PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN
05 loại fucoidan được phân lập từ các lồi rong Sargassum swartzii, Sargassum mcclurei, Sargassum polycystum, Sargassum denticapum và Turbinaria ornata được chúng tơi lựa chọn để tiến hành phân đoạn và phân tích các đặc trưng
cấu trúc của chúng. Vì đây là những lồi rong phổ biến, cĩ trữ lượng lớn và cĩ khả năng khai thác ở quy mơ cơng nghiệp.
Kết quả phân đoạn tinh chế các mẫu fucoidan bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose (3,2x32 cm) (hình 2.1) được chỉ ra trên hình 3.2-hình 3.6.
Bảng 3.2. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong
S.denticapum thu được bằng sắc ký trao đổi anion
Thành phần monosacarit , mol% Phân đoạn fucoidan Hàm lượng (%)* Tổng carbohydrate (%)* SO42- (%)*
Fuc Man Gal Xyl Glc SdF1-0,5 М NaCl 17,2 48,04 23,67 38,6 22,1 24,6 14,7 nd SdF2-1,0 М NaCl 45,7 54,12 27,64 48,6 12,8 28,2 10,4 nd SdF3-1,5 М NaCl 15,3 54,09 39,14 51,9 5,8 33,4 8,9 nd
*: tính theo khối lượng mẫu fucoidan
nd: khơng phát hiện thấy
Kết quả phân đoạn fucoidan của rong S.denticapum trên hình 3.2 cho thấy cĩ 03 phân đoạn SdF1, SdF2 và SdF3 được tách ra theo các gradient nồng độ muối NaCl khác nhau tương ứng là 0,5M; 1,0M và 1,5M. Hàm lượng mỗi phân đoạn
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 V, ml D O , 4 9 0 n m 0 0,5 1 1,5 2 N a C l, M SdF1 SdF2 SdF3 Hình 3.2. Phân đoạn fucoidan được chiết từ rong S.denticapum
bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose
được tính theo khối lượng mẫu fucoidan đưa lên cột tách, trong đĩ phân đoạn cao nhất là SdF2 chiếm 45,7% và thấp nhất là phân đoạn SdF3 15,3%. Kết quả phân tích thành phần hĩa học của các phân đoạn này (bảng 3.2) cho thấy cả 03 phân đoạn đều chứa 4 gốc đường đơn là fucose, mannose, galactose, xylose với các tỉ lệ khác nhau trong đĩ fucose chiếm hàm lượng cao nhất trong thành phần của cả 3 phân đoạn, chúng dao động trong khoảng 38,6-51,9% cao nhất là phân đoạn SdF3 (51,9%) và thấp nhất là phân đoạn SdF1 (38,6%), các gốc đường rhamnose và glucose khơng được phát hiện thấy trong các phân đoạn của loại fucoidan này, hàm lượng mannose và xylose giảm dần từ phần đoạn SdF1 đến SdF3. Hàm lượng sulfate tăng dần từ phân đoạn SdF1 đến SdF3 chúng dao động từ 23,67% - 39,14% điều này cĩ thể được giải thích là do hàm lượng sulfate càng lớn thì khả năng liên kết với nhựa trao đổi anion DEAE-Cellulose (Diethylaminoethyl-cellulose) càng mạnh, nên để giải phĩng phân đoạn fucoidan này cần dung dịch rửa giải cĩ nồng độ muối cao hơn. Với kết quả này, ta thấy fucoidan của rong S.denticapum cĩ thể tồn tại 03 loại cấu trúc khác nhau, phân đoạn SdF3 chứa lượng lớn sulfate, fucose, galactose và một lượng nhỏ hơn mannose, xylose phân đoạn này được gọi là sulfate galactofucan. Hai phân đoạn SdF1 và SdF2 ngồi 2 thành phần chính là sulfate và fucose, chúng cịn chứa một hàm lượng đáng kể galactose, mannose và xylose nên cĩ thể gọi với tên chung là fucoidan.
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 V, ml D O , 4 9 0 n m 0 0,5 1 1,5 2 N a C l, M SwF1 SwF2 SwF3 SwF4 SwF5 Hình 3.3. Phân đoạn fucoidan được chiết từ rong S.swartzii
bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose
Kết quả tách phân đoạn fucoidan từ rong S.swartzii (hình 3.3) ta thấy cĩ 05 phân đoạn SwF1, SwF2, SwF3, SwF4 và SwF5 được tách ra với các nồng độ rửa giải khác nhau của muối NaCl lần lượt là 0,5M; 0,8M; 1,0M; 1,2M và 1,5M. So với kết quả 03 phân đoạn thu được của fucoidan từ rong S.denticapum cĩ thể thấy mỗi lồi rong khác nhau sẽ tổng hợp lên các loại fucoidan với nhiều dạng cấu trúc khác nhau. Các phân đoạn fucoidan được tách ra bằng sắc ký trao đổi anion chủ yếu phụ thuộc vào mật độ nhĩm mang điện tích (nhĩm sulfate). Chính vì lý do này mà các phân đoạn fucoidan từ mỗi lồi rong khác nhau sẽ được rửa giải ra ở các nồng độ muối NaCl khác nhau.
Bảng 3.3. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong
S.swartzii thu được bằng sắc ký trao đổi anion
Thành phần monosacarit , mol% Phân đoạn fucoidan Hàm
lượng (%)
SO42-
(%)
Fuc Man Gal Xyl Rham Glc
SwF1-0,5 М NaCl 2,0 5,6 nd nd nd nd nd nd SwF2-0,8 М NaCl 20,2 14,6 49,5 4,7 29,4 2,7 2,7 3,0 SwF3-1,0 М NaCl 33,3 18,4 56,0 3,0 28,9 1,9 1,9 3,2 SwF4-1,2 М NaCl 26,2 28,0 55,6 3,6 27,9 2,4 3,3 2,8 SwF5-1,5 М NaCl 16,0 42,3 57,1 4,0 27,4 0,9 2,0 2,0
Hàm lượng và thành phần hĩa học của các phân đoạn fucoidan rong
S.swartzii được trình bày trong bảng 3.3. Kết quả cho thấy hàm lượng của các phân đoạn fucoidan SwF1-SwF5 dao động từ 2,0-33,3%, trong đĩ cao nhất là phân đoạn SwF3 (33,3%) và thấp nhất là phân đoạn SwF1 (2,0%). Với 05 phân đoạn thu được sau khi tách sắc ký cho thấy khả năng rong nâu S.swartzii sinh tổng hợp nên 5 loại fucoidan khác nhau, kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đĩ đã được cơng bố cho lồi rong này của tác giả (Nguyễn Duy Nhất) [5]. Kết quả phân tích thành phần hĩa học (bảng 3.3) cho thấy thành phần đường đơn chính của các
phân đoạn là fucose (4,95-57,1 %) tăng dần từ phân đoạn SwF2 đến SwF5 và galactose giảm dần tỉ lệ nghịch với chiều tăng của fucose từ (27,4-29,4%), riêng phân đoạn SwF1 do hàm lượng thu được rất thấp (2%) nên chúng tơi khơng tiến hành phân tích thành phần hĩa học của phân đoạn này. Hàm lượng sulfate cũng tăng dần từ phân đoạn SwF2 đến SwF5 (14,6-42,3%). Phân đoạn SwF5 được rửa giải với nồng độ muối NaCl (1,5M) cĩ hàm lượng sulfate 42,3% cao hơn rất nhiều so với phân đoạn được rửa giải với cùng nồng độ muối NaCl của fucoidan phân lập từ rong S.swartzii đã được cơng bố trước đĩ của tác giả (Nguyễn Duy Nhất, Luận án Tiến sĩ) hàm lượng sulfate chỉ đạt 25,24% [5]. Điều này cĩ thể được giải thích là do sự khác nhau về phương pháp phân đoạn cũng như phương pháp chiết tách. Chúng tơi tiến hành tách phân đoạn fucoidan trên cột sắc ký trao đổi anion DEAE- Cellulose, trong khi đĩ tác giả Nguyễn Duy Nhất đã sử dụng phương pháp tách phân đoạn bằng nhựa lỏng Cetavlon, sự khác nhau này cũng tương tự với các lồi rong khác của thế giới đã cơng bố trước đĩ [21,55,101,103].
Như vậy, thành phần của các phân đoạn của fucoidan được phân lập từ rong nâu S.swartzii tồn tại đồng thời cả 6 gốc đường với các tỉ lệ mol khác nhau chứng tỏ fucoidan này cĩ cấu trúc rất phức tạp, độ lặp lại khơng cao. Điều này sẽ gây ra nhiều khĩ khăn cho việc phân tích cấu trúc chi tiết của chúng.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 100 200 300 400 500 600 700 V, ml A , 4 9 0 n m 0 0,5 1 1,5 2 N a C l, M SpF1 SpF2 SpF3 Hình 3.4. Phân đoạn fucoidan được chiết từ rong S.polycystum
bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose
Với fucoidan được chiết từ rong nâu S.polycystum, kết quả tách phân đoạn cho ra 03 phân đoạn SpF1, SpF2 và SpF3 tương ứng với nồng độ tăng dần của dung dịch rửa giải muối NaCl lần lượt là 0,5M; 1,0M và 1,5M (hình 3.4). Kết quả phân tích thành phần đường và hiệu suất thu các phân đoạn được đưa ra trong bảng 3.4. Phân đoạn SpF2 đạt hiệu suất cao nhất chiếm (42,3%) và thấp nhất là phân đoạn SpF1 (18,3%). Kết quả phân tích thành phần đường cho thấy cĩ sự khác biệt rất lớn trong tỉ lệ thành phần các đường đơn giữa 03 phân đoạn, với phân đoạn SpF1 hàm lượng fucose (28,0%) và mannose (26,7%) gần tương đương nhau và chiến tỉ lệ gấp 2 lần so với hàm lượng của galactose (12,7%), xylose (11,3%) và rhamnose (13,1%), hàm lượng glucose thấp nhất (8,2%). Với phân đoạn SpF2 hàm lượng fucose và galactose cao hơn gấp 2 lần so với phân đoạn SpF1 lần lượt là 59,2% và 26,6%, hai thành phần mannose và xylose chỉ chiếm một lượng nhỏ, trong khi đĩ glucose khơng được tìm thấy trong phân đoạn này. Phân đoạn SpF3 cĩ thành phần monosacarit đơn giản hơn nhiều so với hai phân đoạn SpF1 và SpF2, ngồi fucose và glactose là hai thành phần chính với tỉ lệ fucose : glactose = 2 : 1 thành phần đường đơn cịn lại là xylose chỉ chiếm 4,5%, các gốc đường đơn khác như mannose, rhamnose và xylose khơng tồn tại trong phân đoạn fucoidan này. Tương tự như các phân đoạn fucoidan từ các lồi rong S.denticapum và S.swartzii, hàm lượng sulfate trong các phân đoạn của fucoidan từ rong nâu S.polycystum cũng tăng dần (tăng tuyến tính với nồng độ của dung dịch rửa giải NaCl) từ phân đoạn SpF1 đến SpF2 (20,11 - 33,9 %) (bảng 3.4).
Bảng 3.4: Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong
S.polycystum thu được bằng sắc ký trao đổi anion
Thành phần monosacarit của fucoidan, mol % Phân đoạn fucoidan Hàm lượng (%) Tổng carbohydrate (%) SO42- (%)
Fuc Man Gal Xyl Rham Glc SpF1-0,5 М NaCl 18,3 56,43 20,11 28,0 26,7 12,7 11,3 13,1 8,2 SpF2-1,0 М NaCl 43,2 59,15 25,67 59,2 6,0 26,6 0,2 8,0 nd SpF3-1,5 М NaCl 21,0 54,97 33,99 68,6 nd 26,9 4,5 nd nd
Như vậy, với 03 phân đoạn thu được bằng tách sắc ký và kết quả phân tích thành phần đường cho thấy fucoidan được phân lập từ lồi rong nâu S.polycystum
cĩ thể tồn tại 3 dạng cấu trúc với bộ khung monosacarit rất khác nhau. So với kết quả đã được cơng bố về fucoidan của lồi rong này, Bilan và cộng sự đã thu nhận được 04 phân đoạn fucoidan khi tách trên cột DEAE-Sephacel [27]. Theo nhĩm tác giả này, thành phần đường của các phân đoạn của fucoidan rong S.polycystum khơng chứa gốc đường rhamnose, trong khi đĩ thành phần của hai phân đoạn SpF1 và SpF2 đã phân tích ở trên gốc đường rhamnose chiếm từ 8,0-13,1%. Tuy nhiên, tỉ lệ thành phần giữa các gốc đường cũng như hàm lượng sulfate trong phân đoạn F4 cĩ sự tương đồng so với phân đoạn SpF3. Phân đoạn F4 ngồi fucose và galactose là hai thành phần chính với tỉ lệ fucose : galactose ≈ 2 : 1, chỉ cịn lại hàm lượng rất nhỏ đường xylose. Hàm lượng sulfate chiếm 33,70% so với 33,99% trong phân đoạn SpF3.
Sự khác nhau về kết quả tách phân đoạn cũng như thành phần của các phân đoạn fucoidan rong S.polycystum so với cơng bố [27] cĩ thể được giải thích do sự khác nhau về vị trí và thời gian thu mẫu, cũng như phương pháp chiết tách và phân tích thành phần đường của fucoidan. Tác giả Bilan và cộng sự tiến hành chiết rong trong dung mơi chứa 2% CaCl2 ở 85oC để thu nhận fucoidan, thành phần đường của chúng được phân tích bằng phương pháp GC sau khi thủy phân và aditol hĩa. Trong khi đĩ fucoidan được chúng tơi thu nhận bằng cách chiết rong trong dung mơi axít HCl lỗng ở 60oC, thành phần đường của chúng được phân tích bằng phương pháp HPLC. Các kết quả tương tự cũng đã được cơng bố với fucoidan chiết từ các lồi rong nâu khác trên thế giới [101,125].
Fucoidan từ rong nâu S. mcclurei được tách phân đoạn bằng sắc ký trên cột trao đổi anion DEAE-MacroPrep (Diethylaminoethyl-MacroPrep) (hình 3.5) 03 phân đoạn fucoidan SmF1, SmF2 và SmF3 được thu nhận tương ứng với các nồng độ rửa giải của muối NaCl là 0,8M; 1,2M va 1,6M; về bản chất khơng cĩ sự khác nhau giữa loại nhựa này so với nhựa trao đổi anion DEAE-cellulose với chung tâm hoạt động là nhĩm amin mang điện tích dương (+1). Sự khác nhau về nồng độ dung dịch rửa giải muối NaCl so với các phân đoạn fucoidan từ rong S.denticapum,
S.swartzii và S.polycystum như đã được giải thích ở trên cĩ thể là do sự khác nhau về đặc điểm cấu trúc của mỗi loại fucoidan. Kết quả phân tích hàm lượng và thành phần hĩa học của các phân đoạn SmF1, SmF2 và SmF3 được đưa ra trong bảng 3.5. Hàm lượng của phân đoạn SmF1 là 8,4%, phân đoạn SmF2 chiếm 18,2% và phân đoạn SmF3 là 10,5%. Kết quả phân tích thành phần đường trong bảng 3.5 cho thấy hàm lượng fucose và galactose tăng dần theo nồng độ muối rửa giải NaCl, ngược lại các gốc đường mannose, xylose, glucose hàm lượng giảm dần và khơng xuất hiện trong phân đoạn SmF3. Tỉ lệ phần trăm mol của các gốc đường trong các phân đoạn cũng rất khác nhau, nhưng đều cĩ đặc điểm chung là hàm lượng fucose và galactose là hai thành phần chiếm hàm lượng chủ yếu và đây cũng là đặc điểm chung của fucoidan rong nâu Việt Nam [5,27,122]. Phân đoạn SmF1 và SmF2 cĩ thành phần đường đơn phức tạp hơn khi trong phân tử cĩ chứa đồng thời cả 05 gốc đường khác nhau, hàm lượng sulfate tương ứng là 16,8 và 25,7% điều này cho thấy mức độ phức tạp trong cấu trúc của các phân đoạn fucoidan này. Phân đoạn SmF3 cĩ thành phần đường đơn giản nhất khi chỉ chứa hai gốc đường là fucose (58,5%) và galactose (41,5%), hàm lượng sulfate (35%) với thành phần như vậy nĩ được xếp vào nhĩm galactofucan sulfate hĩa cao.
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 V (ml) A 4 9 0 n m 0 0,5 1 1,5 2 N a C l, M SmF1 SmF2 SmF3 Hình 3.5. Phân đoạn fucoidan được chiết từ rong S.mcclurei
bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-Macroprep
Bảng 3.5. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong
S.mcclurei thu được bằng sắc ký trao đổi anion
Thành phần monosacarit, (% mol)
Phân đoạn fucoidan - NaCl Hàm lượng (%)* Tổng carbohydrate (%)* SO42- (%)*
Fuc Man Gal Xyl Gluc SmF1-(0,8M NaCl) 8,4 44,65 16,8 27,2 34,0 19,6 6,4 12,8 SmF2-(1,2M NaCl) 18,2 64,59 25,7 44,8 5,4 34,1 5,3 10,4
SmF3-(1,6M NaCl) 10,5 55,62 35,0 58,5 nd 41,5 nd nd
* % tính theo trọng lượng của mẫu fucoidan * nd: khơng phát hiện thấy
Kết quả tách phân đoạn fucoidan của rong Turbinaria ornata trên cột sắc ký trao đổi anion DEAE-cellulose 04 phân đoạn ToF1, ToF2, ToF3 và ToF4 được thu nhận tương ứng với các nồng độ giải hấp của muối NaCl là 1,15M, 1,25M, 1,50M và 1,80M (hình 3.6), kết quả này cho thấy fucoidan từ lồi rong này tồn tại các kiểu cấu trúc rất khác so với fucoidan từ các lồi rong S.denticapum, S.polycystum, S.mcclurei và S.swartzi thuộc chi rong Sargassum. Kết quả phân tích hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan này được đưa ra trong bảng 3.6.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 100 200 300 400 500 600 700 800 V, ml A , 4 9 0 n m 0 0,5 1 1,5 2 N a C l, N ToF1 ToF2 ToF3 ToF4 Hình 3.6. Phân đoạn fucoidan được chiết từ rong Turbinaria ornata bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose
Bảng 3.6. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong
Turbinaria ornata thu được bằng sắc ký trao đổi anion
Thành phần monosacarit , mol%
Phân đoạn fucoidan Hàm lượng
(%)
SO42-
(%)
Fuc Man Gal Rham ToF1-1,15 М NaCl 6,6 23,87 71,9 4,5 23,6 nd ToF2-1,25 М NaCl 29,7 43,26 69,6 nd 27,7 2,7 ToF3-1,50 М NaCl 10,3 38,75 82,1 2,4 9,4 6,1 ToF4-1,80 М NaCl 18,4 32.36 75,6 2,9 18,8 2,7
Kết quả cho bảng 3.6 cho thấy hàm lượng của các phân đoạn fucoidan ToF1- ToF4 dao động trong khoảng từ 6,6-29,7 %, trong đĩ cao nhất là phân đoạn ToF2 chiếm 29,7%, thấp nhất là phân đoạn ToF1 (6,6%), hai phân đoạn ToF3 và ToF4 lần lượt chiếm 10,3% và 18,4%. Kết quả phân tích thành phần đường cho thấy, tất cả các phân đoạn của fucoidan rong Turbinaria ornata đều cĩ hàm lượng fucose rất lớn dao động từ 69,6% (ToF2) đến 82,1% (ToF3), hàm lượng galactose dao động từ 9,4% (ToF3) đến 27,7% (ToF2) và chỉ chứa một hàm lượng nhỏ các gốc đường mannose và rhamnose, đặc biệt các gốc đường xylose và glucose khơng cĩ mặt trong tất cả các phân đoạn fucoidan của lồi rong này. Hàm lượng rhamnose lớn nhất ở phân đoạn ToF3 (6,1%) và nhỏ nhất ở hai phân đoạn ToF2 và ToF4 cùng chiếm 2,7%, rhamnose khơng cĩ trong phân đoạn ToF1. Hàm lượng mannose lớn nhất trong phân đoạn ToF1 (4,5%) và nhỏ nhất trong phân đoạn ToF3 (2,4%), phân đoạn ToF2 khơng tồn tại gốc đường này. Hàm lượng sulfate tăng dần từ phân đoạn ToF1 đến ToF2, dao động trong khoảng 23,87% - 43,26%. Như vậy, các phân đoạn fucoidan của rong nâu Turbinaria ornata với thành phần đường chính là fucose và