1)- Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp của Likhitwitaywid và cộng sự, phương pháp này hiện đang được sử dụng tại Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia Mỹ [78] (thí nghiệm được thực hiện tại Viện Hĩa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam). Fucoidan được thử nghiệm gây độc trên các dịng tế bào ung thư của người như LU (ung thư phổi), Hep-G2 (ung thư gan), RD (ung thư màng tim) và MDA-MB-231 (ung thư vú).
Các dịng tế bào ung thư người được lấy từ Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia Mỹ (NCI) và hiện đang được lưu giữ tại Viện Hĩa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
Tế bào ung thư được giữ trong nitơ lỏng, khi sử dụng chúng được đánh thức và duy trì trong các mơi trường dinh dưỡng MEME hoặc DMME cĩ bổ sung thêm huyết thanh bê tươi 7-10%. Tế bào nuơi cấy cho phát triển tới mức 60-70%, thay mơi trường sạch để hoạt hĩa tế bào từ 18 đến 24 giờ, lúc đĩ tế bào đã sẵn sàng để sử dụng cho thí nghiệm.
Chuẩn bị mẫu thí nghiệm: Hịa mẫu thí nghiệm vào dung dịch DMSO 100% (4 mg/ml) cho bước sàng lọc sơ bộ. Pha 10 thang nồng độ cho bước 2 để tính giá trị IC50.
Chuẩn bị mẫu đối chứng: Pha chất chuẩn cĩ khả năng diệt tế bào (Elipitine hoặc Colchicine) trong DMSO với nồng độ 0,01 mM. Nhỏ vào mỗi giếng 10 μl mẫu.
Các bước tiến hành: Tế bào sau khi xử lý với Tripsin 0,1% được tách khỏi đáy bình. Pha lỗng dung dịch huyền phù tế bào bằng mơi trường sạch, rửa và đếm số lượng, pha dung dịch huyền phù tế bào nồng độ cỡ (4x104 tế bào/ml). Thêm vào
các giếng đã cĩ chất chuẩn bị sẵn ở trên 190 μl dung dịch huyền phù tế bào. Phiến được ủ trong tủ CO2 thêm 3 ngày.
Đọc kết quả: Tế bào sau khi ủ 3 ngày, được cố định bằng dung dịch TCA (trichlorua acetic axít ) lạnh (30-50%). Rửa, để khơ, nhuộm SRB 0,4% trong axít acetic 1% và rửa lại bằng axít acetic 1% để loại bỏ mẫu thừa, để khơ, hịa lại bằng dung dịch đệm Tris base 10 mM. Đọc trên máy ELISA ở bước sĩng 495 - 515 nm.
a. Sàng lọc sơ cấp tìm giá trị CS:
Giá trị CS (% Cell Survival) là khả năng sống sĩt của tế bào ở nồng độ nào đĩ mà chất thử tính theo % so với mẫu đối chứng. Mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% ở nồng độ mẫu 20 μg/ml đối với mẫu thơ và 4 μg/ml đối với mẫu tinh chế được đánh giá cĩ hoạt tính. Dựa trên các kết quả đo độ hấp thụ quang của chúng là OD (ngày 0), OD (DMSO 10 %) và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%)
Các mẫu cĩ biểu hiện hoạt tính (CS ≤ 50%) sẽ được chọn và tiếp tục tiến hành tìm giá trị IC50.
b. Tìm giá trị IC50:
Dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. Chất cĩ hoạt tính thì giá trị IC50 ≤ 20 μg/ml đối với chất thơ và ≤ 4 μg/ml đối với chất sạch.
2)- Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư theo phương pháp [121] (thực hiện tại Phịng Hĩa Enzyme, Viện Hĩa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương, Viện Hàn lâm Khoa học Nga, chi nhánh Viễn Đơng, Liên Bang Nga).
a. Nuối cấy tế bào
Dịng tế bào ung thư kết tràng người DLD-1 (ATCC # CCL-221TM) được phát triển như một lớp đơn trong mơi trường RPMi-1640 được bổ sung thêm 10% (v/v) FBS đã bất hoạt bằng nhiệt, 2 mM L-glutamine và 1% penicilin-streptomycin trong khơng khí được làm cho ẩm ướt chứa 5% CO2
b. Thử nghiệm gây độc tế bào
Để đánh giá độc tố tế bào, tế bào được nuơi cấy ở nồng độ (3x104 tế bào/ml) trong các đĩa 96 giếng trong 200 μl dung dịch 10% FBS RPMI-1640 ở 37oC trong
tủ ấm chứa 5% CO2. Sau 24h, mơi trường được chuyển và thay thế với mơi trường mới cĩ chứa fucoidan với các nồng độ khác nhau (50, 100, 200 μg/ml) và tế bào được ủ thêm 24h và 48h ở 37oC trong tủ ấm chứa 5% CO2. Sau khi ủ, 10 μl muối nội (thuốc thử MTS)3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxylphenyl)-2- (4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium được đưa vào từng giếng và tế bào được ủ thêm 4h ở 37oC và 5% CO2. Sau đĩ đo độ hấp thụ quang ở bước sĩng 490/630 nm.
c. Thử nghiệm gen dịng đơn tính (clonogenic) trên agar mềm
Phương pháp thử nghiệm trên mơi trường agar mềm được thực hiện sử dụng dịng tế bào ung thư ruột kết người (DLD-1). Cụ thể là, các tế bào (2,4 x 104 tế bào/ml) được xử lý với fucoidan (100 μg/ml) hoặc được kích hoạt và phát triển trong 1ml mơi trường agar cĩ chứa 0,3% BME (Basal Medium Eagle) và 10% FBS, như được mơ tả bởi Colburn và cộng sự [121]. Mơi trường nuơi cấy được giữ ở 37oC trong tủ ấm chứa 5% CO2 khoảng 3 tuần, các khuẩn lạc thu được, được đếm trên kính hiển vi sử dụng phần mềm máy tính ImageJ.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU
Với mục đích chiết tách fucoidan cho nghiên cứu hoạt tính sinh học và cấu trúc, fucoidan được chúng tơi chiết trong mơi trường axít lỗng, ở nhiệt độ 60oC, chiết lặp lại 3 lần để đảm bảo hiệu quả chiết fucoidan cao nhất [143]. Kết quả thu được hàm lượng fucoidan trong 08 lồi rong nâu thuộc 3 chi rong Sargassum, Padina và Turbinaria được trình bày trong bảng 3.1. Kết quả cho thấy hàm lượng fucoidan dao động từ 0,82 % (Sargassum swartzii) đến 2,57 % (Sargassum polycystum), hàm lượng fucoidan trong hai lồi rong Padina australis và Turbinaria ornata tương ứng là 1,93 % và 1,23 %. Như vậy, ta thấy hàm lượng fucoidan trong các lồi rong thuộc các chi khác nhau là khác nhau và trong cùng một chi (Sargassum) cũng khơng giống nhau. So với các kết quả về hàm lượng fucoidan đã được cơng bố trước đĩ của các lồi rong S.swartzii, S.oligocystum, S.denticapum, S.mcclurei, S.polycystum, Turbinaria ornata [5] lần lượt là 2,88 %, 3,92 %, 3,74 %, 3,56 %, 2,94 %, 4,22 % cĩ thể thấy hàm lượng fucoidan trong cùng một lồi rong cũng khác nhau, theo các tác giả [84,100,126] sự khác nhau về hàm lượng fucoidan trong các lồi rong này cĩ thể được giải thích là do sự khác nhau về thời gian thu rong, vị trí địa lý và phương pháp chiết. So với các lồi rong nâu thuộc họ
Sargassum của các nước khác trên thế giới như Mexico, Brazil, Nhật Bản, Ấn Độ, Trung Quốc,… hàm lượng fucoidan của rong nâu Việt Nam cao hơn so với lồi rong Sargassum stenophyllum (Brazil) 0,4 % [48] và các lồi rong Sargassum ringgoldianum 0,13 % [56], Sargassum thunbergii 0,88 % [39], Sargassum fusiformis cịn được gọi là Hizikia fusiformis 1,30 % [109]của Nhật Bản và thấp hơn các lồi rong, Sargassum myriocystum 5,34 %, Sargassum wightii 6,72 % (Ấn Độ) [50], Sargassum horneri 4,3 % (Mexico) [128].
Tĩm lại, sự khác biệt về hàm lượng fucoidan trong các lồi rong rất khĩ để đưa ra so sánh, bởi hàm lượng fucoidan thu được nhìn chung thay đổi rất nhiều (0,1-20%) phụ thuộc vào điều kiện địa lý, quá trình sinh trưởng và phát triển, cũng như phương pháp chiết tách để thu nhận fucoidan.
Bảng 3.1. Hàm lượng và thành phần monosacarit của fucoidan từ 08 lồi rong nâu Việt Nam
Thành phần đường đơn của fucoidan (mol %)
Stt Lồi rong Ký hiệu
mẫu fucoidan Hàm lượng fucoidan %*
Fuc Man Gal Xyl Glc
SO42- % w/w** Axít uronic % w/w 1 S.swartzii SwF 0,82 35,8 19,2 32,3 9,9 2,8 20,40 14,28 2 S.oligocystum SoF 1,78 42,3 8,9 38,3 7,1 3,4 22,46 21,54 3 S.denticapum SdF 2,00 40,1 15,9 38,7 5,3 nd 25,69 21,20 4 S.mcclurei SmF 2,37 38,5 4,2 33,1 3,6 20,6 33,15 17,87 5 S.polycystum SpF 2,57 42,4 12,6 23,5 1,3 10,2 25,60 23,74 6 S.binderi SbF 1,13 42,2 10,3 38,0 9,5 nd 21,47 5,35 7 T.ornata ToF 1,23 55,8 9,2 24,8 9,0 1,2 25,30 7,50
8 Padina australis PaF 1,93 47,1 2,5 22,3 11,5 16,6 21,90 21,02
* Hàm lượng tính theo khối lượng rong khơ đã loại chất béo
** Hàm lượng tính theo khối lượng của fucoidan; nd: khơng phát hiện thấy
Gần đây cĩ rất nhiều cơng trình cơng bố về hoạt tính sinh học hết sức cĩ giá trị của fucoidan [48,70,69,93,98,123]. Vì vậy, để tìm hiểu các đặc trưng cấu trúc và hoạt tính của fucoidan trong các lồi rong nâu của Việt Nam nhằm mục đích tìm kiếm những hoạt chất mới cĩ khả năng ứng dụng làm thực phẩm chức năng và dược liệu chúng tơi tiến hành phân tích thành phần hĩa học, đặc trưng cấu trúc và khảo sát một số hoạt tính sinh học của chúng.
3.2. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA FUCOIDAN
Phân tích xác định thành phần của các monosacarit là việc quan trọng đầu tiên trong nghiên cứu cấu trúc của các polysacarit nĩi chung và của fucoidan nĩi riêng.
Fucoidan là một polymer dị thể cĩ thành phần hĩa học phức tạp, ngồi hai thành phần chính là fucose và sulfate, chúng cịn chứa các đường đơn khác như galactose, mannose, xylose, glucose,... và uronic axít [69]. Vì vậy, để xác định thành phần hĩa học của fucoidan chúng tơi tiến hành thủy phân fucoidan thành các monomer trong mơi trường axít. Việc thủy phân hồn tồn để xác định thành phần các đường đơn của fucoidan trên thực tế rất khĩ xảy ra, do đĩ chúng tơi tiến hành xác định tỉ lệ mol giữa các gốc đường đã được thủy phân và dựa vào tổng carbohydrate để tính thành phần của mỗi đường đơn trong mẫu fucoidan. Sắc ký đồ của các mẫu đường chuẩn được trình bày trên hình 3.1. Kết quả phân tích thành phần monosacarit, hàm lượng sulfate và uronic axít của các mẫu fucoidan được trình bày trên bảng 3.1
Kết quả bảng 3.1 cho thấy fucose chiếm hàm lượng đáng kể từ 35,8-55,8 % trong tất cả các mẫu fucoidan, trong đĩ hàm lượng fucose cao nhất là fucoidan chiết từ rong Turbinaria ornata (55,8%) và thấp nhất là fucoidan chiết từ rong S.swartzii
(35,8%). Hàm lượng galactose của fucoidan chiết từ các lồi rong thuộc chi
Sargassum chiếm tỉ lệ gần bằng hàm lượng fucose, ngoại trừ fucoidan chiết từ rong
S.polycystum cĩ tỉ lệ fucose : galactose = 2 : 1. Trong khi đĩ, các mẫu fucoidan chiết từ hai chi rong khác là Turbinaria ornata và Padina australis cũng giống như fucoidan của lồi rong S.polycystum cĩhàm lượng galactose gần bằng một nửa so với fucose. Ngồi hai thành phần chính là fucose và galactose, tất cả các mẫu fucoidan của 08 lồi rong nghiên cứu đều cĩ thêm các đường đơn khác với hàm lượng nhỏ hơn là mannose (2,5-19,2%), xylose (1,3-11,5%) và glucose (0-20,6%). Hàm lượng các gốc đường này biến đổi theo từng chi rong và từng lồi rong khác nhau, tuy nhiên trong cùng chi rong chúng biến đổi khơng nhiều. Các kết quả này cũng hồn tồn phù hợp với các cơng bố trước đĩ về sự đa dạng của thành phần hĩa học của fucoidan [5, 69]. Bên cạnh thành phần là các gốc đường, trong phân tử của fucoidan cịn chứa các gốc sulfate và axít uronic. Hàm lượng sulfate của các mẫu fucoidan khác nhau khơng nhiều (bảng 3.1), dao động trong khoảng 20,40-33,15% so với lượng mẫu phân tích, trong đĩ lớn nhất là fucoidan của rong S.mcclurei
đã cơng bố về mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và các đặc điểm cấu trúc của fucoidan như thành phần đường đơn, kiểu liên kết giữa các gốc đường, hàm lượng và vị trí nhĩm sulfate trên các gốc đường,... trong đĩ hàm lượng các gốc sulfate và vị trí của chúng trên các gốc đường là những yếu tố cĩ ảnh hưởng quan trọng nhất lên hoạt tính sinh học của fucoidan [34,38,69].
So với fucoidan chiết từ các lồi rong nâu khác trên thế giới như Nga, Nhật Bản, Hàn Quốc,... [23,24,48,92,129,142] thì fucoidan chiết từ rong nâu Việt Nam cĩ sự khác biệt lớn về thành phần các đường đơn. Đĩ là hàm lượng fucose thấp hơn và hàm lượng uronic axít cao hơn. Fucoidan phân lập từ rong Turbinaria ornata cĩ hàm lượng fucose cao nhất là 55,8%, trong khi đĩ fucoidan phân lập từ một số lồi rong nâu của vùng Viễn Đơng, L.B.Nga cĩ hàm lượng fucose cao hơn rất nhiều như fucoidan chiết tách từ rong Fucus evanescens, Laminaria japonica và Laminaria cichorioides cĩ hàm lượng fucose lần lượt là 88%, 86% và 100% [142], hay fucoidan chiết từ rong Hizikia fusiformis (Nhật Bản) hàm lượng fucose chiếm 80% [109], fucoidan của từ rong Sargassum stenophyllum (Brasil) hàm lượng fucose chiếm 67,8%, hiện nay loại fucoidan duy nhất được bán thương mại bởi hãng hĩa chất Sigma (Mỹ) được chiết từ rong Fucus vesiculosus cĩ hàm lượng fucose chiếm 100% [69]. Điều này cho thấy sự đa dạng về thành phần hĩa học của fucoidan trong các lồi rong khác nhau, thậm chí là trong cùng một chi rong Sargassum của Việt Nam và của Brasil cũng cĩ thành phần rất khác nhau. Nhìn chung fucoidan của rong nâu sinh trưởng ở vùng biển ơn đới thường cĩ thành phần đường tương đối đơn giản, chúng hầu như chỉ cĩ một gốc đường fucose và một lượng rất nhỏ các đường đơn khác [23-25,42,142]. Trong khi đĩ fucoidan của rong nâu ở biển nhiệt đới nĩi chung và biển Việt Nam nĩi riêng phần lớn thuộc nhĩm galactofucan, trong thành phần chủ yếu chứa hai gốc đường fucose và galactose cùng với một lượng nhỏ các gốc đường khác như rhamnose, xylose, mannose, glucose, … [27,48,55,56,72,96,110,122]. Sự khác nhau về thành phần và hàm lượng các đường đơn của fucoidan từ các lồi rong khác nhau một lần nữa khẳng định rằng điều kiện mơi trường cĩ ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp polysacarit của rong nâu.
Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đường đơn chuẩn
Fucoidan chiết từ hai lồi rong S.denticapum và S.binderi cĩ tỉ lệ các gốc đường fucose/galactose/mannose/xylose gần giống nhau và khơng cĩ gốc đường glucose trong phân tử điều này cĩ thể dự đốn về khung monosacarit trong hai loại fucoidan này là giống nhau, các mẫu fucoidan đều cĩ chứa đồng thời cả 5 gốc đường với các tỉ lệ khác nhauchứng tỏ các fucoidan này cĩ cấu trúc rất phức tạp và độ lặp lại khơng cao. Theo cách phân loại mới nhất về fucoidan thì các mẫu fucoidan này được gọi là fucogalactose sulfate [69,98,109]. Do sự phức tạp trong thành phần cũng như cấu trúc, nên việc xác định các đặc trưng cấu trúc của fucoidan là hết sức khĩ khăn. Phân đoạn tinh chế fucoidan là một bước quan trọng làm đơn giản hĩa việc phân tích các đặc trưng cấu của chúng.
3.3. TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN
05 loại fucoidan được phân lập từ các lồi rong Sargassum swartzii, Sargassum mcclurei, Sargassum polycystum, Sargassum denticapum và Turbinaria ornata được chúng tơi lựa chọn để tiến hành phân đoạn và phân tích các đặc trưng
cấu trúc của chúng. Vì đây là những lồi rong phổ biến, cĩ trữ lượng lớn và cĩ khả năng khai thác ở quy mơ cơng nghiệp.
Kết quả phân đoạn tinh chế các mẫu fucoidan bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose (3,2x32 cm) (hình 2.1) được chỉ ra trên hình 3.2-hình 3.6.
Bảng 3.2. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong
S.denticapum thu được bằng sắc ký trao đổi anion
Thành phần monosacarit , mol% Phân đoạn fucoidan Hàm lượng (%)* Tổng carbohydrate (%)* SO42- (%)*
Fuc Man Gal Xyl Glc SdF1-0,5 М NaCl 17,2 48,04 23,67 38,6 22,1 24,6 14,7 nd SdF2-1,0 М NaCl 45,7 54,12 27,64 48,6 12,8 28,2 10,4 nd SdF3-1,5 М NaCl 15,3 54,09 39,14 51,9 5,8 33,4 8,9 nd
*: tính theo khối lượng mẫu fucoidan
nd: khơng phát hiện thấy
Kết quả phân đoạn fucoidan của rong S.denticapum trên hình 3.2 cho thấy cĩ 03 phân đoạn SdF1, SdF2 và SdF3 được tách ra theo các gradient nồng độ muối NaCl khác nhau tương ứng là 0,5M; 1,0M và 1,5M. Hàm lượng mỗi phân đoạn
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 V, ml D O , 4 9 0 n m 0 0,5 1 1,5 2 N a C l, M SdF1 SdF2 SdF3 Hình 3.2. Phân đoạn fucoidan được chiết từ rong S.denticapum
bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose
được tính theo khối lượng mẫu fucoidan đưa lên cột tách, trong đĩ phân đoạn cao nhất là SdF2 chiếm 45,7% và thấp nhất là phân đoạn SdF3 15,3%. Kết quả phân tích thành phần hĩa học của các phân đoạn này (bảng 3.2) cho thấy cả 03 phân đoạn đều chứa 4 gốc đường đơn là fucose, mannose, galactose, xylose với các tỉ lệ khác nhau trong đĩ fucose chiếm hàm lượng cao nhất trong thành phần của cả 3 phân đoạn, chúng dao động trong khoảng 38,6-51,9% cao nhất là phân đoạn SdF3 (51,9%) và thấp nhất là phân đoạn SdF1 (38,6%), các gốc đường rhamnose và