* Phổ 13C-NMR:
Kết quả đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của các phân đoạn fucoidan được đưa ra trên hình 3.11 và phụ lục III. Giống như nhiều fucoidan rong biển khác trên thế giới đã được cơng bố [125,18-24,34-36], fucoidan rong nâu ở Việt Nam cũng cĩ phổ 13C-NMR rất phức tạp với nhiều vùng tín hiệu trùng lặp lên nhau do trong phân tử của chúng được cấu tạo bởi các gốc đường fucose (C6H12O5) và hexose (C6H12O6) khác nhau, điều này rất khĩ để giải thích được một cách đầy đủ về cấu trúc của chúng. Tuy nhiên, trên phổ 13C-NMR của tất cả các phân đoạn fucoidan đều cĩ những đặc điểm chung đặc trưng cho cấu trúc của gốc α-L-Fucp đĩ là những tín hiệu mạnh xuất hiện trong vùng trường cao 15-18 ppm đặc trưng cho nhĩm metyl (CH3-) và các tín hiệu trong vùng trường thấp 97-102 ppm đặc trưng cho cacbon α-anomeric (C1) của gốc đường 1→3)-α-L-fucopyranose, vùng tín hiệu 67-86 ppm là vùng của cacbon C2-C5 của vịng pyranoid [23]. Bên cạnh đĩ, phổ
13
C-NMR cũng cho thấy sự cĩ mặt của gốc đường β-D-Galactose thơng qua các tín hiệu đặc trưng cho cacbon C6 khơng liên kết và cacbon C1 của gốc β-D-Galactose tương ứng ở độ dịch chuyển hĩa học trong vùng 61-62 ppm và 103-104 ppm [98]. Ngồi ra, các tín hiệu ở độ dịch chuyển hĩa học 20,9 ppm và vùng (173-175 ppm) trên phổ 13C-NMR của các phân đoạn SpF3 và SwF5 cịn chỉ ra sự cĩ mặt của nhĩm O-acetyl trong phân tử của hai loại fucoidan này.
Như vậy, qua phân tích phổ 13C-NMR chúng tơi thấy rằng các mẫu fucoidan nghiên cứu cĩ đặc trưng cấu trúc đúng như dự đốn từ kết quả phân tích thành phần monosacarit, chúng thuộc nhĩm sulfated galactofucan. Đặc trưng cấu trúc của các phân đoạn fucoidan này sẽ được nghiên cứu thêm bằng phân tích phổ 1H-NMR.
* Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR:
Kết quả đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của các mẫu phân đoạn fucoidan được trình bày trên hình 3.12 và phụ lục 3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các polysacarit nĩi chung và của fucoidan nĩi riêng đều hết sức phức tạp với độ phân giải khơng cao do cĩ rất nhiều pic trùng chập và chen lấn nhau. Vì vậy, rất khĩ để giải thích thỏa đáng các tín hiệu trên phổ 1H-NMR. Mặc dù vậy, cũng giống như các loại fucoidan đã được cơng bố trước đĩ, trên phổ proton 1H-NMR cĩ những tín hiệu cộng hưởng đặc trưng để nhận biết fucoidan, đĩ là các tín hiệu xuất hiện trong vùng anomeric (5,0-5,5 ppm) của H1 và ở vùng trường cao 1,2-1,5 ppm của proton H6 của vịng α-L-Fucopyranose [22-24].
Trên phổ 1H-NMR của fucoidan SdF3, các tín hiệu mạnh ở vùng trường cao 1,2 ppm thuộc về proton (H6) của nhĩm methyl và các tín hiệu ở 5,0-5,1 ppm là vùng tín hiệu đặc trưng của proton anomeric (H1) của vịng α-L-Fucpyranose liên
α-L-Fucp-C6
β-D-Gal-C6 α-L-Fucp C2-C5
β-D-Gal-C1
α-(1,3)-L-Fucp-C1
kết 1→3 [34]. Bên cạnh đĩ trên phổ 1H-NMR cũng xuất hiện các tín hiệu xác nhận sự cĩ mặt của gốc đường galactose thơng qua các tín hiệu ở độ dịch chuyển hĩa học 3,3 ppm và 5,3 ppm đặc trưng cho proton H6 và H1 của vịng β-D-Galactose. Ngồi ra, nhĩm tín hiệu ở 2,1 ppm cịn cho thấy sự cĩ mặt của nhĩm O-acetyl.
Tương tự như phổ của fucoidan SdF3, trên phổ 1H-NMR của fucoidan SwF5 xuất hiện các tín hiệu mạnh ở vùng trường cao 1,2-1,3 ppm đặc trưng cho proton nhĩm (CH3-) của vịng fucose và nhĩm tín hiệu ở 5,3-5,4 ppm đặc trưng cho proton (H1) của gốc α-L-Fucpyranose liên kết 1→3, nhĩm các tín hiệu nhỏ hơn ở 5,1-5,2 thuộc về proton (H1) của gốc α-L-Fucpyranose liên kết 1→4 [34]. Thành phần của gốc đường galactose trong phân tử fucoidan được xác nhận thơng qua các tín hiệu đặc trưng ở 5,3 ppm và 3,5 ppm của proton H1 và H6 của vịng β-D-galactose. Vùng tín hiệu nhỏ hơn ở 2,1-2,2 ppm đặc trưng cho proton CH3- của nhĩm O-acetyl, kết quả này cho thấy trong phân tử fucoidan SwF5 cĩ tồn tại gốc acetyl [23-24]. Kết
α-L-Fucp-H6 β -D -Gal p -H6 β-D-Galp-H1 α -(1,3) -L -F uc p -H 1 OAc(CH3)
Hình 3.12. Phổ 1H-NMR của phân đoạn SdF3 (Sargassum denticapum)
hợp với các dữ liệu thu được từ phân tích phổ hồng ngoại (bảng 3.9), ta cĩ thể đưa ra nhận xét về đặc trưng cấu trúc của fucoidan SwF5 gồm chủ yếu là liên kết (1→3)-α-L-Fucp và một phần liên kết (1→4)-α-L-Fucp, nhĩm sulfate ở vị trí C2 của vịng fucose chiếm ưu thế. So với cơng bố trước đĩ của tác giả [4] thì fucoidan của lồi rong này chỉ tồn tại kiểu cấu trúc là liên kết (1→3)-α-L-Fucp, tuy nhiên nhĩm sulfate ở vị trí C4 chiếm ưu thế và một phần ở vị trí C2. Các kết quả tương tự cũng đã được cơng bố về fucoidan của rong Fucus vesiculosus, sự khác biệt về đặc trưng cấu trúc của fucoidan cĩ thể được giải thích do ảnh hưởng của kỹ thuật chiết tách cũng như phương pháp phân tích cấu trúc khác nhau [101,103].
Phổ 1H-NMR của fucoidan phân đoạn SpF3 (Sargassum polycystum) cũng cho thấy những đặc điểm tương tự như phổ 1H-NMR của fucoidan từ Sargassum swartzii với 03 vùng tín hiệu đặc trưng của fucoidan với cấu tạo mạch chính là : thứ nhất là nhĩm tín hiệu mạnh ở vùng trường cao 1,2-1,5 ppm đặc trưng cho proton (H6) của nhĩm methyl vịng fucose, thứ hai là nhĩm tín hiệu ở vùng trường thấp 4,9-5,2 ppm đặc trưng cho proton (H1) của gốc (1→3)-α-L-Fucopyranose, thứ 3 là các tín hiệu ở δ = 2,1 ppm cho thấy sự cĩ mặt của nhĩm acetyl [23-27]. Gần đây đặc trưng cấu trúc của fucoidan từ lồi rong này cũng đã được cơng bố bởi Bilan và cộng sự [27] với bộ khung mạch chính được cấu tạo bởi các gốc (1→3)-α-L-Fucp, gốc đường (1→2)-β-D-Galp chèn vào sau mỗi 03 gốc liên kết (1→3)-α-L-Fucp, nhĩm sulfate chủ yếu ở vị trí C4 của cả gốc đường fucose và galactose.
Phổ 1H-NMR của fucoidan SmF3 (Sargassum mcclurei) cũng cho thấy những đặc điểm chung như fucoidan từ các lồi rong khác thuộc chi Sargssum đĩ là dạnh cấu trúc mạch chính được tạo nên bởi gốc α-L-Fucp liên kết 1→3, nhĩm sulfate ở vị trí C4 (bảng 3.9).
Tương tự như phổ 1H-NMR của các loại fucoidan khác thuộc chi Sargssum, phổ 1H-NMR của fucoidan ToF2 (Turbinaria ornata) gồm nhiều cụm tín hiệu chồng lấp lên nhau với độ phân giải rất kém nên việc cĩ thể giải thích chi tiết các tín hiệu trên phổ này là điều rất khĩ. Tuy nhiên, giống như nhiều fucoidan rong nâu khác, phổ 1H-NMR luơn xuất hiện những tín hiệu đặc trưng giúp ta nhận biết về fucoidan, đĩ là các tín ở 1,2-1,4 ppm (H6-nhĩm methyl) và 5,1-5,3 ppm (H1-
anomeric) của gốc 1→3)-α-L-Fucp. Các tín hiệu ở 5,3 ppm và 3,5 ppm đặc trưng cho proton H1 và H6 của gốc β-D-Galactose, ngồi ra tín hiệu ở 2,1-2,3 ppm cịn xác nhận sự cĩ mặt của nhĩm O-acetyl trong phân tử của fucoidan này. Kết hợp với các kết quả phân tích thành phần đường (bảng 3.6) và phân tích phổ hồng ngoại (bảng 3.9) chúng tơi đưa ra kết luận về đặc trưng cấu trúc của fucoidan phân đoạn ToF2 như sau: đây là loại sulfated galactofucan, cấu trúc mạch chính gồm các liên kết 1→3)-α-L-Fucp, nhĩm sulfate chủ yếu chiếm vị trí C2 của gốc fucose. Kết quả này cũng cho thấy sự phù hợp với cơng bố của tác giả [122] về đặc trưng cấu trúc của fucoidan khơng được phân đoạn tinh chế từ rong Turbinaria ornata với cấu tạo mạch chính là các liên kết 1→3)-α-L-Fucp, gốc 1→4)-β-D-Galp tồn tại ở mạnh nhánh, nhĩm sulfate chủ yếu ở vị trí C2 và một lượng nhỏ ở C4.
Kết luận:
Kết quả phân tích thành phần monosacarit và phân tích phổ (IR và NMR) của 05 loại fucoidan chiết tách từ rong nâu Việt Nam cho thấy fucoidan từ các lồi rong khác nhau cĩ thành phần đường đơn, mức độ sulfate hĩa, vị trí nhĩm sulfate trên các gốc đường cũng như cấu trúc mạch chính khác nhau. Fucoidan từ lồi rong
S.swartzii, S.denticapum và Turbinaria ornata là các galactofucan sulfate hĩa và acetyl hĩa một phần với mạch chính là →3)-α-L-Fucp-(1→, ở mạch nhánh hoặc xen kẽ trong mạch chính cĩ thể tồn tại gốc β-D-Galp và/hoặc liên kết →4)-α-L- Fucp-(1→. Nhĩm sulfate ở vị trí C-2 vịng fucose và/hoặc glactose chiếm ưu thế. Fucoidan từ rong S.polycystum là polysacarit dạng galactofucan sulfate hĩa cao và bị acetyl hĩa một phần với khung mạch chính là →3)-α-L-Fucp-(1→, ở mạch nhánh hoặc xen kẽ trong mạch chính cĩ thể tồn tại gốc β-D-Galp. Nhĩm sulfate chủ yếu ở vị trí C-4 của vịng fucose và/hoặc glactose. Trong khi đĩ fucoidan được chiết từ rong S.mcclurei cũng thuộc nhĩm galactofucan sulfate hĩa cao, mức độ sulfate hĩa là (35%) nhưng khơng bị acetyl hĩa như fucoidan từ S.swartzii, S.polycystum và
Turbinaria ornata, nhĩm sulfate chủ yếu chiếm vị trí C-4 của vịng fucose hoặc/và galactose. Fucoidan từ S.mcclurei cĩ cấu tạo mạch chính là →3)-α-L-Fucp-(1→ và một phần là liên kết →4)-α-L-Fucp-(1→ cũng như gốc β-D-Galactose cĩ thể tồn tại xen kẽ trong mạch chính hoặc ở mạch nhánh.
Như vậy, fucoidan của 05 lồi rong nâu Việt Nam đã phân tích ở trên đều thuộc nhĩm galactofucan sulfate hĩa với các dạng cấu trúc khơng đồng nhất và bị chẻ nhánh một cách ngẫu nhiên, đơi khi cịn bị acetyl hĩa. Trong thành phần các đường đơn tạo nên polymer fucoidan ngồi hai thành phần chính là fucose và galactose cịn tồn tại các đường đơn khác như mannose, xylose và glucsoe với hàm lượng nhỏ hơn. Những đặc điểm này tạo ra sự đa dạng cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của fucoidan, nhưng đồng thời cũng làm cho việc phân tích chi tiết cấu trúc của fucoidan trở nên vơ cùng phức tạp. Đĩ chính là lý do tại sao cho đến nay trên thế giới mới chỉ cĩ một vài cơng bố về cấu trúc hồn chỉnh của fucoidan, nhưng khơng một cơng bố nào đưa ra được mối liên hệ cĩ tính quy luật cho cấu trúc fucoidan với các bộ rong.
Do vậy, chúng tơi lựa chọn phân đoạn fucoidan SmF3 của rong S.mcclurei
để tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm cấu trúc. Vì đây là phân đoạn fucoidan cĩ hoạt tính gây độc tế bào tốt trên dịng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 và cĩ thành phần đơn giản nhất trong số các phân đoạn fucoidan cịn lại.