Phổ khối là kỹ thuật phân tích dựa trên việc xác định số khối của các phân tử hoặc các mảnh phân tử mang điện tích. Nĩ là một trong những phương pháp quan trọng trong phân tích cấu trúc của các polysacarit. Việc ứng dụng các phương pháp phân tích khối phổ hiện đại trong phân tích cấu trúc của hợp chất carbohydrate phức tạp đã dẫn đến những tiến bộ nhanh chĩng trong lĩnh vực khoa học sự sống suốt hai thập kỷ qua của thế kỷ 21. Các kỹ thuật ion hĩa truyền thống như: ion hĩa bằng va chạm điện tử, ion hĩa hĩa học,… là những kỹ thuật ion hĩa chỉ sử dụng được cho các hợp chất dễ bay hơi. Các kỹ thuật ion hĩa mới như: bắn phá nguyên tử nhanh (fast atom bombardment-FAB), ion hĩa phun mù điện tử (electrospray ionization- ESI) và gần đây là kỹ thuật ion hĩa phản hập thụ laser được hỗ trợ bởi chất nền (matrix-assisted laser desorption ionization-MALDI) đã được phát triển để ứng dụng phân tích cấu trúc của các hợp chất khơng bay hơi như các oligosacarit, các hợp chất polysacarit trọng lượng phân tử nhỏ, protein, glycoprotein và các glycolipid. Các kỹ thuật ion hĩa mới cĩ khả năng ứng dụng phân tích được nhiều hợp chất hơn với độ nhạy và độ chính xác khối cao hơn các kỹ thuật ion hĩa truyền thống. Hiện nay, cấu trúc của nhiều hợp chất polymer sinh học phức tạp đã được phân tích thành cơng nhờ ứng dụng các kỹ thuật phân tích khối phổ hiện đại này [17-20,32,42,53,60,86,124,138,141].
a. Kỹ thuật ESI (ElectroSpray Ionization - ion hĩa phun mù điện tử): trong kỹ thuật phun mù điện tử, dung dịch cĩ chứa phân tử mẫu được phun ra khỏi đầu của mao quản mảnh vào buồng nhiệt ở áp suất giảm (gần bằng áp suất khí quyển). Mao quản mà dung dịch mẫu đi qua cĩ điện thế cao dọc theo bề mặt của nĩ và những giọt nhỏ tích điện được tách ra, đi vào buồng ion hĩa. Các giọt tích điện nhập
với dịng khí khơ (thường là khí nitơ), làm bay hơi các phân tử dung mơi ra khỏi giọt mẫu. Do vậy, mật độ điện tích của mỗi giọt tăng lên cho đến khi lực đẩy tĩnh điện trội hơn sức căng bề mặt (giới hạn Rayleigh), làm cho các giọt mẫu bị vỡ ra thành các giọt nhỏ hơn. Quá trình này tiếp tục cho đến khi các ion mẫu khơng cịn dung mơi ở lại trong pha khí.
b. MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionization):Kỹ thuật MALDI sử dụng các chất nền hỗ trợ để ion hĩa mẫu dưới tác dụng của năng lượng laser lớn. Trong kỹ thuật này, mẫu cần phân tích được hịa tan hay phân tán trong một chất nền (mạng lưới) được đặt trên đường đi của chùm photon cĩ cường độ cao. Hầu hết các máy MALDI đều sử dụng nguồn laser nitơ phát xạ ở 337 nm, cĩ một số ứng dụng sử dụng nguồn laser hồng ngoại (laser IR) để phân tích trực tiếp các mẫu chứa trong gel hay trong bản sắc ký lớp mỏng. Sự va chạm của các photon với mẫu sẽ ion hĩa một vài phân tử mẫu và tách chúng ra khỏi bề mặt với chất nền (mạng lưới- matrix). Các ion bị tách ra sau đĩ được tăng tốc về phía bộ phận phân tích khối lượng (hình 1.11). Các hợp chất nền được sử dụng trong MALDI được chọn để sao cho chúng cĩ khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại từ xung laser nitơ (337 nm). Các hợp chất của axít nicotinic, picolinic, 2,5-Dihydroxybenzoic,… thường được sử dụng làm chất nền. Chất nền hấp thu phần lớn năng lượng từ xung laser, do vậy cho phép tạo ra các ion mẫu nguyên vẹn được tách ra khỏi mạng lưới chất nền. Phép đo phổ MALDI-MS dùng để phân tích một khoảng rộng trọng lượng phân tử, từ polymer với trọng lượng phân tử vài ngàn dalton (Da) cho tới các oligosacarit, oligonucleotit và polypeptit, kháng thể và các protein nhỏ với trọng lượng phân tử vào khoảng 300.000 Da. Hơn nữa, kỹ thuật MALDI địi hỏi chỉ vài femtomol mẫu chất (1.10-15 mol).
Cho đến nay một số cấu trúc của oligo-fucoidan đã được xác định bằng phương pháp khối phổ [5,17-20,141]. Với những đoạn mạch ngắn, cĩ thành phần monosacarit và nhĩm sulfate đã biết thì việc xác định trật tự liên kết giữa các gốc đường, số nhĩm sulfate trên mỗi gốc đường hầu như cĩ thể giải quyết được bằng phương pháp khối phổ. Trong phương pháp khối phổ người ta thường sử dụng hai chế độ đo khác nhau cho mục đích phân tích cấu trúc của polysacarit là chế độ ion dương (Positive mode) và chế độ ion âm (Negative mode). Với chế độ ion dương mức năng lượng chủ yếu đủ để cắt đứt các liên kết đường và hạn chế khơng phá vỡ nĩ thành các mảnh nhỏ hơn, chế độ đo này được sử dụng để xác định thành phần và trật tự các liên kết đường [61]. Trong khi đĩ chế độ ion âm với mức năng lượng lớn hơn để phá vỡ các vịng đường, được sử dụng để xác định vị trí nhĩm sulfate trên các gốc đường. Cơ chế phân mảnh carbohydrate và hệ thống danh pháp các ion mảnh được đề xuất bởi Domon và Costello (hình 1.12) [47].
Hình 1.12. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate * Cơ chế phân mảnh trong khối phổ:
Các ion mảnh cĩ chứa đầu cuối khơng khử được miêu tả bởi các chữ cái viết hoa đầu tiên trong hệ thống bảng chữ cái alphabet (A, B, C,…).
Các ion mảnh cĩ chứa đầu cuối khử của oligosacarit hoặc aglycon được miêu tả bởi các chữ cái từ cuối bảng hệ thống chữ cái alphabet (X, Y, Z,…).
R O O O H OH OH CH2OH O O OH OH CH2OH O O OH OH CH2OH Y2 Z2 1.5X1 Y1 Z1 Y0 Z0 0.2 A1 B1 C1 2.4A2 B2 C2 2.5A3 B3 C3 Đầu khử Đầu khơng khử
Các ion dạng A và X được sinh ra bởi sự phân mảnh cắt ngang vịng đường và ký hiệu phía trên bên trái của ion được quy định theo số mỗi liên kết vịng và được tính theo chiều kim đồng hồ như được miêu tả trên hình 1.12.
Các ion được sinh ra từ sự phân cắt lần lượt các gốc đường được ký hiệu là Am, Bm, Cm với m = 1 tính từ phía đầu khơng khử và Xn, Yn, Zn với n = 1 được tính từ phía đầu khử.
Y0 và Z0 được quy ước cho sự phân mảnh của liên kết được liên kết với aglycone.
* Các đặc trưng phân mảnh: Theo hệ thống danh pháp, quy tắc sau đây được áp dụng chung cho sự phân mảnh của các oligosacarit:
Ở sự phân cắt liên kết glycoside sinh ra các ion Bn, Cn, Yn, Zn dễ xảy ra ở mức năng lượng thấp và đây là sự phân mảnh phổ biến nhất, chúng biểu lộ chi tiết về trình tự và sự phân nhánh của các hợp phần monosacarit.
Sự phân cắt ngang vịng đường thường xảy ra bởi sự va chạm ở mức năng lượng cao hơn. Sự phân mảnh này mang đến những thơng tin về kiểu liên kết.
Các dẫn xuất cĩ mang nhĩm methyl tạo ra phổ mang nhiều thơng tin nhất, sự phân tách cũng đặc trưng hơn và các tín hiệu cũng phong phú hơn. Thêm nữa, mức độ bẻ gẫy liên kết phức tạp trong trường hợp này là thấp. Các oligosacarit cĩ chứa nhĩm methyl cĩ thể tăng độ nhạy lên gấp 10 lần. Các ion thường được quan sát thấy ở dạng [M+Na]+
Việc phân tích các carbohydrate khơng được chuyển hĩa cho ra kết quả phổ phức tạp hơn, trường hợp này được thực hiện khi khối lượng mẫu bị hạn chế.
Các gốc đường chứa nhĩm sulfate thường bị cắt đến monomer trước khi vịng đường bị phá vỡ. Theo Tissot và cộng sự, vị trí nhĩm sulfate cĩ ảnh hưởng đến sự phân mảnh cắt ngang vịng đường. Tùy theo vị trí các gốc sulfate trong vịng đường chiếm vị trí C-2, C-3 hoặc C-4 sẽ xuất hiện một số mảnh đặc trưng tương ứng. Cơ chế phân mảnh các gốc đường xảy ra như trình bày trên hình 1.13. Các mảnh đặc trưng được sinh ra do sự phân mảnh cắt vịng fucose sulfate được thể hiện trong bảng 1.4 [124].
Bảng 1.4. Các mảnh đặc trưng cho các sulfate fucose cĩ nhĩm sulfate ở các vị trí khác nhau trong phổ khối dạng ion âm
Vị trí sulfate 0,2 A 0,3A 0,4A 0,2X 0,3X 0,4X 2-O- 103 73 43 139 169 199 3-O- 183 73 43 59 169 199 4-O- 183 153 43 59 89 199 n,m
A, n,mX: cắt theo liên kết n,m của vịng đường như hình 1.13
● Trong trường hợp cĩ mặt của ion kim loại, các oligosacarit sẽ phân mảnh theo các cơ chế sau (hình 1.14) [60].
H O O OSO3 O H O H C H3 H OH O OSO3 O O H C H3 OH O O H C H3 H O OSO-3 O O O- H O OH O O O H C H3 S O OH O O H C H3 HSO-4 O OH OH O H O3SO C H3 H OH O OH O O3SO C H3 OH O O3SO C H3 H O OH
Hình 1.13. Sơ đồ phân mảnh của fucose sulfate
0,2
X m/z 139
m/z 183
c. Các phương pháp phân tích khối
Vai trị của bộ phận phân tích khối là phân tách hỗn hợp ion sinh ra bởi bộ phận ion hĩa thành từng loại riêng biệt theo số khối m/z để đưa các ion này đến detector. Cĩ 05 kỹ thuật phân tích khối chính là: Tứ cực (Quadrupol-Q), Bẫy ion (Ion Trap-IT), Thời gian bay (Time of Flight-TOF), Cung từ (Magnetic Sector), Cộng hưởng bằng gia tốc ion biến đổi Fourie (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance-FT-ICR). Trong đĩ hai phương pháp phân tích khối chủ yếu được sử dụng trong phân tích cấu trúc của polymer và các hợp chất cĩ khối lượng phân tử lớn là IT và TOF
* Phương pháp bẫy ion (Ion trap):
Hệ phân tích khối gồm 3 điện cực: điện cực xuyến và hai điện cực đáy cĩ biên dạng hyperbol. Điện cực ở giữa là điện cực xuyến được đặt điện áp dao động chính là 730 Hz dùng để tạo hố thế 2 chiều để ion đi vào và chuyển động ở tâm của Trap. Hai điện cực đáy cĩ tần số bổ sung cĩ tác dụng cơ lập ion, phân rã ion bằng va chạm (CID) và phĩng ion theo cộng hưởng phi tuyến. Khí He được đưa vào bên trong Trap cĩ tác dụng đệm cho chuyển động của ion trong quá trình bẫy ion, CID và phân giải khối. Ion Trap cĩ khả năng tích lũy các ion, phân tích khối, phân lập ion và phân rã ion bằng va chạm do vậy đây là phương tiện rất thuận lợi cho việc nghiên cứu cơ chế phân mảnh.
Hình 1.14. Cơ chế phân mảnh oligosacarit với sự cĩ mặt của ion kim loại
MÊt ion kim lo¹i
Ph©n c¾t vßng
* Phương pháp thời gian bay (Time of Flight-TOF):
Bộ phân tích khối lượng theo thời gian bay (TOF) dựa trên ý tưởng đơn giản là tốc độ của hai ion được tạo ra trong cùng thời điểm với động năng như nhau sẽ thay đổi phụ thuộc vào khối lượng của các ion: Ion nhẹ hơn sẽ cĩ tốc độ cao hơn và chuyển động về phía detector của phổ kế nhanh hơn, chạm tới detector sớm hơn. Sự phân tách ion trong bộ phân tích TOF dựa theo nguyên lí là các ion cĩ năng lượng ban đầu như nhau sẽ cĩ tốc độ tỉ lệ với giá trị m/z của chúng. Phổ kế TOF hiện nay được sử dụng rất phổ biến. Vì thời gian giữa các xung ion ở nguồn ion cĩ thể điều chỉnh theo mong muốn, nên các thiết bị TOF cĩ thể phân tích các ion cĩ giá trị m/z hầu như bất kì. Khi ghép với nguồn ion hĩa sung laser như MALDI, phổ kế TOF cĩ các ứng dụng phổ biến trong phân tích cấu trúc của các oligosacarit, protein, các mảnh DNA, các phân tử sinh học và các polymer với khối lượng cỡ kDa.
Tĩm lại: Phân tích cấu trúc của oligosacarit bao gồm xác định thành phần monosacarit, kiểu liên kết, mơ hình phân nhánh và trật tự liên kết giữa các gốc đường. Vì vậy, khơng cĩ phương pháp khối phổ duy nhất nào cĩ thể giúp xác định được tất cả các thơng số trên. Tuy nhiên, phổ khối kết hợp với một số phương pháp khác cĩ thể giúp phân tích thành cơng cấu trúc của các oligosacarit phức tạp.