CHIẾT TÁCH TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI
Fucoidan phân đoạn SmF3 từ rong Sargassum mcclurei được lựa chọn để nghiên cứu cấu trúc vì đây là phân đoạn galactofucan sulfate hĩa cao và cĩ thành phần đơn giản nhất (chỉ gồm hai gốc đường fucose và galactose). Đồng thời
Sargassum mcclurei cũng là lồi rong nâu phổ biến ở nước ta, phân bố ở các tỉnh Đà Nẵng, Khánh Hịa, Ninh Thuận và Bình Thuận trong đĩ trữ lượng lớn nhất ở vùng biển Khánh Hịa [1,6-8].
Theo kết quả ở mục 3.3, phân đoạn SmF3 cĩ thành phần chính là fucose, galactose và sulfate (35%), tỉ lệ fucose:galactose ≈ 1:0,71, ngồi ra khơng chứa thêm các thành phần đường khác (bảng 3.5). Phổ FT-IR của phân đoạn SmF3 cũng như phổ hồng ngoại của các phân đoạn fucoidan rong nâu khác đã được mơ tả ở mục 3.5.1 giúp ta nhận biết sự cĩ mặt của nhĩm sulfate thơng qua các tín hiệu ở 1262,73 cm-1 (S=O) và 839,22 cm-1 (S-C-S) (hình 3.13), ngồi ra đỉnh hấp thụ ở số sĩng 839,22 cm-1 cịn cho biết vị trí nhĩm thế sulfate trong phân tử fucoidan SmF3
ở axial (C4) chiếm ưu thế. Tuy nhiên, dữ liệu phổ hồng ngoại chỉ cho biết thơng tin nhĩm sulfate ở vị trí axial (C4) hay equatorial (C2 hoặc C3) của vịng pyranose nĩi chung mà khơng phân biệt được nĩ thuộc vịng fucose hay galactose. Vì vậy, để giải quyết vấn đề này các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối sẽ tiếp tục được nghiên cứu.
Tương tự như nhiều fucoidan rong nâu tự nhiên khác, fucoidan SmF3 cĩ phổ
13
C-NMR rất phức tạp, nên việc giải thích chính xác các tín hiệu trên phổ này là rất khĩ. Một số tín hiệu chính trên phổ 13C-NMR của SmF3 cũng cho thấy là những tổ hợp nhiều tín hiệu chồng lấp lên nhau. Điều này chỉ ra sự đa dạng trong vị trí của các liên kết glycoside và/hoặc mơ hình sulfate hĩa kép trong phân tử fucoidan. Phổ
13
C-NMR của fucoidan tự nhiên phân đoạn SmF3 (hình 3.14) cĩ chứa một vài tín hiệu mạnh trong các vùng anomeric (96,0-100,4 ppm) và vùng trường cao (15,5- 17,7 ppm) đặc trưng cho C-1 và C-6 của vịng α-L-fucopyranose. Bên cạnh đĩ các tín hiệu ở 102,7 ppm, 61,7 và 67,0 ppm lần lượt đặc trưng cho cacbon C-1, C-6 tự do và C-6 cĩ liên kết của gốc β-D-galactose [98]. Tổ hợp phức tạp các tín hiệu ở
C-O-S S=O
67,8-85,0 ppm là của cacbon vịng pyranose C2-C5. Ngồi ra khơng phát hiện thấy các tín hiệu chứng tỏ sự cĩ mặt của các nhĩm acetat và axít uronic trong phân tử fucoidan SmF3.
Kết quả đo phổ 1H-NMR của phân đoạn fucoidan SmF3 (phụ lục 3) cũng tương tự như phổ của các fucoidan đã được cơng bố với nhiều vùng tín hiệu trùng lấp nhau, nên việc giải thích thỏa đáng các tín hiệu trên phổ này là điều khơng thể. Tuy nhiên, một phần thơng tin về đặc trưng cấu trúc của fucoidan vẫn cĩ thể thu nhận được từ phổ 1H-NMR thơng qua các tín hiệu đặc trưng của gốc đường fucose và galactose. Đĩ là các tín hiệu mạnh trong vùng trường cao 1,2-1,4 ppm của proton H6 (nhĩm methyl) và vùng 5,2-5,3 ppm thuộc về proton H1(α-anomeric) của gốc 1→3)-α-L-Fucp, tín hiệu nhỏ hơn ở 5,0 ppm là H1 của gốc 1→4)-α-L-Fucp. Bên cạnh đĩ, các tín hiệu đặc trưng cho proton H6 và H1 của gốc β-D-galactose được xác nhận thơng qua các tín hiệu ở độ dịch chuyển hĩa học 3,7 ppm và 5,4 ppm.
Hình 3.14: Phổ 13C-NMR của fucoidan- SmF3 từ rong nâu Sargassum mcclurei
α-L-Fucp-C6
β-D-Gal-C6 α-(1,3)-L-Fucp
β-D-Gal-C1
* Khử sulfate
Phương pháp khử sulfate được thực hiện nhằm mục đích làm đơn giản hĩa cấu trúc của fucoidan phân đoạn SmF3. Phổ 13C-NMR của fucoidan đề sulfate hĩa SmF3-DS (phụ lục 3) chứa một nhĩm lớn các tín hiệu trong vùng anomeric (96-104 ppm). Kết quả này cho thấy fucoidan SmF3 cĩ thể chứa một vài dạng liên kết khác nhau của các gốc đường fucose và galactose. Tín hiệu của pic ở 61,7 ppm đặc trưng cho cacbon C-6 khơng liên kết của gốc β-D-Galactose đã tăng lên một cách đáng kể sau khi thực hiện khử nhĩm sulfate, điều này chỉ ra rằng nhĩm sulfated cĩ mặt ở C-6 của một số gốc galactose.
Do fucoidan là một dạng polysacarit sulfate hĩa dị thể và bị phân nhánh, nên phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chúng thường rất phức tạp với nhiều cụm tín hiệu cĩ độ phân giải kém, dẫn đến việc phân tích kiểu liên kết giữa các gốc đường gặp nhiều khĩ khăn. Methyl hĩa là một trong những phương pháp phân tích rất hiệu quả để xác định vị trí liên kết giữa các gốc đường trong phân tử fucoidan [27].
* Phân tích liên kết bằng phương pháp methyl hĩa
Phương pháp methyl hĩa để phân tích liên kết glycoside đã được sử dụng rộng rãi trong phân tích liên kết các polysacarit fucoidan [12,35,80,96]. Trong phân tích cấu trúc của các polysacarit, phương pháp methyl hĩa khơng chỉ cho chúng ta biết về vị trí các liên kết giữa các monomer mà cịn cho biết những thơng tin dự đốn vị trí các liên kết của nhĩm thế sulfate trong phân tử của polysacarit [12]. Thành phần chính của fucoidan phân đoạn SmF3 là đường fucose và galactose (bảng 3.5) cùng với kết quả phân tích phổ hồng ngoại và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR) cho thấy fucoidan phân đoạn này cĩ thể tồn tại các kiểu liên kết (1,3)-α-L-Fucose và (1,6)-β-D-Galactose và/hoặc (1,2)-β-D-Galactose. Vì vậy, mục đích của phân tích liên kết glycoside sẽ giúp ta kiểm tra lại các thơng tin dự đốn trên.
Fucoidan sau khi đã khử nhĩm sulfate (SmF3-DS) được methyl hĩa bằng methyl iodua với sự cĩ mặt của NaOH trong DMSO [27]. Polysacarit methyl hĩa được thủy phân, khử mở vịng và acetyl hĩa, các dẫn xuất aditol acetacte được phân tích bằng GC-MS [24]. Dựa trên cơ sở xác định dạng và số lượng dẫn xuất methyl
ete của các gốc đường sau khi methyl hĩa các nhĩm hydroxy, chúng tơi thu được kết quả như trong bảng 3.10.
Kết quả bảng 3.10 cho thấy fucoidan SmF3 chứa chủ yếu các gốc fucose liên kết 3 (46%), một lượng ít hơn các gốc galactose liên kết 4 (18%), fucose liên kết 4 (12%) và galactose liên kết 6 (2%). Fucoidan SmF3 chứa fucose và galactose ở đầu cuối khơng khử và nĩ chỉ chứa gốc galactose liên kết (1→6) bị khử ở cuối mạch.
Việc phát hiện các gốc 3,4- và 2,4-di-O-methyl-galactitol cho thấy nhĩm sulfate ở vị trí C2/C3 và/hoặc C4 của galactose và/hoặc gốc galactose tồn tại ở mạch nhánh của fucoidan SmF3.
Bảng 3.10.Phân tích methyl hĩa của phân đoạn fucoidan đề sulfate hĩa SmDsF3. Thành phần các gốc đường (methylated
fucitol hoặc galactitol acetate)
mol %
Dạng liên kết
2,3,4-tri-O-methyl-fucitol 5 Fuc1→ 2,3-di-O-methyl-fucitol 12 →4Fuc1→ 2,4-di-O-methyl-fucitol 46 →3Fuc1→ 2,3,4,6-tetra-O-methyl-galactitol 8 Gal1→ 2,3,6-tri-O-methyl-galactitol 18 →4Gal1→ 2,3,4-tri-O-methyl-galactitol 2 →6Gal1→ 3,4-di-O-methyl-galactitol 1 →2,6Gal1→ 2,4-di-O-methyl-galactitol 2 →3,6Gal1→ 1,2,3,4-tetra-O-methyl-galactitol 6 →6Gal
Như vậy, bằng các phương pháp phân tích hĩa học và các phương pháp phân tích phổ IR, NMR chúng tơi đã xác định được thành phần monosacarit, kiểu liên kết glycoside giữa các gốc đường và vị trí nhĩm sulfate trong phân tử fucoidan SmF3. Từ đĩ đưa ra dự đốn về đặc trưng cấu trúc của fucoidan SmF3 như sau: mạch chính được tạo nên chủ yếu bởi gốc α-L-fucose-(1→3), ngồi ra trong thành phần
mạch chính hoặc mạch nhánh cịn chứa các gốc α-L-fucose-(1→4); galactose- (1→4) và galactose-(1→6). Nhĩm sulfate ở vị trí C2 và/hoặc C4 trên gốc đường fucose và galactose.
Để khẳng định lại cấu trúc dự đốn trên và xác định trật tự liên kết giữa các gốc đường trong phân tử fucoidan SmF3 chúng tơi tiến hành phân tích khối phổ nhiều lần (MALDI-TOF/MS/MS và ESI-MS/MS) của các oligofucoidan SmF3.
* Phổ khối của oligosacarit được điều chế bằng phương pháp tự thủy phân fucoidan SmF3
Để nghiên cứu chi tiết đặc trưng cấu trúc của fucoidan SmF3, chúng tơi tiến hành phân tích khối phổ nhiều lần của fucoidan-oligosacarit thu được bằng phương pháp tự thủy phân fucoidan SmF3 tự nhiên (autohydrolysis) [18] (mục 2.2.7). Hiệu suất của phân đoạn oligosacarit SmF3-AH đạt được là 85% so với SmF3. Kết quả phân tích thành phần monosacarit của phân đoạn này cho thấy hàm lượng (% mol) fucose chiếm 68,5%, hàm lượng galactose chiếm 31,5%, như vậy hàm lượng tương đối của galactose trong thành phần đường đơn của oligosacarit SmF3 (Fuc:Gal = 2:1) đã tăng lên so với polysacarit fucoidan SmF3 (Fuc:Gal = 3:2). Galactose chiếm hàm lượng cao trong hỗn hợp tự thủy được cho là vai trị cấu trúc của gốc đường này trong fucoidan SmF3 cĩ thể khác so với galactose trong fucoidan được chiết từ các lồi rong thuộc bộ Laminariales, galactose trong fucoidan của các lồi rong bộ
Laminariales cĩ thể tạo nên các đoạn mạch kéo dài [17,27,129]. Hơn nữa, hàm lượng galactose trong các phân đoạn trọng lượng phân tử thấp (low molecular weight-LMW) thu được từ các sản phẩm thủy phân của galactofucan từ Laminaria gurjanovae [114] và Costaria costata [17] khơng vượt quá 10% mol. Trong khi đĩ thành phần galactose trong phân đoạn trọng lượng phân tử cao thu được sau thủy phân (phần bền với quá trình tự thủy phân) của fucoidan từ các lồi rong
Laminariales thường chiếm hàm lượng lớn. Ngược lại, kết quả phân tích thành phần đường đơn của phân đoạn trọng lượng phân tử cao thu được sau quá trình tự thủy phân fucoidan SmF3 cho thấy hàm lượng galactose giảm (14,7%) và hàm lượng fucose tăng lên (85,3%). Kết quả này cho thấy fucoidan SmF3 khơng chứa các đoạn mạch dài được tạo nên chỉ bởi các gốc galactose, để chứng minh thêm cho dự đốn
này chúng tơi tiến hành phân tích khối phổ hai lần với chế độ ion âm (negative-ion tandem MS) của các đoạn mạch ngắn nhằm xác định trật tự của các liên kết đường trong phân tử fucoidan. Phổ khối của oligofucoidan SmF3-AH được đo theo hai phương pháp là MALDI-TOF/MS/MS và ESI-MS/MS. Kết quả phân tích phổ khối MALDI-TOF/MS của oligofucoidan SmF3-AH được trình bày trên hình 3.15, phổ khối ESI-MS (phụ lục 5).
Hình 3.15. Phổ khối MALDI-TOF chế độ ion âm của fucooligosacarit SmF3 từ rongSargassum mcclurei nhận được bằng tự thủy phân
Dựa vào các tài liệu đã cơng bố về nghiên cứu cấu trúc của oligosacarit fucoidan [17-20,124] và cơ chế phân mảnh theo quy tắc được đề xuất bởi Domon và Costello [47] chúng tơi đã tính tốn xác định được đặc trưng cấu trúc của các mảnh ion monosacarit và oligosacarit chính trên phổ MALDI-TOF/MS và ESI/MS như trình bày trong bảng 3.11. Kết quả đo khối phổ của hai phương pháp cho thấy thành phần các mảnh chính của hỗn hợp là monosulfated fucose ở m/z: 243,0. Theo kết quả phân tích hàm lượng sulfate trong bảng 3.5, fucoidan SmF3 cĩ mức độ sulfate hĩa cao (35%), nhưng cả hai phương pháp đều khơng phát hiện thấy gốc disulfated fucose trong hỗn hợp oligosacarit, trong khi đĩ fucan sulfate hĩa cao từ rong
Laminaria cichorioides cho kết quả ngược lại [19]. Tuy nhiên, các kết quả thu được trên cả hai phổ ESI/MS và MALDI/MS đều cĩ chứa một tập hợp các ion mảnh với tín hiệu mạnh như (m/z: 224,98; 387,09; 533,14; 695,15 và các mảnh ion khác) và lượng lớn các monosulfated fucooligosacarit (m/z: 389,10; 535,15; 681,16 và 827,13). Sự phân mảnh quá nhỏ, cùng với việc tách nhĩm sulfate cũng được phát hiện trong khi thu nhận oligosacarit từ 2,4-disulfated 3-linked α-L-fucan của rong
S. cichorioides [19]. Kết quả phân tích methyl hĩa (bảng 3.10) đã xác nhận được sự cĩ mặt của gốc 3-linked α-L-Fucp trong thành phần cấu tạo của fucoidan SmF3. Các kết quả phân tích phổ khối đã chỉ ra sự khác nhau của oligosacarit cĩ chứa fucan (thu được bằng tự thủy phân trong cùng điều kiện) với mạch chính được tạo nên bởi các các gốc Fucopyranose liên kết tuần tự α-(1→3)-/α-(1→4)- và ít bị sulfate hĩa. Đĩ là dạng liên kết α-(1→4)- thường bị thủy phân chậm hơn liên kết α- (1→3)- [18]. Trên phổ MALDI-TOF/MS (hình 3.15) và ESI-MS (phụ lục 5) cho thấy các thành phần của hỗn hợp tự thủy phân được tạo ra trong các nguồn ion hĩa ESI và MALDI khác nhau khơng đáng kể. Các mảnh ion được sulfate hĩa nhiều lần (lên tới 3 nhĩm sulfate trên phân tử) cịn lại trong phổ ESI-MS dễ dàng hơn trong MALDI/MS, trong phổ MALDI thường chỉ cĩ thể phát hiện thấy các mảnh ion sulfate hĩa bậc 2. Ngược lại, sulfated fucan của rong nâu Fucus evanescens dễ dàng sinh ra các oligosacarit sulfate hĩa mạnh (tới 5 nhĩm sulfate trên phân tử) khi đo bằng phương pháp MALDI-TOF/MS [18]. Vì vậy, sự khử sulfate quá mức cĩ khả năng là do ảnh hưởng của đặc trưng cấu trúc của các hợp phần hơn là yếu tố tác động do phương pháp ion hĩa của phổ khối tạo ra. Tuy nhiên, như đã biết phương pháp MALDI-TOF/MS thường được sử dụng cĩ hiệu quả tốt hơn khi phân tích các hỗn hợp phức tạp [60]. Như vậy, cĩ khả năng là do fucoidan SmF3 chứa cả hai gốc galactose và fucose sulfate hĩa cao, được sắp xếp gần các nhĩm sulfate về khơng gian, điều này dẫn đến đẩy mạnh sự phân mảnh/đề sulfate hĩa quá mức trong quá trình tự thủy phân và/hoặc trong nguồn ion của phổ khối. Để làm sáng tỏ thêm về nhận định này chúng tơi tiếp tục tiến hành phân tích khối phổ nhiều lần của các mảnh ion chính và các mảnh oligosacarit đặc trưng được tạo ra trong cả hai phương pháp phổ MALDI-TOF/MS và ESI-MS.
Bảng 3.11. Các đặc trưng cấu trúc của một số oligosacarit nhận được từ fucoidan SmF3 của rong S. mcclurei bằng tự thủy phân
m/z
MALDI [M* - Na]-
ESI [M - nNa]n−
Thành phần/đặc trưng cấu trúc của monosacarit và oligosacarit
243,00 243,016 Fuc(4 SO3−), Fuc(2 SO3−), Fuc(3 SO3−) - 259,012 Gal(4(6) SO3−), Gal(2 SO3−) 389,10 389,077 [Fuc2(SO3)]− 405,10 405,070 Gal(2 SO3−)-(1,3)-Fuc 491,04 234,0102- Fuc(2 SO3 − )-(1,3)-Fuc(2 SO3 − ) Fuc-(1,3)-Fuc(2,4 SO3−) Fuc(2 SO3−)-(1,4)-Fuc(2 SO3−) ** - 182,3233- Fuc(2 SO3−)-(1,4)-Fuc (2,3 SO3−) Fuc(2,4 SO3−)-(1,3)-Fuc ** - 187,6542- Gal(4/6,3 SO3−)-(1,3/4)-Fuc(2/3SO3−) Fuc(2,4 SO3 − )-(1,4)-Gal(2 SO3 − ) 507,03 242,008 Gal(2 SO3−)-(1,3)-Fuc(2 SO3−) Gal(2 SO3−)-(1,3)-Fuc(2 SO3−) ** 535,15 535,136 [Fuc3(SO3)]− - 231,007 [Fuc3(SO3)]3− 551,15 - Gal(2SO3−)-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc - 236.341 [Fuc2Gal(SO3)3]3− 653,05 315,0402- [Fuc2Gal(SO3Na)2 − Na]−
681,16 - [Fuc4(SO3)]−
697,15 - [Fuc3Gal(SO3)]−
783,04 380,0742- [Fuc4(SO3Na)2 − Na]− 799,03 388,0702- [Fuc3Gal(SO3Na)2 − Na]−
- 285,0283- Gal(2 SO3−)-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc(SO3−)-(1,3)-Fuc(SO3−) Gal(4/6,2 SO3−)-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc(2 SO3−) Fuc-(1,4)-Gal(3 SO3−)-(1,3)-Fuc(2 SO3−)-(1,3)-Fuc(2SO3−)
827,13 - [Fuc5(SO3)]−
843,12 - [Fuc4Gal(SO3)]−
859,10 - [Fuc3Gal2(SO3)]− 944,97 460,0942- [Fuc4Gal(SO3Na)2 - Na]−
960,95 - [Fuc(2SO3Na)-(1,4)-Gal-(1,3)-Fuc(2SO3Na)-(1,4)-Gal-(1,3)-Fuc - Na]- [Fuc(2SO3Na)-(1,4)-Gal(2SO3Na)-(1,3)-Fuc-(1,4)-Gal-(1,3)-Fuc - Na]- [Gal(2SO3Na)-(1,3)-Fuc(2SO3Na)-(1,4)-Gal-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc - Na]- [Gal(4SO3Na)-(1,3)-Fuc-(1,4)-Gal-(1,3)-Fuc(4SO3Na)-(1,3)-Fuc - Na]- - 339,0513- [Fuc3Gal2(SO3)3]3−
989,05 - [Fuc5Gal(SO3)−
1005,04 - [Fuc4Gal2(SO3)]− 1062,79 338,551 [Fuc3Gal2(SO3Na)3 - Na]- 1090,87 - [Fuc5Gal(SO3Na)2 − Na]− 1106,87 541,065 [Fuc4Gal2(SO3Na)2 − Na]−
*M: muối natri sulfate oligosacarit ** Các ion mảnh đặc trưng cho kiểu liên kết cĩ cường độ thấp
Bằng phương pháp khối phổ nhiều lần đo với chế độ ion âm sử dụng cả hai phương pháp ESI-MS/MS và MALDI-MS/MS, các đặc trưng cấu trúc của một số mảnh ion chính sẽ được làm sáng tỏ. Theo các tài liệu đã cơng bố về nghiên cứu cấu trúc của các oligosacarit từ carrageenan, glucosaminoglucans và fucoidan [12,61,60], cho thấy phổ ion sản phẩm của [M-Na]- thuộc về số lượng lớn các mảnh dạng B- và C- được sinh ra do phân cắt liên kết glycoside về phía đầu mạch khơng khử (danh pháp và cơ chế phân mảnh theo đề xuất bởi Domon và Costello [47]), trong khi đĩ mảnh dạng Y- được sinh ra do sự phân cắt liên kết glycoside về phía đầu mạch khử và chủ yếu xảy ra ở các gốc sulfate hĩa [138]. Kiểu phân mảnh xảy ra ở liên kết glycoside phù hợp với sự chuyển hydrogen thơng qua trung gian sulfate để tạo thành ion dạng B1- như đã được đề xuất trước đĩ bởi Saad và cộng sự [112]. Cơ chế phân mảnh này đã chứng minh cho nhận định rằng nếu gốc sulfate của oligosacarit gần hơn về khơng gian với liên kết glycoside, thì dễ xảy ra sự phân mảnh ở liên kết glycoside và tạo ra mảnh B1- . Các phương pháp hĩa học tính tốn và khối phổ ESI-MS/MS trên các gốc fucose sulfate hĩa ở vị trí C2 và C4 gần đây đã phát hiện ra là các ion mảnh 0,2X/0,2A chỉ được sinh ra khi nhĩm hydroxyl ở vị trí C3 khơng bị thế [124]. Như vậy, khi các oligosacarit bị thế hoặc/và cĩ liên kết ở vị trí C3 bị phân mảnh trong phổ CID ESI/MS/MS hoặc MALDI-TOF/MS/MS khơng thể xuất hiện sự phân mảnh phá vỡ vịng đường.
Trên phổ ion-âm ESI-MS/MS của mảnh monosulfated galactose [GalSO3]- ở m/z 259,02 (phụ lục 5) xuất hiện hai tín hiệu chính cĩ cường độ mạnh tương đương nhau ở số khối m/z 138,98 (0,2X) và m/z 198,99 (0,2A). Theo cơng bố của Tissot và cộng sự [124] mảnh m/z 138,98 (0,2X) đặc trưng cho vị trí nhĩm sulfate ở C-2,