơi chọn đề tài “Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hĩa học của fucoidan cĩ hoạt tính sinh học từ một số lồi rong nâu ở vịnh Nha Trang” nhằm hồn chỉnh thêm những nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ rong biển Việt Nam để định hướng sử dụng chúng làm dược liệu hoặc thực phẩm chức năng.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Dựa vào danh mục thành phần lồi và trữ lượng các lồi rong nâu phân bố ở Việt Nam đã cơng bố [1, 3, 8], chúng tơi đã chọn 08 lồi rong thuộc 3 chi rong khác nhau trong ngành rong nâu để nghiên cứu (bảng 2.1). Đây là những lồi rong phổ biến, cĩ trữ lượng lớn, cĩ giá trị kinh tế cao và cĩ thể khai thác ở quy mơ cơng nghiệp ở vùng biển vịnh Nha Trang tỉnh Khánh Hịa. Việc nghiên cứu thành phần và cấu trúc của fucoidan cĩ hoạt tính sinh học từ các lồi rong này cĩ ý nghĩa quan trọng trong việc tìm kiếm nguồn dược liệu mới từ tài nguyên rong biển, từ đĩ làm cơ sở cho việc khai thác và sử dụng một cách hợp lý nguồn tài nguyên rong biển ở Nha Trang nĩi riêng và ở khu vực Nam Trung Bộ của Việt Nam nĩi chung.
Các mẫu rong biển được thu ngay sau thời kỳ sinh sản. Thời gian thu hoạch tùy thuộc vào từng lồi rong nhưng thơng thường vào khoảng thời gian từ tháng 3 đến tháng 6 hàng năm. Các mẫu rong được thu thập và phân loại bởi TS. Lê Như Hậu, chuyên gia phân lồi rong biển thuộc Phịng Vật liệu hữu cơ từ tài nguyên biển của Viện Nghiên cứu và ứng dụng cơng nghệ Nha Trang. Khi thu, dùng liềm cắt sát gốc cây rong, rửa sạch khỏi tạp chất bằng nước biển và phơi khơ tự nhiên ở nhiệt độ phịng. Khối lượng mỗi mẫu thu tối thiểu là 10kg rong tươi. Các mẫu rong dạng tiêu bản ép khơ được lưu trữ tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng cơng nghệ Nha Trang.
Bảng 2.1. Các lồi rong nâu được thu nghiên cứu Stt Tên lồi rong Địa điểm thu mẫu 01 Sargassum mcclurei Sơng Lơ-Nha Trang 02 Sargassum polycystum Bãi Nam-Nha Trang 03 Sargassum oligocystum Sơng Lơ-Nha Trang 04 Sargassum denticapum Sơng Lơ-Nha Trang 05 Sargassum swartzii Bãi Tiên-Nha Trang 06 Sargassum binderi Hịn Tre-Nha Trang 07 Turbinaria ornata Hịn Rùa-Nha Trang 08 Padina australis Hịn Chồng-Nha Trang
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Phương pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan
* Phương pháp chiết tách [143]:
Dựa trên cơ sở tham khảo tài liệu đã cơng bố về các phương pháp chiết tách fucoidan cho mục đích nghiên cứu cấu trúc [98,103,104,143]. Chúng tơi tiến hành chiết theo phương pháp sử dụng dung dịch axít lỗng (sơ đồ hình 2.1) vì phương pháp này ít ảnh hưởng đến cấu trúc phân tử tự nhiên của fucoidan, đơn giản và dễ thực hiện. Phương pháp này cũng đã được chọn làm phương pháp chính để chiết fucoidan cĩ hoạt tính theo Patent của Nga (Patent WO 2005/014657) [98].
Hình 2.1. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan từ rong nâu. Rong tươi
Rong đã loại chất béo
Dịch chiết rong
Polysacarit (thơ)
Chiết với (Cồn; Aceton, Chloroform) Polyphenol, chất màu, các hợp
chất trọng lượng phân tử thấp
Chiết với HCl 0,1N, 60oC, t = 2 giờ (3lần) Bã rong
Trung hịa với NaHCO3 8%
Cơ đặc, thẩm tách bằng màng 10kDa Tủa với 4 lần thể tích cồn 98
hoặc đơng khơ
Hịa tan trong HCl 0,04N, ly tâm
Sắc ký trao đổi anion (DEAE-Cellulose) Rửa giải với HCl 0,04N
và gradient nồng độ của NaCl (0 - 2 N) Polyuronic axit (PA)
L F1 F2 F3 F4
* Tách phân đoạn fucoidan [143]
Fucoidan được tiến hành phân đoạn tinh chế bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose (hình 2.1). Mẫu bột fucoidan thơ (gồm fucoidan, laminaran và polyuronan) được hịa tan trong dung dịch 0,04N HCl, ly tâm tách phần khơng tan (polyuronan), phần dịch trong được cho chạy qua cột sắc ký DEAE-cellulose. Hợp chất laminaran (hợp chất khơng cĩ nhĩm mang điện tích) khơng bị hấp thụ trên cột sẽ được rửa giải đầu tiên bằng dung dịch HCl lỗng (0,04N) hoặc nước cất. Tiếp theo các phân đoạn fucoidan sẽ được rửa giải bằng dung dịch muối NaCl ở các nồng độ khác nhau.
2.2.2 Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate và thành phần đường
* Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate: Hàm lượng đường tổng được xác định bằng phương pháp phenol-axít sulfuric [49].
* Phân tích thành phần đường đơn của fucoidan: Thành phần đường đơn được xác định bằng phương pháp HPLC, sau khi fucoidan được thủy phân axít về các monomer [98].
2.2.3 Phương pháp phân tích hàm lượng sulfate
Hàm lượng sulfate được phân tích bằng phương pháp đo độ đục với BaCl2/gelatine (Dodgson., 1962), sử dụng K2SO4 làm chất chuẩn [45].
2.2.4 Phương pháp khử sulfate
Khử sulfate (desulfation) được thực hiện theo phương pháp solvolistic trong hỗn hợp (dimethyl sulfoxide và methanol) sử dụng pyridin làm xúc tác [23].
2.2.5 Phương pháp phân tích hàm lượng uronic axít
Hàm lượng uronic axít được xác định sử dụng phương pháp Carbazole, sử dụng D-glucuronic axít làm chất chuẩn [28].
2.2.6 Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hĩa
Methyl hĩa (methylation) thực hiện theo phương pháp được mơ tả bởi Chizhov và cộng sự (1999) [36], nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào việc xác định dạng và số lượng của các loại đường sau khi methyl hĩa các nhĩm (-OH) tự do của chúng.
2.2.7 Phương pháp thủy phân tạo oligosacarit
Thủy phân fucoidan để tạo oligosacarit được thực hiện theo phương pháp tự thủy phân “autohydrolysis”, bằng phương pháp này nhĩm (SO3Na) của fucoidan được chuyển về dạng axít (SO3H) và quá trình thủy phân axít polysacarit dưới điều kiện rất nhẹ nhàng do các nhĩm SO3H của hợp chất fucoidan đĩng vai trị như là nguồn axít [18].
2.2.8 Phương pháp phổ hồng ngoại IR
Mẫu fucoidan được ép viên với KBr theo tỉ lệ 10 mg mẫu/20 mg KBr. Phổ hồng ngoại FT-IR của fucoidan được ghi trên máy Carl Zeiss IR-75 spectrometer (đo tại Viện Hĩa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Viện Hàn lâm Khoa học Nga - Chi nhánh Viễn Đơng, L.B.Nga), trong vùng số sĩng 4000-400 cm-1 [98]. Dựa vào phổ IR trong vùng từ 800 đến 1732 cm-1 ta cĩ thể xác định được các nhĩm sulfate trong các phân tử đường nằm ở vị trí axial hay equatorial [23,36,98].
2.2.9 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR được ghi trên máy Brucker Advance DPX- 500 NMR spectrometer (Đức) (đo tại Viện Hĩa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Viện Hàn lâm Khoa học Nga - Chi nhánh Viễn Đơng, L.B.Nga và Viện Hĩa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam). Mẫu fucoidan được pha trong D2O với nồng độ 20 μg/ml, đo ở tần số 75.5 MHz tại nhiệt độ 35oC.
2.2.10 Phương pháp phổ khối lượng MS
Phổ MALDI-TOF/MS/MS được ghi trên thiết bị khối phổ Ultra Flex III MALDI-TOF/TOF (Bruker, Đức) với nguồn laser nitrogen (337 nm).
Phổ ESI-MS/MS được ghi trên máy quang phổ ESI Q-TOF (Agilent 6510 LC Q-TOF, Mỹ) với nguồn ion hĩa phun mù điện tử.
2.2.11Phương pháp thử hoạt tính sinh học và xử lý số liệu
* Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào
Hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan trên các dịng tế bào ưng thư người được thực hiện theo phương pháp của Likhitwitaywid [78] và Svetlana [121].
* Phân tích số liệu
Tất cả các con số chỉ ra trong nghiên cứu này là đại diện của ít nhất 3 thí nghiệm độc lập với kết quả tương tự. Sự khác nhau thống kê được đánh giá sử dụng Student’s t-test, và sự khác nhau được coi là cĩ ý nghĩa ở p ≤ 0.05.
2.3 THỰC NGHIỆM
2.3.1 Chiết tách và phân đoạn tinh chế fucoidan từ rong nâu
* Chiết tách fucoidan từ rong nâu
Các mẫu rong được cắt nhỏ (2-3 cm), xử lý loại màu và các phân đoạn trọng lượng phân tử thấp với hỗn hợp (96% EtOH : Cloroform : H2O = 89 : 1 : 10) theo tỉ lệ w/v= 1/10 trong thời gian 10-15 ngày, hỗn hợp được lọc tách, rong được phơi khơ trong khơng khí ở nhiệt độ phịng.
Mẫu rong sau khi đã loại chất béo và các hợp chất màu (500 g) được tiến hành chiết 3 lần với 20 lít dung dịch 0,1N HCl (pH 2-3) ở nhiệt độ 60oC trong thời gian 2h với mỗi lần chiết. Dịch chiết được lọc tách thơ qua vải lọc, dịch chiết chứa các polysacarit tan trong nước của 3 lần chiết được gộp lại và trung hịa bằng dung dịch NaHCO3 8% đến pH = 6-7. Dịch chiết sau trung hịa thay vì được cơ đặc bằng